馮倩 王琳 蔡忠貞

摘要 [目的]以分離獲得的一株黃絲藻ENN172（Tribonema sp.）為材料，優(yōu)化異養(yǎng)培養(yǎng)工藝，提高脂肪酸產(chǎn)量。[方法]研究黃絲藻ENN172在1 g/L初始接種濃度黑暗培養(yǎng)時(shí)，不同葡萄糖濃度、不同氮源NaNO3、酵母提取物、蛋白胨、尿素以及NaCl濃度對(duì)細(xì)胞生物量和脂肪酸含量的影響。[結(jié)果]葡萄糖20 g/L時(shí)生物量最高但脂肪酸含量最低，隨濃度增加，生長速率下降，脂肪酸含量增加，綜合比較，30 g/L時(shí)脂肪酸產(chǎn)量最高。蛋白胨1 g/L培養(yǎng)10 d時(shí)，生物量達(dá)到對(duì)照組的2.3倍，脂肪酸產(chǎn)量是對(duì)照的2.1倍。添加2 g/L酵母提取物培養(yǎng)10 d時(shí)，生物量達(dá)到對(duì)照的1.7倍，脂肪酸產(chǎn)量是對(duì)照組的1.6倍。蛋白胨和酵母提取物對(duì)ENN172生物量及脂肪酸產(chǎn)量均有促進(jìn)作用，添加硝酸鈉和尿素對(duì)脂肪酸產(chǎn)量無顯著促進(jìn)。NaCl 10 g/L時(shí)在第6天脂肪酸含量達(dá)到最大27.03%（與初始相比提高3.4倍），添加NaCl可促進(jìn)脂肪酸積累但不利于生物量增加。[結(jié)論]通過優(yōu)化脂肪酸生產(chǎn)條件，葡萄糖30 g/L為低氮條件最佳誘導(dǎo)濃度，蛋白胨和酵母提取物可以作為脂肪酸生產(chǎn)優(yōu)選氮源，在誘導(dǎo)期添加NaCl利于提高脂肪酸含量。綜上結(jié)果，黃絲藻作為新型能源微藻具有一定異養(yǎng)生產(chǎn)脂肪酸的能力，深入優(yōu)化培養(yǎng)條件仍有上升空間，有望成為微藻產(chǎn)業(yè)化養(yǎng)殖的潛力藻株。

關(guān)鍵詞 黃絲藻;異養(yǎng);氮源;鹽度;脂肪酸

中圖分類號(hào) Q 939.97 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）12-0098-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.12.027

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract [Objective] A strain of Tribonema sp. was used as a material to optimize the heterotrophic culture process and increase the yield of fatty acids.[Method] The effect of the concentration of glucose， different nitrogen sources including sodium nitrate， yeast extract， peptone， urea and sodium chloride on coded as ENN172 in this research was examined. The initial culture concentration was kept at 1 g/L for all experiments. [Result]The highest biomass production and the lowest fatty acid content was obtained with the glucose concentration at 20 g/L. The biomass production decreased and fatty acid content increased with the increasing of glucose concentration， with the fatty acid content reaching the highest at 30 g/L of glucose.The addition of 1 g/L peptone and 2 g/L yeast extract increased the biomass significantly， with the biomass reaching 2.3 and 1.7 times， respectively， compared to that of the control in 10 days. However， there was no effect identified by introducing sodium nitrate and urea to the culture.The lipid content peaked at 27.03% （3.4 times）of the dried biomass in 6 days with sodium chloride concentration at 10g/L while the biomass production was suppressed as expected. [Conclusion] Overall， the optimized condition for lipid production is by keeping glucose at 30 g/L and nitrogen at a very low condition （1.5 g/L of NaNO3）. In addition， peptone and yeast extract can be used as a nitrogen source， and sodium chloride was an effective way to generate high lipid concentration biomass when needed. In conclusion， this particular Tribonema strain is capable of producing lipid with heterotrophic culture， which has the potential to be used as a commercial strain.

