衣慧靈，杜娟,2，鄭濤，胡碩，李嘉麒，石清磊，劉蘭祥*

1.秦皇島市第一醫(yī)院核磁室，河北秦皇島 066000；2.河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，河北石家莊 050000；3.燕山大學(xué)，河北秦皇島06600；4.秦皇島市第一醫(yī)院骨科，河北秦皇島 066000；5.西門子有限公司磁共振產(chǎn)品事業(yè)部，北京 100000； *通訊作者 劉蘭祥liulanxiang66@sina.com

卒中是一種常見的腦血管疾病，發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高。急性缺血性卒中占卒中的60%～80%[1-2]，是由于腦血管突然阻塞導(dǎo)致血液不能流入大腦而引起腦組織損傷的一種疾病。近年來很多研究者嘗試用無創(chuàng)的物理方法如低強(qiáng)度經(jīng)顱超聲（low intensity pulsed transcranial ultrasound，LIPUS）刺激治療缺血性卒中取得了較好的療效，可能成為一種治療腦血管病的新方法[3-4]，但是利用影像方法評價(jià)其治療效果鮮有研究。有研究表明水通道蛋白 4（aquaporin 4，AQP4）的表達(dá)不同能反映LIPUS的治療效果，相對表觀擴(kuò)散系數(shù)（relative apparent diffusion coefficient，rADC）的變化也能對LIPUS的治療效果進(jìn)行評價(jià)。因此，本研究利用高分辨擴(kuò)散成像動(dòng)態(tài)評價(jià)大鼠腦缺血損傷不同時(shí)間點(diǎn)給予超聲刺激后，腦損傷區(qū)AQP4的表達(dá)情況及腦損傷區(qū)rADC的變化，從AQP4和影像方面評價(jià)LIPUS對超急性及急性腦梗死的治療效果，并探討 LIPUS減輕永久性大腦中動(dòng)脈栓塞（distal middle cerebral artery occlusion，dMCAO）后腦水腫的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雄性 SD 成年大鼠[購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號：SCXK（京）2016-0006]40只，體重200～250 g，7周齡，分成4組，每組10只，建立dMCAO模型，對照組（A組）不給予超聲刺激，實(shí)驗(yàn)組根據(jù)腦梗死分期分為超急性早期、超急性晚期和急性期，分別于模型后1 h、3 h、9 h給予超聲刺激，分別記為B組、C組和D組。本研究經(jīng)秦皇島市第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 動(dòng)物模型制備 所有大鼠均用 3%戊巴比妥鈉（5 mg/100 g）腹腔麻醉后進(jìn)行手術(shù)，使用改良的Longa法制作大鼠永久性 dMCAO腦缺血模型，術(shù)前 12 h禁食不禁水。仰臥位固定后行頸部正中縱行切口；游離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈并掛線標(biāo)記；夾閉右側(cè)頸總動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈近心端和遠(yuǎn)心端，中間剪斷，于殘端剪一小口，插入線栓，稍感阻力時(shí)停止進(jìn)線，進(jìn)線深度約18～19 mm；術(shù)中采用麻醉藥維持劑量≤0.2 ml/（kg·h），電熱毯加熱保持大鼠體溫在（38.0±0.5）℃。模型制作完畢后將大鼠頭頂右側(cè)皮毛剪開，暴露顱骨以便給予超聲刺激。

1.3 超聲刺激實(shí)驗(yàn) 采用一種商業(yè)經(jīng)顱超聲電療儀（DK-102T，中國渡康醫(yī)療器械有限公司）給予大鼠超聲刺激。非聚焦超聲傳感器的面積為3.5 cm2，總刺激持續(xù)時(shí)間為10 min。超聲波的基本頻率和脈沖重復(fù)頻率分別為800 kHz和1 kHz。超聲波持續(xù)時(shí)間和相互刺激間隔時(shí)間分別為10 ms和100 ms。超聲波空間峰脈沖平均強(qiáng)度為1.2 W/cm2[5-6]。實(shí)驗(yàn)組分別于模型后1 h、3 h、9 h給予超聲刺激。

1.4 MRI檢查 采用Siemens 3.0T MR掃描儀，動(dòng)物專用線圈，將各組大鼠麻醉后取俯臥位，頭部置入線圈中央行冠狀位掃描。擴(kuò)散加權(quán)成像（DWI）序列掃描參數(shù)：TR 5000 ms，TE 70 ms，翻轉(zhuǎn)角150°，層厚2.2 mm；體素1.0 mm×1.0 mm×2.2 mm，視野98 mm×98 mm，b值分別為 0、1000 s/mm2。TSE-T2WI序列掃描參數(shù)：TE 113 ms，TR 3530 ms，翻轉(zhuǎn)角150°，層厚2.2 mm，體素0.3 mm×0.3 mm×2.2 mm，視野74 mm ×74 mm。

