尹國友 王林嵩

摘要：根據(jù)NCBI上傳的豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）[GenBank：JN547228（CH/S）]，設計引物對陽性病料進行鑒定并回收，與pMD18-T構建重組載體并測序。對豬流行性腹瀉病毒的基因多樣性及序列保守性進行分析，一是以經(jīng)典毒株為主，包括CV777、KPEDV-9和CH/S株等為代表的G1基因型，另一種是以近幾年分離的毒株為主，包括HB3-CH2012、CXHZ-CH2013、HNCZ-CH2013等為代表的G2基因型?；蛲葱苑治霰容^結果表明，這4株PEDV之間的序列同源性為97.6%～100.0%，與經(jīng)典株CV777的同源性為92.7%～92.8%。同源分析顯示，PEDV不同毒株間的基因同源性仍高度相似，但PEDV流行毒株已呈現(xiàn)進化分支的趨勢。

關鍵詞：豬流行性腹瀉病毒;S基因;序列分析

中圖分類號：S858.285.3?? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）11-0071-03

豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的豬流行性腹瀉?。╬orcine epidemic diarrhea，PED）是一種高死亡率的腸道傳染病，會在豬群中引起各個年齡段豬暴發(fā)急性腹瀉，多發(fā)于仔豬和胎豬，其臨床癥狀主要以豬水樣腹瀉、嘔吐和脫水為主。1971年，英國首先報道了PEDV的暴發(fā)流行[1]，隨后在比利時、德國、瑞士、日本、韓國等許多養(yǎng)殖大國出現(xiàn)報道[2-3]。1976年，中國大陸首次報道PED的發(fā)生與流行，1984年通過免疫熒光試驗證實病原微生物為豬流行性腹瀉病毒[4]。20世紀80年代后，我國不斷有PED發(fā)生，其中26個省（市、自治區(qū)）都曾發(fā)生。20世紀90年代后期，豬傳染性胃腸炎（華毒株）和豬流行性腹瀉（CV777）二聯(lián)滅活苗或弱毒苗，在我國開始大范圍使用并取得良好免疫效果[5]。國內(nèi)外對該病的研究和重視程度均遠遠不夠，我國甚至沒有把豬流行性腹瀉列為國家動物法定傳染病的一、二和三類疫病[6]。自2006年后，以經(jīng)典毒株CV777基礎研制的滅活苗或弱毒苗免疫效果下降，免疫過的豬場還出現(xiàn)多次豬流行性腹瀉病的暴發(fā)。2010年起，豬流性腹瀉病開始在全國大部分的主要養(yǎng)殖區(qū)出現(xiàn)，導致初生仔豬死亡率高達90%以上，全國仔豬死亡估計有上千萬頭[7-8]，給生豬養(yǎng)殖業(yè)造成了難以估量的經(jīng)濟損失。

PEDV屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，其中冠狀病毒屬分為α、β、γ、δ 4個群[9]，豬流行性腹瀉屬于冠狀病毒α群，豬流行性腹瀉基因組是單股正鏈具有感染性的RNA，其基因組大小為28 kb左右，其中S基因編碼的S蛋白是一種跨膜糖蛋白，位于病毒表面。S蛋白與細胞受體結合、病毒融合，最重要的是，在誘導中和抗體方面和病毒粒子與細胞表面受體結合后通過膜融合侵入宿主細胞方面發(fā)揮關鍵作用[10-11]。通過分析比對豬流行性腹瀉病毒S基因分離株與經(jīng)典株之間核苷酸和氨基酸的同源性、抗原表位差異、糖基化位點及跨膜域差異性，以期為預防和控制豬流行性腹瀉暴發(fā)流行提供理論數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Trizol LS Reagent，購自美國Invitrogen公司產(chǎn)品;pMD18-T載體克隆試劑盒、DL 2000 DNA Marker、rTaq酶、RNA酶抑制劑（HPRI）、dNTP、反轉(zhuǎn)錄酶（AMV）、UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒，均購自生工生物工程（上海）有限公司;BamH Ⅰ及Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶，均購自寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司;DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞由實驗室保存。本研究于2016年在河南城建學院分子生物學實驗室完成。

1.2 引物的設計和合成

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫GenBank中發(fā)表的JN547228基因序列，設計并合成S基因測序引物，引物序列見表1。