Key words Tribonema sp.;Heterotrophic;Nitrogen source;Salinity;Fatty acid

目前，有關(guān)微藻的研究主要集中在小球藻屬（Chlorella spp.）、柵藻屬（Scenedesmus spp.）和杜氏鹽藻屬（Dunaliella spp.）等單細(xì)胞微藻中，但這些藻類在培養(yǎng)過程中不僅難以收獲，而且還容易遭受原生動(dòng)物的吞食[1-2]。自然界中存在許多絲狀藻類，隸屬于不同的門類，如綠藻門、黃藻門和藍(lán)藻門等[3]。黃絲藻（Tribonema sp.）隸屬于黃藻綱、黃絲藻屬，普遍分布于淡水環(huán)境中，共有27種，我國有16種，2變種[4]。絲狀藻類中，螺旋藻（Spirulina sp.）應(yīng)用較為普遍，具有生長快、蛋白含量高和抗污染等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于保健品和食品行業(yè)[5]。黃絲藻可以在沒有絮凝劑的條件下進(jìn)行過濾收獲，收獲率高達(dá)98.69%[6]，且Wang等[2，6]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞尺寸較大的藻類能夠很好地抵抗原生動(dòng)物的吞食。一些黃絲藻具有良好的氮、磷吸收能力，常應(yīng)用在污水處理中[7-8]。目前，有關(guān)黃絲藻的研究大多基于生態(tài)治理方面，而對(duì)其資源利用的報(bào)道相對(duì)較少。新奧科技有限公司生物質(zhì)能技術(shù)中心自主分離獲得一株黃絲藻ENN172，具有生長速度快、易穩(wěn)定培養(yǎng)、易收獲等優(yōu)點(diǎn)，且富含不飽和脂肪酸EPA（二十二碳五烯酸）、多糖等。人體缺少合成EPA的酶系統(tǒng)，自身不能合成EPA，只能通過從外界攝取來滿足自身需求[9-10]。EPA對(duì)嬰幼兒大腦發(fā)育有明顯的促進(jìn)作用，且能夠預(yù)防和治療人類多種疾病[11]。藻多糖對(duì)正常細(xì)胞無毒副作用，對(duì)防止癌癥、降低血糖血脂具有獨(dú)特效應(yīng)，已成為開發(fā)新藥特藥的主要方向之一[12]。探索黃絲藻培養(yǎng)及脂肪酸誘導(dǎo)方式，實(shí)現(xiàn)生物質(zhì)與脂肪酸更高更快積累，將為其大規(guī)模培養(yǎng)提供有力保障。

目前，微藻的大規(guī)模商業(yè)化培養(yǎng)主要限于在光生物反應(yīng)器中進(jìn)行，具有占地面積大、生產(chǎn)周期長、藻類生長密度較低等缺陷，變相增加了生產(chǎn)的成本，限制了微藻培養(yǎng)的規(guī)?；l(fā)展。尋找一種高密度、低成本培養(yǎng)微藻的方法，對(duì)微藻培養(yǎng)產(chǎn)業(yè)化的進(jìn)一步發(fā)展極為重要。1953年，Lewin[13]首先發(fā)現(xiàn)了一些藻類能利用有機(jī)物作為唯一碳源和能源進(jìn)行異養(yǎng)生長，由此拉開了微藻異養(yǎng)培養(yǎng)研究的序幕。利用工業(yè)發(fā)酵方法異養(yǎng)培養(yǎng)微藻，可以節(jié)省空間，提高產(chǎn)量，避免雜藻和細(xì)菌的污染，且培養(yǎng)條件容易控制，是微藻大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)展趨勢，國內(nèi)外對(duì)此的研究也越來越多。

而黃絲藻異養(yǎng)培養(yǎng)積累脂肪酸的研究很少。Wang等[14]研究5種黃絲藻自養(yǎng)、異養(yǎng)和混養(yǎng)條件下的脂肪酸積累情況發(fā)現(xiàn)，異養(yǎng)和混養(yǎng)時(shí)脂肪酸都有較高的產(chǎn)量。 Zhou 等[15]優(yōu)化了黃絲藻的異養(yǎng)培養(yǎng)條件，在葡萄糖和尿素培養(yǎng)時(shí)，最大生物質(zhì)濃度達(dá)30.8 g/L，脂肪酸產(chǎn)量30.8 mg/（L·d）;其中異養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)葡萄糖濃度、氮源種類對(duì)脂肪酸影響較大。另據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，鹽度對(duì)藻類脂肪酸積累也有不同程度的影響[16]。因此，該研究對(duì)黃絲藻異養(yǎng)碳源、氮源和鹽度對(duì)其脂肪酸積累速度和含量進(jìn)行了探索，為黃絲藻快速應(yīng)用提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藻種。新奧科技發(fā)展有限公司生物質(zhì)能技術(shù)中心自主分離的一株黃絲藻，編號(hào)ENN172，保藏于內(nèi)部藻種庫。

