王鵬洋 曲姍姍 梁源

摘要 [目的]對(duì)水稻W(wǎng)RKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步研究水稻W(wǎng)RKY轉(zhuǎn)錄因子的功能提供依據(jù)。[方法]從NCBI網(wǎng)站下載水稻全基因組序列，利用CDD、Blast、MEME、MEGA、ProtParam等在線工具或本地軟件篩選WRKY家族成員，對(duì)所得WRKY家族成員的理化性質(zhì)、系統(tǒng)進(jìn)化親緣關(guān)系、保守元件等項(xiàng)目進(jìn)行生物信息學(xué)分析。[結(jié)果]共從水稻基因組中鑒定篩選出65個(gè)WRKY家族成員，每一個(gè)成員中都具有WRKYGQK的保守元件，除此之外還有一個(gè)保守鋅指結(jié)構(gòu)的元件存在。利用MEGA對(duì)所得WRKY家族成員進(jìn)行聚類發(fā)現(xiàn)，65個(gè)WRKY家族成員可以分為A、B、C、D、E 5類，其中A、B、C、D 4類的親緣關(guān)系較近，可以聚為一類;而A類相對(duì)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，認(rèn)為A類成員可能是長(zhǎng)期進(jìn)化過程中被保留下來的較為原始的一類。[結(jié)論]該研究較系統(tǒng)地鑒定了水稻W(wǎng)RKY家族，為進(jìn)一步研究水稻W(wǎng)RKY轉(zhuǎn)錄因子功能和互作關(guān)系提供參考。

關(guān)鍵詞 水稻;WRKY轉(zhuǎn)錄因子;生物信息學(xué);系統(tǒng)進(jìn)化樹

中圖分類號(hào) Q 943.2 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）12-0123-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.12.033

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract [Objective]Bioinformatics analysis of WRKY transcription factor family members in rice was carried out to provide basis for further study on the function of WRKY transcription factor family in rice.[Method]The whole genome sequence of rice was downloaded from NCBI website.The WRKY family members were screened by CDD，Blast，MEME，MEGA，ProtParam and other online tools or local software.The physical and chemical properties，phylogenetic relationships and conservative elements of the WRKY family members were analyzed by bioinformatics.[Results]A total of 65 WRKY family members were identified from the rice genome，each of which had a conserved element of WRKYGQK，in addition to a conserved zinc finger structure.Using MEGA to cluster the obtained WRKY family members，65 WRKY family members can be divided into A，B，C，D，E 5 categories，among which A，B，C，D 4 are closely related and can be clustered into one group;while class A is relatively distantly related，and it is considered that class A members may be a relatively primitive class that has been preserved during longterm evolution.[Conclusion]This study systematically identified the WRKY family of rice，and provided a reference for further study on the function and interaction of WRKY transcription factors in rice.

Key words Rice;WRKY transcription factor;Bioinformatics;Phylogenetic tree

水稻（Oryza sativa）被譽(yù)為五谷之首，是我國的主要糧食作物之一，其生產(chǎn)史悠久，種植分布廣泛，我國水稻主產(chǎn)區(qū)主要是東北地區(qū)、長(zhǎng)江流域、珠江流域[1]。稻米中有豐富的營養(yǎng)，如碳水化合物、蛋白質(zhì)和一些礦物元素。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界上近一半人口都以稻米為食[2-3]。