圖像分析在后處理工作站上（德國西門子公司），感興趣區(qū)（ROI）選擇異常信號灶最大且包括兩側(cè)側(cè)腦室的層面及對側(cè)半球相應(yīng)部位并測量其ADC值，由2名影像科醫(yī)師分別進(jìn)行測量，計(jì)算組內(nèi)相關(guān)系數(shù)（ICC）>0.8，結(jié)果信度良好。為避免因梗死部位對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的影響，計(jì)算時(shí)采用病變側(cè)與正常側(cè)的比值，即rADC值。ADC值=ln（S1-SO）/（bO-b1），其中S1為b=1000 s/mm2的信號強(qiáng)度，SO為b=0的信號強(qiáng)度，ln：自然對數(shù)；rADC值=ROI的ADC值/對側(cè)ADC值×100%。ROI均為2 mm2。

1.5 病理學(xué)檢查

1.5.1 TTC染色 MRI掃描后每組取2只，麻醉后斷頭取腦。把腦組織冷凍20 min后切成2 mm的冠狀位切片，浸在2% TTC溶液中，放入37℃水浴箱中加熱20 min，取出后放入10%多聚甲醛磷酸緩沖液固定24 h，固定后取出切片觀察模型的腦缺血情況。

1.5.2 免疫組織化學(xué)染色 除去行 TTC染色的大鼠，其他均在麻醉后用4℃、4%多聚甲醛溶液灌流取腦，腦組織置于 4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋后做冠狀切片。按照 Axiotis等[7]的方法進(jìn)行染色分析，在顯微鏡下觀察。在4組大鼠的右腦皮質(zhì)中隨機(jī)選取 20個(gè)視野，2名免疫學(xué)專家評估免疫組織化學(xué)染色強(qiáng)度百分比。用二甲苯和不同濃度的酒精常規(guī)脫蠟，用HE染色，每張切片隨機(jī)選取4個(gè)高倍視野（×400）。

AQP4免疫組織化學(xué)染色半定量結(jié)果按陽性細(xì)胞百分比表達(dá)：0為 0～10%，1+為 11%～25%，2+為26%～50%，3+為51%～75%，4+為76%～100%。免疫染色強(qiáng)度半定量分析：1+為染色較弱，2+為適度染色，3+為染色較強(qiáng)。將這兩種評分方法的結(jié)果相加，得到以下評分：0～2分為弱表達(dá)，3～5分為中度陽性表達(dá)，6～7分為強(qiáng)陽性表達(dá)。計(jì)算20個(gè)視野的平均值，并將結(jié)果四舍五入到最接近的整數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件，計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AQP4表達(dá)情況 A、B、C、D組的AQP4陽性細(xì)胞百分比分別為 87%、67%、65%、88%，評分分別為（7±2）分、（3±1）分、（4±2）分、（6±2）分。A組和D組陽性細(xì)胞百分比和平均分接近，AQP4具有較強(qiáng)的陽性表達(dá)。B組和 C組在 LIPUS治療下AQP4陽性細(xì)胞百分比和平均分均降低。在腦缺血后1 h給予超聲刺激治療后AQP4陽性染色細(xì)胞密度降低最明顯，A組平均染色分?jǐn)?shù)在6～7分，B和C組的平均染色分?jǐn)?shù)均在3～4分，D組平均染色分?jǐn)?shù)在6～7分，表明AQP4在對照組及9 h超聲治療組的細(xì)胞中有較強(qiáng)的陽性表達(dá)（圖1）。

圖1 4組大鼠腦AQP4免疫組化染色結(jié)果（×400）。A組和D組見較強(qiáng)的AQP4表達(dá)，較B組和C組染色明顯，陽性細(xì)胞數(shù)量多

2.2 AIS大鼠右側(cè)大腦梗死區(qū)域rADC值及TTC染色結(jié)果 dMCAO建模后12 h，A組、B組、C組及D 組大鼠腦 rADC 值分別為 0.24±0.15、0.39±0.22、0.42±0.29及 0.23±0.18，B組、C組明顯高于 A 組（P=0.016、0.018），D組與A組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.850）。TTC染色結(jié)果顯示，右側(cè)大腦半球腦組織顯示白色區(qū)域?yàn)楣Ｋ绤^(qū)。

圖2 大鼠腦急性腦缺血MRI及TTC染色結(jié)果。A～C分別是冠狀位T2WI、冠狀位高分辨擴(kuò)散成像、冠狀位rADC MR圖像，D為TTC染色結(jié)果。MRI圖像表明右側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞后出現(xiàn)大面積急性腦梗死，TTC染色圖與其對應(yīng)