1.1.2 主要試劑。BG11培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分：NaNO3 ?1.5 g/L，K2HPO4 0.04 g/L，MgSO4·7H2O 0.075 g/L，CaCl2·2H2O 0.036 g/L，NaHCO3 1 g/L，Citric acid 0.006 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 12 mg/L、A5微量元素液1 mg/L。葡萄糖，蛋白胨，酵母提取物，尿素。其他試劑均為常規(guī)分析試劑。

1.1.3 主要儀器。電子天平（梅特勒 SI114）;恒溫電熱鼓風(fēng)干燥箱（GZX-9140MBE）;上海博迅;家用電冰箱（BCD238f /X1）;高壓滅菌鍋（上海鼎謙生物科技 MJ-54A）;無菌工作臺(tái)（SW-CJ-1FD）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 藻細(xì)胞培養(yǎng)。

異養(yǎng)藻種預(yù)培養(yǎng)：以淡水微藻常用的BG11 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加10 g/L葡萄糖作為異養(yǎng)黃絲藻培養(yǎng)基，在250 mL玻璃三角瓶裝液量100 mL，后在無菌工作臺(tái)內(nèi)接種少量活化的黃絲藻進(jìn)行初級(jí)異養(yǎng)藻種擴(kuò)培;后將初級(jí)藻種接種至300 mL上述培養(yǎng)基中進(jìn)行二級(jí)藻種擴(kuò)培;藻種擴(kuò)培中使用的培養(yǎng)基及玻璃器皿均高壓滅菌。

1.2.2 不同葡萄糖濃度培養(yǎng)。

將黃絲藻二級(jí)藻種用300目絹篩過濾清洗，獲得濃縮藻絲后加入無菌水稀釋待用，標(biāo)記為初始藻液。取等量初始藻液用絹篩過濾濃縮后分別加入不同葡萄糖濃度的700 mL BG11培養(yǎng)基中溶解，記為試驗(yàn)藻液。糖濃度分別為20、30、40、60 g/L，后將各試驗(yàn)藻液分為6份，每份100 mL接種至200 mL三角瓶。置于搖床中25 ℃、140 r/min黑暗培養(yǎng)，分別于第6、第8、第10天每組各取出2瓶，檢測干重、脂肪酸含量，濾液檢測總糖含量。

1.2.3 不同氮源培養(yǎng)。

同“1.2.2”方法獲得初始藻液。取等量初始藻液絹篩過濾濃縮后分別接種至不同氮源種類和濃度的700 mL BG11培養(yǎng)基中，添加葡萄糖50 g/L，記為試驗(yàn)藻液。各試驗(yàn)組條件：NaNO3濃度0.5、1.5、3.0 g/L，蛋白胨1.0、3.0、5.0 g/L，酵母提取物2.0、4.0、6.0 g/L，尿素1.0、3.0、5.0 g/L。后將各試驗(yàn)藻液分為3份，每份100 mL接種至200 mL三角瓶，培養(yǎng)方法同“1.2.2”。

1.2.4 不同鹽度培養(yǎng)。

同“1.2.2”方法獲得初始藻液。取等量初始藻液絹篩過濾濃縮后分別接種至不同氯化鈉濃度的700 mL BG11培養(yǎng)基中溶解，添加葡萄糖60 g/L，記為試驗(yàn)藻液。氯化鈉濃度分別為0、1、5、10 g/L。后將各試驗(yàn)藻液分為6份，每份100 mL接種至200 mL三角瓶。培養(yǎng)方法同“1.2.2”。

1.3 檢測方法

1.3.1 干重測定。

移取三角瓶內(nèi)的全部藻液，用300目篩絹過濾除去培養(yǎng)基，并用去離子水重復(fù)清洗過濾3次，將收獲的濕藻細(xì)胞置于凍干機(jī)中干燥2 d后，稱重，相同方法獲得初始接種質(zhì)量M1，最終質(zhì)量M2，干重濃度DCW（g/L）=（M2-M1）/V，式中，V為培養(yǎng)體積（L）。