WRKY是存在于植物中的最大且最重要的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，因其存在WRKYGQK（色氨酸-精氨酸-賴氨酸-酪氨酸-甘氨酸-谷氨酰胺-賴氨酸）結(jié)構(gòu)域而得名，該結(jié)構(gòu)域十分保守[4]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子是通過與靶基因啟動(dòng)子中的W-box相互作用來啟動(dòng)應(yīng)答的，一種應(yīng)答反應(yīng)常常需要多個(gè)WRKY因子的協(xié)同作用，而同一個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子有可能在多組應(yīng)答作用中發(fā)揮功能[5]。在多種植物中都存在WRKY轉(zhuǎn)錄因子，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）中有74個(gè)、番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）中有81個(gè)、蘋果（Malus pumila Mill.）中有116個(gè)[6]。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子在應(yīng)對(duì)逆境脅迫時(shí)可以發(fā)揮重要功能[7]。有研究表明，許多WRKY基因有參與抗病過程的功能，其參與途徑一般為調(diào)控抗病相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[8]。WRKY還在干旱、低溫、高鹽的情況下表達(dá)以降低植物受到的傷害，例如WRKY13選擇性的結(jié)合到SNAC1啟動(dòng)子區(qū)不同的順式作用元件上通過調(diào)節(jié)氣孔閉合來提高對(duì)干旱的抗性[9];WRKY1、WRKY7、WRKY22等基因在低溫情況下有應(yīng)激反應(yīng)[10];WRKY75是對(duì)鹽脅迫響應(yīng)的重要調(diào)控因子[11]。因此解析WRKY基因的生物學(xué)功能對(duì)建立植物對(duì)逆境脅迫的調(diào)控信號(hào)網(wǎng)絡(luò)意義重大，也可對(duì)植物分子改良提供理論基礎(chǔ)。該研究擬對(duì)水稻W(wǎng)RKY進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以期全面了解水稻W(wǎng)RKY蛋白的基本性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及系統(tǒng)進(jìn)化等信息，為WRKY基因的進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 從NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_000004655.2）上下載水稻的全基因組序列，以染色體為單位下載，共12條染色體。用NCBI中的在線工具CDD[12]（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）得到WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的保守簡(jiǎn)并結(jié)構(gòu)域（LDDGYRWRKYGQKVVKGNPYPRSYYKCTTPGCGVRKHVERAATDPKAVVTTYEGKHNH），并以該結(jié)構(gòu)域作為后續(xù)Blast的探針。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 數(shù)據(jù)篩選。運(yùn)用本地Blast軟件，采用tBlastn[13]算法，以水稻12條染色體的全基因組為數(shù)據(jù)庫，以WRKY保守結(jié)構(gòu)域?yàn)樘结樳M(jìn)行比對(duì)，E-value值設(shè)為1e- 5，手動(dòng)除去短的干擾序列，輸出分值比較高的比對(duì)結(jié)果。上述tBlastn算法比對(duì)輸出的結(jié)果為蛋白序列，將其逐條于水稻數(shù)據(jù)庫（http：//rice.plantbiology.msu.edu/）的在線Blastp算法比對(duì)以獲得WRKY蛋白的全序列。

1.2.2 數(shù)據(jù)的篩選與鑒定。將從水稻數(shù)據(jù)庫獲得的WRKY蛋白輸入CDD，有WRKY保守結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)才被確定為WRKY家族成員。應(yīng)用在線工具M(jìn)EME（http：//meme-suite.org/tools/meme）對(duì)WRKY家族成員做鑒定，尋找該家族是否有其他共有的保守序列，設(shè)定保守序列長(zhǎng)度為2～600個(gè)氨基酸殘基，最多檢測(cè)10個(gè)保守序列，其余參數(shù)為默認(rèn)，并得到保守序列處于蛋白位置的示意圖。

1.2.3 WRKY家族成員系統(tǒng)進(jìn)化分析。將篩選鑒定得到的WRKY蛋白質(zhì)序列以fasta格式保存，利用軟件MEGA（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）中的ClustalW進(jìn)行序列比對(duì)，再利用MEGA中PHYLOGENY功能的鄰接法（neighbor-joining）[14-15]，設(shè)置NO.of Bootstrap Replications值為1 000，Number of Threads值為3，其余參數(shù)為默認(rèn)，作出WRKY家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 WRKY家族成員蛋白的理化性質(zhì)分析。利用在線工具ProtParam（https：//web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam）對(duì)WRKY家族成員蛋白作理化性質(zhì)預(yù)測(cè)與分析，分別預(yù)測(cè)了分子質(zhì)量（Molecular weight）、等電點(diǎn)（PI）、不穩(wěn)定系數(shù)（Instability index）和總平均親水性（Grand average of hydropathicity）。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻W(wǎng)RKY轉(zhuǎn)錄因子家族的鑒定及理化性質(zhì)分析 通過篩選鑒定得到水稻W(wǎng)RKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員65個(gè)，鑒定依據(jù)為蛋白序列中存在WRKYGQK保守基序，WRKY家族成員的命名采用水稻數(shù)據(jù)庫中的名字，登錄號(hào)為水稻數(shù)據(jù)庫中該蛋白對(duì)應(yīng)基因的登錄號(hào)，并統(tǒng)計(jì)了蛋白氨基酸數(shù)目、對(duì)應(yīng)基因的ORF長(zhǎng)度、蛋白相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)和總平均親水性。據(jù)統(tǒng)計(jì)，水稻W(wǎng)RKY家族中蛋白氨基酸數(shù)目最多為1 002個(gè)，最少為181個(gè)，極差較大，平均值為400個(gè)氨基酸。等電點(diǎn)范圍為4.52～10.20，其中小于7的有39個(gè)，大于7的有26個(gè)，說明該家族蛋白質(zhì)更偏向于弱酸性。相對(duì)分子質(zhì)量在18 481.3～109 042.29之間。該家族中不穩(wěn)定系數(shù)只有3個(gè)成員小于40，為穩(wěn)定蛋白，其余均為不穩(wěn)定蛋白?？偲骄H水性均為負(fù)值，說明WRKY家族成員均為親水蛋白。