3 討論

3.1 LIPUS對急性腦水腫的調(diào)控 腦水腫指腦組織中水分子的異常聚集，從而引發(fā)腦腫脹。腫瘤、創(chuàng)傷以及腦血管疾病等多種顱內(nèi)病理變化均能導(dǎo)致腦水腫的發(fā)生，嚴(yán)重的腦水腫則可能導(dǎo)致腦疝，從而危及患者生命[8]。目前臨床上仍然以甘露醇等藥物作為缺血后腦水腫的首選治療方法，但其效果受到血-腦屏障通透性和肝臟代謝的影響。LIPUS作為近十年內(nèi)新的腦病治療方法，已在腦腫瘤、癲癇、阿爾茨海默病和帕金森病等治療中發(fā)揮了獨(dú)特的作用[9-10]。既往研究將LIPUS用于創(chuàng)傷后腦水腫的調(diào)節(jié)，并取得了突出的療效[11-12]。

LIPUS指用低強(qiáng)度超聲穿透完整的大腦顱骨從而達(dá)到對腦血管和腦神經(jīng)功能調(diào)制的一種技術(shù)，它具有無損傷、可調(diào)節(jié)、高刺激深度、高空間分辨率、無永久副作用等優(yōu)點(diǎn)[13]。Guo等[14]研究證明LIPUS可調(diào)節(jié)大腦神經(jīng)活動(dòng)，提高腦血氧飽和度并增加腦血流量，降低腦組織腦缺血損傷。Li等[4]研究表明，在缺血性卒中發(fā)作后立即給予超聲波刺激可促進(jìn)血液供應(yīng)，減小缺血面積。

3.2 rADC和AQP4聯(lián)合評估LIPUS的療效 DWI作為一種能夠在疾病早期（6 h以內(nèi)）甚至在超早期明確顯示梗死區(qū)域的 MRI技術(shù)，是診斷急性缺血性卒中的“金標(biāo)準(zhǔn)”。采用rADC評價(jià)不同個(gè)體間的病變狀態(tài)更具有可比性[15]。Copen等[16]通過研究腦梗死rADC的散點(diǎn)圖和時(shí)程表對發(fā)病時(shí)間作出估計(jì)，發(fā)現(xiàn)rADC值是對腦梗死灶性質(zhì)進(jìn)行量化的一個(gè)指標(biāo)，可以更客觀地反映病灶的時(shí)程。Unruh等[17]報(bào)道AQP與腦水腫的發(fā)生密不可分。在哺乳動(dòng)物腦中最主要的是AQP4，其與腦脊液的產(chǎn)生和重吸收有關(guān)，調(diào)控腦水腫發(fā)生極性，即在靠近血管內(nèi)皮細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞終足膜上出現(xiàn)大量表達(dá)，使腦水腫明顯加重；下調(diào)APQ4則可以減輕腦水腫的程度，提示AQP4是膠質(zhì)細(xì)胞與腦脊液及血管之間水轉(zhuǎn)運(yùn)和調(diào)節(jié)的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，是腦水腫中重要的靶蛋白[18]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在dMCAO后1 h、3 h給予LIPUS刺激，可使AQP4表達(dá)明顯下調(diào)，rADC值增大。B組、C組APQ4免疫組化評分均低于A組，B組和C組APQ4免疫組化評分無顯著差異。Manley等[19]進(jìn)行的腦缺血損傷實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，剔除AQP4基因后的小鼠腦水腫形成程度較對照組明顯減輕，小鼠的神經(jīng)功能缺損程度也相應(yīng)地減輕。Igarashi等[20]采用AQP4抑制劑 TGN-020預(yù)處理腦缺血小鼠模型，發(fā)現(xiàn)抑制腦缺血小鼠AQP4的表達(dá)可減輕缺血后腦水腫和腦梗死程度。推測LIPUS刺激可能引起腦組織的血管舒張，進(jìn)而增強(qiáng)大腦受損區(qū)域的血流，抑制細(xì)胞毒性水腫減輕細(xì)胞腫脹，使細(xì)胞間隙的縮小有所改善，減緩rADC值下降，使AQP4表達(dá)下調(diào)，從而減輕腦水腫。LIPUS對超急性早、晚期腦缺血均有明顯的治療效果。dMCAO后9 h給予LIPUS刺激，AQP4表達(dá)及rADC值與對照組比較均無顯著差異。分析隨著缺血時(shí)間延長到9 h后，會出現(xiàn)胞膜破裂，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器等有形結(jié)構(gòu)破壞，缺血區(qū)酸中毒，并導(dǎo)致不可逆的缺血性腦損傷[21-22]，因此 LIPUS對急性期腦缺血治療效果不明顯。

本研究發(fā)現(xiàn)，盡管dMCAO模型大鼠腦組織中AQP4表達(dá)可以反映 LIPUS治療大鼠超急性期及急性期腦缺血后腦水腫的變化，但本研究對LIPUS影響 AQP4的機(jī)制尚不十分清晰，對 AQP4的極性表達(dá)未進(jìn)行深入探討。下一步將繼續(xù)對AQP4蛋白進(jìn)行更精細(xì)化的研究，為治療腦缺血水腫提供新思路，為研發(fā)理想的腦缺血治療方案提供新的靶標(biāo)。