1.3.2 脂肪酸檢測。

1.3.2.1 試樣制備。取有代表性的樣品2 g（精確至0.001 g），混合均勻，用濾紙筒包裹。將索氏提取器及水洗接收燒瓶各部位充分洗滌并用蒸餾水清洗、烘干。水洗接收燒瓶在105 ℃干燥箱內(nèi)干燥至恒重（前后2次稱量差不超過0.002 g）。將上述包裹藻粉的濾紙筒置于提取器中，連接至注入了氯仿-甲醇（2∶1，V/V）100 mL的接收瓶。連接回流冷凝管。將底瓶放在水浴鍋上加熱。水浴溫度為80 ℃，提取20 h（直至提取器中溶劑呈無色）。

1.3.2.2 水洗。配制質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.71%的NaCl溶液，對(duì)底瓶中溶液進(jìn)行水提。關(guān)閉分液漏斗下方旋塞，將底瓶中溶液倒入分液漏斗（使用前先檢查是否漏水）中，按照氯仿∶甲醇∶NaCl溶液=8∶4∶3（體積比）的比例加入NaCl溶液，蓋上上方玻璃塞，180°翻轉(zhuǎn)15次，混合均勻后靜置分層。分層后，打開下方旋鈕，取下層溶液，放入已恒重的接收燒瓶中，蒸發(fā)除去溶劑，直至燒瓶中無溶劑流動(dòng)。

1.3.2.3 烘干、稱量。將接收燒瓶在105 ℃烘干2 h，干燥箱內(nèi)干燥冷卻至室溫，稱量準(zhǔn)確至0.1 mg，前后2次稱量差不超過0.002 g。脂肪酸含量等于脂肪質(zhì)量除以樣品質(zhì)量，其計(jì)算公式為X=m1-m0m2×100，式中，X為樣品中總脂肪的含量（%）;m1為接收瓶和總脂肪的質(zhì)量（g）;m0為接收瓶的質(zhì)量（g）;m2為樣品的質(zhì)量（g）。

1.3.3 總糖檢測。

取 1 mL黃絲藻藻液，在13 000 r/min條件下離心3 min 后，吸取上清液，放入測試管中，用于測定培養(yǎng)基中殘?zhí)橇俊?/p>

采用 3，5-二硝基水楊酸法[17]測定培養(yǎng)基中的殘?zhí)菨舛?，葡萄糖殘?zhí)菨舛龋▁，g/L）的直線回歸方程為A520 nm=20.132x（r=0.998 8）。

1.3.4 脂肪酸產(chǎn)量計(jì)算。

脂肪酸產(chǎn)量=DCW× TFAs，式中，DCW為生物質(zhì)濃度（g/L）;TFAs為總脂肪酸含量（%）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同葡萄糖濃度對(duì)黃絲藻生物量及脂肪酸的影響

碳源是黃絲藻異養(yǎng)培養(yǎng)的重要營養(yǎng)物質(zhì)，是微藻細(xì)胞的能量來源和主要組成部分[18]。選取合適的碳源，對(duì)是否可以異養(yǎng)培養(yǎng)以及培養(yǎng)產(chǎn)量和產(chǎn)物組成等起著關(guān)鍵的作用。葡萄糖作為異養(yǎng)培養(yǎng)的優(yōu)選碳源，具有應(yīng)用廣泛、利用率高、經(jīng)濟(jì)性佳的特點(diǎn)，該研究通過以BG11培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，在低氮（BG11培養(yǎng)基，1.5 g/L NaNO3）的條件下，優(yōu)化培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度，檢測黃絲藻生物量，尤其是脂肪酸含量的差異，并對(duì)培養(yǎng)基中的殘?zhí)菨舛冗M(jìn)行監(jiān)控，對(duì)比碳源利用效率，確定最佳葡萄糖濃度，提高葡萄糖對(duì)脂肪酸的轉(zhuǎn)化率。添加20、30、40和60 g/L葡萄糖培養(yǎng)黃絲藻，生物量、脂肪酸和殘?zhí)菨舛热鐖D1所示，隨著初始葡萄糖濃度的增加，最終生物量呈下降趨勢，說明葡萄糖濃度過高對(duì)細(xì)胞生物量增加有一定的抑制作用，糖濃度為30和40 g/L時(shí)細(xì)胞中最終脂肪酸含量最高達(dá)25%，20 g/L時(shí)細(xì)胞脂肪酸含量最低，達(dá)15%。