2.2 WRKY家族成員系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果 為得到WRKY家族中各成員間的同源進(jìn)化關(guān)系，筆者采用系統(tǒng)進(jìn)化分析的方法，將鑒定得到的65個(gè)家族成員輸入MEGA繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1）。根據(jù)進(jìn)化樹的聚類結(jié)果將這65個(gè)成員分為A、B、C、D、E 5類，其分別包括WRKY基因9、16、12、11和17個(gè)，A類中的WRKY成員最少，E類中的WRKY成員最多。從進(jìn)化樹分支關(guān)系中還可以得到B、C、D、E 4類的親緣關(guān)系相對(duì)較近聚為一大類，而A類相對(duì)關(guān)系較遠(yuǎn)，認(rèn)為可能A類成員是在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中保留下來的較原始的一類。根據(jù)進(jìn)化樹分組結(jié)果將家族成員分組進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，每組的保守氨基酸都各不相同，但相同的是所有組都有WRKY保守序列（圖2）。其中C組中同組完全保守氨基酸較多，E組中完全保守氨基酸較少。B、C、D、E 4組比較相似，它們與A組成員相差較遠(yuǎn)，其差異主要表現(xiàn)在后半部分，從第1個(gè)保守的半胱氨酸（C字母）開始出現(xiàn)差異，第2個(gè)半胱氨酸相對(duì)于其他4組更晚出現(xiàn)，且碳端保守組氨酸（H字母）也出現(xiàn)的更晚，這些是由于長(zhǎng)期進(jìn)化而出現(xiàn)的序列差異。

2.3 保守元件分析 利用在線工具M(jìn)EME尋找WRKY家族的保守元件，發(fā)現(xiàn)除WRKYGQK的保守元件，該家族中還具有1個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)[16]，A組中該鋅指結(jié)構(gòu)為C-X7-C-X22-28-H-X-H，B組和C組中該鋅指結(jié)構(gòu)為C-X5-C-X23-H-X-H，而D組和E組中該鋅指結(jié)構(gòu)為C-X4-C-X23-H-X-H，其中X可以是任意氨基酸，但X中也有相對(duì)保守的氨基酸存在。

3 結(jié)論與討論

WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族是在植物中廣泛存在的一類重要蛋白，其可以在很多逆境脅迫中發(fā)揮作用以減少逆境對(duì)植物帶來的傷害，因此對(duì)WRKY家族的研究至關(guān)重要。常常有多個(gè)WRKY協(xié)同發(fā)揮一個(gè)功能，但WRKY轉(zhuǎn)錄因子與基因之間或兩個(gè)WRKY之間是如何協(xié)同進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的，該機(jī)制尚不清楚，仍需進(jìn)一步闡明和完善。該研究對(duì)水稻W(wǎng)RKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員的理化性質(zhì)、系統(tǒng)進(jìn)化親緣關(guān)系、保守元件等項(xiàng)目的生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，水稻W(wǎng)RKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員共有65個(gè)，每一個(gè)成員中都具有WRKYGQK的保守元件，除此之外還有一個(gè)保守鋅指結(jié)構(gòu)的元件存在。利用MEGA對(duì)所得WRKY家族成員進(jìn)行聚類發(fā)現(xiàn)，65個(gè)WRKY家族成員可以分為A、B、C、D、E 5類，其中A、B、C、D 4類的親緣關(guān)系較近，可以聚為一類;而A類相對(duì)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，認(rèn)為A類成員可能是長(zhǎng)期進(jìn)化過程中被保留下來的較原始的一類。該研究認(rèn)為，水稻基因組中共有65個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子，這與Ross等[17]在日本晴水稻上得出的結(jié)論不同，可能是由于所選用的水稻基因組數(shù)據(jù)、篩選方式以及結(jié)構(gòu)域探針不同等因素導(dǎo)致的。該研究較系統(tǒng)地鑒定了水稻W(wǎng)RKY家族，為學(xué)者研究WRKY轉(zhuǎn)錄因子功能和互作關(guān)系提供生物信息學(xué)信息，有利于對(duì)WRKY的進(jìn)一步深入研究。未來對(duì)WRKY轉(zhuǎn)錄因子的研究重點(diǎn)依然在明確WRKY在植物受逆境脅迫時(shí)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，以及利用WRKY對(duì)作物和林木進(jìn)行分子改良以開發(fā)其巨大的應(yīng)用價(jià)值。

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