1.3 模板的制備

取來自發(fā)病豬的病變組織細胞勻漿液，按Trizol LS Reagent使用說明，提取病毒RNA，將提取物RNA置于 -20 ℃ 冰箱保存。

1.4 RT-PCR

將設計好的下游引物1.0 μL，0.4 μL Rnase-Inhibitor，5.0 μL dNTP，4.0 μL 5×AMV Buffer，1.0 μL AMV，加入 10.0 μL RNA，42 ℃水浴1～2 h，即得cDNA模板，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 目的片段S基因的擴增

取cDNA產(chǎn)物1.0 μL作為模板進行PCR擴增，擴增體系：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，rTaq酶0.5 μL，PEDV-S-sense/PEDV-S-anti-sense各0.5 μL，用滅菌ddH2O補足25.0 μL。PCR擴增反應條件為：95 ℃預變性 5 min;94 ℃ 50 s，58 ℃ 50 s，72 ℃ 60 s，共進行35個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。RT-PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增結果。

1.6 目的基因的克隆及序列測定

將擴增的RT-PCR產(chǎn)物，回收產(chǎn)物與載體pMD18-T進行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞DH5α中，挑選陽性菌落于100 mL液體LB（含A+）液體培養(yǎng)基中，放置于37 ℃恒溫搖床培養(yǎng)過夜，用堿性法提取重組質(zhì)粒。并用雙酶切酶BamHⅠ、HindⅢ酶切重組質(zhì)粒，陽性質(zhì)粒進行測序。

1.7 基因序列分析

利用Clustal 1.83和MEGA 5.05軟件對豬流行性腹瀉病毒的基因多樣性及序列保守性分析，繪制毒株的系統(tǒng)進化樹。

2 結果

2.1 目的基因的擴增

RT-PCR擴增毒株，顯示與預期片段1 058 bp相似大小的特異片段（圖1）。

2.2 組質(zhì)粒的酶切鑒定

用BamHⅠ、HindⅢ限制性內(nèi)切酶對重組質(zhì)粒pMD18-PEDV-S進行雙酶切鑒定，將酶切產(chǎn)物用凝膠核酸電泳得到預期大小約1 058 bp和2 000 bp以上的2條電泳條帶（圖2）。

2.3 DNA序列測定

酶切鑒定陽性pMD18-PEDV-S克隆質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司測序，將測序序列通過Blast雙重比對，分析表明pMD18載體已插入PEDV-S基因。

2.4 氨基酸的序列多樣性、同源性分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載經(jīng)發(fā)表的20株國內(nèi)外毒株序列，與4個分離株（PEDV-HN1、PEDV-HN2、PEDV-HN3、PEDV-HN4）PEDV-S基因序列進行核苷酸和氨基酸的同源性分析（表2）。

2.5 PEDV-S系統(tǒng)發(fā)育進化樹

PEDV-S基因序列同源性比較的系統(tǒng)發(fā)育進化樹見圖3。

3 分析與討論

豬流行性腹瀉病毒刺突蛋白S基因保守性非常高，是主要的抗原表位所在域，PEDV-S基因結構和功能與該病毒的致病性、感染性、中和抗體的產(chǎn)生和細胞結合能力密切相關[12-13]。本研究表明，PEDV流行毒株的刺突蛋白基因不論在基因和蛋白質(zhì)同源性上，還是在系統(tǒng)進化樹上，與PEDV經(jīng)典毒株CV777、DR13等疫苗株均存在顯著差異，其基因的保守同源性只有92.7%～92.8%，從PEDV-S基因的系統(tǒng)進化樹上可以看出，PEDV流行毒株與經(jīng)典疫苗株分為不同的組群，表明PEDV流行毒株與經(jīng)典疫苗株抗原表位的刺突蛋白S出現(xiàn)了基因多樣性及保守性的變化[14]。

3.1 PEDV-S基因同源性分析

Meg Align軟件進行同源性分析，PEDV進化上主要有G1和G2這2個基因組型，G1型以經(jīng)典毒株為主，包括CV777、KPEDV-9和CH/S株等，G2型則以近年分離的毒株為主，包括HB3-CH2012、CXHZ-CH2013、HNCZ-CH2013等。PEDV-HN1、PEDV-HN2、PEDV-HN3和PEDV-HN4的同源性為97.6%～100.0%，與參考病毒株CV777、DR13、KPEDV-9等的同源性為92.6%～93.3%。