結(jié)合生物量和脂肪酸對(duì)比脂肪酸產(chǎn)量及碳源對(duì)脂肪酸轉(zhuǎn)化率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表1），葡萄糖濃度30 g/L時(shí)脂肪酸產(chǎn)量最高，達(dá)1.13 g/L，葡萄糖利用率在20 g/L時(shí)達(dá)到最高10.27%，隨著葡萄糖濃度的提高，脂肪酸產(chǎn)量和葡萄糖利用率都下降，且培養(yǎng)基中剩余葡萄糖濃度較高，生產(chǎn)中應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)周期、脂肪酸產(chǎn)量和葡萄糖利用率綜合比較，確定最佳葡萄糖濃度。

2.2 不同氮源種類及濃度對(duì)黃絲藻生物量及脂肪酸的影響

氮也是微藻細(xì)胞培養(yǎng)的重要營養(yǎng)物質(zhì)，是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等活性物質(zhì)的重要組成成分[19]。Guo等[20]研究表明，黃絲藻（Tribonema sp.）具有獨(dú)特的油脂積累規(guī)律，即在一個(gè)合適的氮濃度范圍內(nèi)，黃絲藻的油脂含量可隨氮濃度的增加而增加，其生物質(zhì)濃度和油脂含量均達(dá)到最高值，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)高生物質(zhì)濃度和高油脂含量的積累。另外，不同種類的氮源藻細(xì)胞生長速率和最終產(chǎn)物的含量具有差異性，該研究在葡萄糖充足（50 g/L）的條件下，對(duì)比單一氮源（硝酸鈉、尿素）和復(fù)合氮源（酵母提取物、蛋白胨）對(duì)黃絲藻生物量、脂肪酸含量的影響。

2.2.1 硝酸鈉。

利用0.5、1.5和3.0 g/L的NaNO3培養(yǎng)黃絲藻，對(duì)比不同培養(yǎng)時(shí)間生物量、脂肪酸含量的變化，結(jié)果如圖2所示。添加NaNO3時(shí)最終生物量均比對(duì)照組高，尤其在培養(yǎng)6 d時(shí)，差異明顯，隨著NaNO3濃度的增加，生長速率下降，培養(yǎng)8 d時(shí)0.5和1.5 g/L NaNO3組生物量下降，3.0 g/L NaNO3組生物量繼續(xù)增加，培養(yǎng)10 d時(shí)同樣出現(xiàn)下降的情況，推測培養(yǎng)后期氮源耗盡，細(xì)胞進(jìn)行脂肪酸積累，胞內(nèi)蛋白等物質(zhì)含量降低，細(xì)胞密度的差異導(dǎo)致生物量下降。對(duì)照組脂肪酸含量最高，添加 1.5 g/L NaNO3作為氮源時(shí)脂肪酸含量較高。綜合比較脂肪酸產(chǎn)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表2），培養(yǎng)6 d生物量最高時(shí)，添加1.5 g/L NaNO3脂肪酸產(chǎn)量最高，培養(yǎng)8 d脂肪酸含量較高時(shí)，對(duì)照組脂肪酸產(chǎn)量最高。

2.2.2 蛋白胨。

蛋白胨富含有機(jī)氮化合物，能為微藻培養(yǎng)提供氮源、生長因子、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，常作為微生物培養(yǎng)的氮源來源。添加1、3、5 g/L蛋白胨進(jìn)行黃絲藻培養(yǎng)，生物量及脂肪酸含量結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，試驗(yàn)組生物量均高于對(duì)照，蛋白胨1 g/L試驗(yàn)組生物量最高，在第10天蛋白胨1 g/L試驗(yàn)組生物量是對(duì)照的2.3倍。對(duì)照脂肪酸含量和添加蛋白胨培養(yǎng)時(shí)相差不大，說明添加蛋白胨可以顯著提高生物量的同時(shí)，在培養(yǎng)后期脂肪酸積累不受影響，總體上可以大大提高脂肪酸產(chǎn)量，蛋白胨1 g/L時(shí)脂肪酸產(chǎn)量是對(duì)照組的2.1倍，蛋白胨可以作為黃絲藻ENN172脂肪酸生產(chǎn)優(yōu)選氮源。

2.2.3 酵母提取物。

酵母提取物作為一種含有豐富氨基酸、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)的有機(jī)氮源，可提供藻細(xì)胞異養(yǎng)培養(yǎng)的多種營養(yǎng)元素需求，以其作為氮源培養(yǎng)ENN172黃絲藻，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，培養(yǎng)前期，添加酵母提取物時(shí)細(xì)胞生長速度較快，培養(yǎng)10 d后添加2 g/L酵母提取物生物量達(dá)到對(duì)照組的1.7倍;脂肪酸含量比較，酵母提取物添加2 g/L 時(shí)脂肪酸含量與對(duì)照組相差不大，在培養(yǎng)第6天時(shí)是對(duì)照組的1.1倍。綜合比較，添加2 g/L酵母對(duì)生物量及脂肪酸含量均有促進(jìn)作用，尤其添加2 g/L時(shí)，脂肪酸產(chǎn)量是對(duì)照組的1.6倍，酵母提取物可以作為黃絲藻異養(yǎng)培養(yǎng)的優(yōu)選氮源。

2.2.4 尿素。

尿素是由碳、氮、氧、氫組成的有機(jī)化合物，是哺乳動(dòng)物和某些魚類體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝分解的主要含氮終產(chǎn)物，也是目前含氮量最高的氮肥，其作為目前植物培育廣泛使用的氮肥之一，具有性價(jià)比高、保存使用方便等特點(diǎn)。將尿素添加到微藻培養(yǎng)中，可用于提供氮元素同時(shí)調(diào)節(jié)培養(yǎng)液pH，防治原生動(dòng)物及細(xì)菌污染，達(dá)到穩(wěn)定養(yǎng)殖的目的。黃絲藻異養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)添加尿素對(duì)比生物量和脂肪酸含量，結(jié)果如圖5所示，添加尿素試驗(yàn)組生物量均低于對(duì)照組，添加尿素試驗(yàn)組脂肪酸含量均低于對(duì)照組?？梢?，添加尿素對(duì)ENN172生物量及脂肪酸含量沒有明顯促進(jìn)作用。

綜合上述結(jié)果，將脂肪酸產(chǎn)量較高的幾組列表進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表3），其中，蛋白胨1 g/L時(shí)脂肪酸產(chǎn)量提升最大，達(dá)到初始時(shí)的11.5倍，其次為酵母提取物2 g/L，為初始時(shí)的8.6倍，可以作為優(yōu)選氮源進(jìn)一步優(yōu)化和培養(yǎng)。

2.3 不同鹽濃度培養(yǎng)對(duì)黃絲藻生物量及脂肪酸的影響

鹽度可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓，影響藻細(xì)胞的生理特性，對(duì)細(xì)胞生物量和脂肪酸含量產(chǎn)生影響。有研究顯示[16]，NaCl會(huì)不同程度地抑制小球藻（C.vulgaris）的生長，且濃度越高，抑制越明顯。在濃度為0.1～0.4 mol/L的NaCl培養(yǎng)基中，藻細(xì)胞的生物量減少量不大，但是脂肪酸含量比未添加NaCl的有明顯提高，當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度為0.3 mol/L 時(shí)得到最高脂肪酸總產(chǎn)量1.04 g/L。該研究通過添加不同濃度的NaCl對(duì)比黃絲藻異養(yǎng)培養(yǎng)過程中的生物量和脂肪酸含量的差別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖6），不同鹽度培養(yǎng)ENN172黃絲藻，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，生物量呈先增后降的趨勢，不同鹽濃度組均在第4天達(dá)到最大，且隨著鹽濃度的提高，會(huì)對(duì)生物量的增加造成抑制。不同鹽濃度對(duì)比脂肪酸含量發(fā)現(xiàn)，提高鹽濃度可以促進(jìn)脂肪酸含量增高，其中NaCl 10 g/L時(shí)在第6天達(dá)到最大（27.03%），之后出現(xiàn)下降但仍為最高，而對(duì)照組、NaCl 1 g/L和NaCl 5 g/L組均在第8天達(dá)到最高。培養(yǎng)基中剩余糖濃度結(jié)果顯示（圖6c），前6 d，ENN172對(duì)培養(yǎng)基中的糖消耗量不大，第8天時(shí)培養(yǎng)基中的糖均被消耗至50 g/L以下。