分離株PEDV-HN1、PEDV-HN2、PEDV-HN3和PEDV-HN4與參考病毒株CV777相比，比經(jīng)典毒株多2個插入突變和1個缺失突變，其中一個插入部位在流行毒株的第58～59位之間插入（QGVN），另一個插入部位在流行毒株139～140（N），流行毒株62～164（KNI）位存在缺失突變，與經(jīng)典毒株CV777蛋白質(zhì)同源性相比，分離株的多個氨基酸位點發(fā)生突變，共有65個位點發(fā)生氨基酸突變：第2～5位（TPLI→KSLT）、第15位（L→T）、第27～30位（QSTI→SANT）、第64位（S→T）、第68～74位（GTGIETD→AGQHPTA）、第86～87位（DS→RG）、第89位（Q→H）、第118位（S→N）、第138位（V→A）、第157～163位（LQDGKNI→HSEHS-—）、第200～202位（KRS→SGG）、第210位（T→E）、第227～229位（SYQ→YYE）、第236位（S→Y）、第246～247位（DS→EP）、第270位（L→V）、第286位（W→L）等。

3.2 PEDV-S基因蛋白抗原位點變化

ExPASy分析經(jīng)典毒株CV777的S蛋白抗原表位表明，它有51個潛在的抗原位點，而PEDV-HN1株預測存在56個抗原位點，PEDV-HN4株存在57個抗原位點，PEDV-HN2和PEDV-HN3株均含有54個抗原位點。與參考毒株CV777相比，分離株PEDV-HN1、PEDV-HN2、PEDV-HN3和PEDV-HN4在130～136位缺失1個抗原位點，而新增加的抗原位點（第159～165位氨基酸、第191～199位氨基酸和第631～610位氨基酸）主要出現(xiàn)在豬流行性腹瀉病毒的S1區(qū)。

3.3 PEDV-S基因蛋白糖基化位點變化

ExPASy分析PEDV S蛋白糖基化位點可知，CV777及PEDV-HN2株中存在29個N-糖基化修飾位點，而 PEDV-HN1、PEDV-HN3、PEDV-HN4株含有28個N-糖基化位點。4株分離毒株與CV777相比，其N-糖基化位點出現(xiàn)3處改變，第57位氨基酸由NSSS變?yōu)镹STW，第1196位氨基酸增加了1個N-糖基化位點NHTA，第230位氨基酸有1個N-糖基化位點缺失NCTG。

3.4 PEDV-S基因跨膜螺旋法

通過SOSUI預測PEDV S蛋白跨膜螺旋區(qū)分析可知，經(jīng)典毒株CV777在第1331～1356位氨基酸形成了首個跨膜螺旋域，在第2～24位氨基酸形成第二次跨膜螺旋域。而PEDV-HN1和 PEDV-HN4毒株在第1337～1359位氨基酸形成首次跨膜螺旋域，在第1～23位氨基酸形成第二次跨膜螺旋，PEDV-HN2和PEDV-HN3在第1328～1350位氨基酸形成了首次跨膜螺旋域，在第1～23位氨基酸和第 1356～1378位氨基酸分別形成了第二次跨膜螺旋域[16]。

3.5 PEDV-S基因的遺傳演化趨勢

Meg Align軟件進行同源性分析，豬流行性腹瀉病毒進化上可以分為G1和G2這2個不同的基因組型。同源分析的24株PEDV中，9株PEDV為G1基因組型，占37.5%，15株PEDV為G2基因組型，占62.5%。近年，PEDV主要的流行優(yōu)勢毒株也位于G2基因組型中，G1基因組型主要是經(jīng)典CV777、DR13、KPEDV等疫苗株以及我國發(fā)現(xiàn)的部分毒株。最近出現(xiàn)的流行株G2群，除在我國發(fā)現(xiàn)外，也出現(xiàn)在東北亞國家日本和韓國，此次分離鑒定的4株毒株均屬于G2群，我國近年分離的PEDV流行毒株與G2群同源性最高，結果說明我國跨地域的生豬調(diào)配導致不同區(qū)域的毒株之間存在交叉感染基因重配，可能與PEDV的傳播和致病有一定相關性。系統(tǒng)進化樹進化不同分支的時間顯示，不同時代鑒別的PEDV流行毒株有相同的進化方向，并不存在明顯的時空聚集性[15]。

豬流行性腹瀉病是嚴重影響我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要傳染病之一，給生豬飼養(yǎng)、育種等造成巨大的經(jīng)濟損失。在很長一段時間內(nèi)由于疫苗的使用減少了該病的感染，但同時由于疫苗長期使用導致PEDV的基因發(fā)生突變[17]。通過本研究發(fā)現(xiàn)，目前我國廣泛流行的豬流行性腹瀉病毒株與以往經(jīng)典毒株相比已經(jīng)存在一些在基因序列及蛋白結構方面的明顯差異，這可能是疫苗免疫失敗的主要原因之一。

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