綜上所述，鹽的添加有利于細(xì)胞中脂肪酸的積累，但不利于細(xì)胞中生物量的積累。可以用于生物量積累結(jié)束的第二階段脂肪酸誘導(dǎo)，達(dá)到脂肪酸提高的目的。

3 結(jié)論

黃絲藻作為一種絲狀藻類，具有生長速度快、污染易控、采收成本低等培養(yǎng)優(yōu)勢，且其富含EPA、多糖等高附加值成分，是微藻多功能開發(fā)并實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的優(yōu)選藻株。自養(yǎng)培養(yǎng)具有占地面積大，受環(huán)境光照、溫度等影響較大的特點(diǎn)，而異養(yǎng)培養(yǎng)可以提高單位占地面積的微藻產(chǎn)量，具有條件易受控、品質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)勢而成為目前的研究熱點(diǎn)。黃絲藻異養(yǎng)培養(yǎng)條件優(yōu)化和探索，是實(shí)現(xiàn)其快速生長和脂肪酸產(chǎn)量提升的重要手段。

該研究對(duì)比了低氮條件下不同初始葡萄糖濃度時(shí)黃絲藻ENN172的脂肪酸生產(chǎn)情況，葡萄糖20 g/L時(shí)生長速度和最終生物量最高，30 g/L時(shí)脂肪酸產(chǎn)量最高，隨著葡萄糖濃度的增加，生物量大幅下降，且細(xì)胞脂肪酸含量也并未顯著增加，葡萄糖濃度過高時(shí)，會(huì)對(duì)藻細(xì)胞生長造成抑制，Rai等[21]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖含量為5%～10%時(shí)小球藻的生長受到抑制，鞭金藻3011、三角褐指藻、綠色微囊藻在利用有機(jī)碳時(shí)也表現(xiàn)底物抑制作用。對(duì)比黃絲藻4種異養(yǎng)氮源不同濃度下的脂肪酸產(chǎn)量情況發(fā)現(xiàn)，酵母提取物和蛋白胨都可顯著提高黃絲藻ENN172生物量和脂肪酸產(chǎn)量，推測可能與這2類物質(zhì)中含有多種小分子氮源以及維生素有關(guān)，更能滿足微藻細(xì)胞對(duì)營養(yǎng)元素的需求，可作為優(yōu)選氮源進(jìn)一步摸索條件提高最終脂肪酸含量。硝酸鈉濃度對(duì)黃絲藻脂肪酸產(chǎn)量有一定的影響，但效果不顯著，尿素對(duì)黃絲藻生物量呈負(fù)面影響，研究顯示[22]，不同藻類對(duì)氮的吸收利用途徑會(huì)有所不同，進(jìn)而引起培養(yǎng)基pH的變化，在吸收利用時(shí)會(huì)釋放出OH-導(dǎo)致培養(yǎng)液的pH升高，吸收利用時(shí)會(huì)釋放出H+使得培養(yǎng)液的pH降低，而在吸收利用CO（NH2）2時(shí)，培養(yǎng)液pH變化不大。該研究中培養(yǎng)液pH變化有可能是影響細(xì)胞生物量的主要因素。該株黃絲藻并未出現(xiàn)文獻(xiàn)報(bào)道的隨氮源濃度脂肪酸含量和生物量都增加的情況[20]，黃絲藻藻株間有一定的差異性，或所選氮源等培養(yǎng)條件仍需優(yōu)化。另外，提高氯化鈉濃度可以促進(jìn)黃絲藻ENN172脂肪酸的積累，但不利于生物量增加，對(duì)于脂肪酸誘導(dǎo)具有提升作用，說明鹽度脅迫導(dǎo)致的滲透壓變化對(duì)細(xì)胞吸收營養(yǎng)物質(zhì)和胞內(nèi)生化反應(yīng)產(chǎn)生影響，不利于細(xì)胞生長繁殖，但可促使細(xì)胞積累脂肪酸。

生長速率和脂肪酸產(chǎn)量是決定一株藻是否能夠產(chǎn)業(yè)化的標(biāo)準(zhǔn)，綜合以上結(jié)果，黃絲藻ENN172在初步優(yōu)化條件后培養(yǎng)6 d脂肪酸含量達(dá)到27.03%（與初始相比提高3.4倍），脂肪酸產(chǎn)量仍有巨大提升空間，是一株值得深入研究的潛力藻株。

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