孫佳，李曉婷，張來運(yùn)，楊磊，李竹林

1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院放射科，北京 100020；2.北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院放射科，北京 100142； *通訊作者 孫佳xnqiuqiu@163.com

胃癌的病死率居中國惡性腫瘤第2位，其在發(fā)展、轉(zhuǎn)歸過程中的生物學(xué)行為體現(xiàn)出癌腫的惡性度及侵襲性，反映了胃癌的本質(zhì)，直接影響胃癌的預(yù)后[1-2]。MRI對(duì)軟組織的分辨率高，可為胃癌生物學(xué)行為提供多種評(píng)價(jià)指標(biāo)[3]。擴(kuò)散加權(quán)成像（DWI）更能夠從分子水平反映病變內(nèi)部的結(jié)構(gòu)，在形態(tài)學(xué)發(fā)生變化前即可通過表觀擴(kuò)散系數(shù)（ADC）量化水分子擴(kuò)散的變化[4-6]。生物發(fā)光成像不僅可以定性反映腫瘤細(xì)胞的存在，利用光子數(shù)還可以敏感地定量分析瘤體內(nèi)細(xì)胞活性的變化[7-9]。DWI-ADC與光字?jǐn)?shù)均為胃癌生物學(xué)行為變化提供了新的早期評(píng)價(jià)指標(biāo)。本研究聯(lián)合 MRI與光學(xué)成像，通過對(duì)胃癌小鼠移植瘤進(jìn)行體內(nèi)動(dòng)態(tài)觀察，評(píng)價(jià)胃癌生物學(xué)行為的演變。

1 材料與方法

1.1 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)與動(dòng)物模型建立 采用低分化胃腺癌BGC-823細(xì)胞株，在RPMI 1640培養(yǎng)基中使用胎牛血清培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度（37.0±2.0）℃，pH 7.2，5% CO2。選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制成PBS懸液。

雌性Balb/c裸小鼠5只，4～6周齡。將BGC-823細(xì)胞懸液200 μl注入小鼠右腋下皮下組織內(nèi)，建立皮下移植瘤模型。

手術(shù)切除1只小鼠皮下瘤，選取腫瘤實(shí)性部分切成約1 mm3的組織塊。選取正常雄性Balb/c裸小鼠5只，4～6周齡，取腹部左正中旁切口，將1 mm3組織塊種植于胃前壁肌層，建立胃癌的原位移植瘤模型[10]。

1.2 MRI掃描與分析 荷瘤小鼠均行 GE Discovery MR750 3.0T MR基線掃描，使用8通道高清腕關(guān)節(jié)線圈。T1WI：TR 400 ms，TE 12 ms；T2WI：TR 3381 ms，TE 58 ms。軸位視野（FOV）60 mm×30 mm、冠矢狀位FOV 60 mm×60 mm。DWI-EPI序列（b=0、1000 s/mm2）：TR 2000 ms，TE 75 ms，F(xiàn)OV 80 mm×60 mm。所有序列層厚均為2 mm。T2WI圖像測(cè)量腫瘤面積，DWI圖像測(cè)量腫瘤ADC值。由2名具有10年工作經(jīng)驗(yàn)的放射科主治醫(yī)師獨(dú)立測(cè)量獲得結(jié)果，并取平均值。感興趣區(qū)勾畫避開腫瘤壞死部分。

1.3 生物發(fā)光成像 通過陽離子脂質(zhì)體法對(duì) BGC-823細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，至轉(zhuǎn)染效率達(dá)95%以上。Xenogen IVIS光學(xué)成像系統(tǒng)，皮下移植瘤小鼠分別于移植后第5、9、13、17、21、25、28天進(jìn)行光學(xué)成像，原位移植瘤小鼠分別于移植后第7、10、14、21、28、35、42天進(jìn)行光學(xué)成像。荷瘤小鼠全部進(jìn)行光學(xué)的基線觀察，排除背景光影響。皮下移植瘤觀察截止于移植后第4周，原位移植瘤觀察截止于移植后第6周。

1.4 病理學(xué)切片染色 將小鼠移植瘤、胃、肝、脾、胰腺、雙腎、小腸、結(jié)腸、后腹膜及腸系膜、雙肺、大腦、小腦、胸椎、腰椎等標(biāo)本進(jìn)行HE染色，實(shí)質(zhì)性器官間隔0.2 cm進(jìn)行切割，石蠟包埋，切片厚度4 μm。判斷移植瘤觀察末期腫瘤內(nèi)活性組織、壞死情況、腫瘤對(duì)鄰近組織結(jié)構(gòu)的侵襲性及轉(zhuǎn)移情況。

2 結(jié)果

2.1 皮下移植瘤和原位移植瘤的大小、DWI-ADC值及光子計(jì)數(shù)動(dòng)態(tài)變化 MRI皮下移植瘤截面積隨時(shí)間不斷增大，皮下移植瘤截面積-時(shí)間曲線斜率無明顯變化（圖 1A）；原位移植瘤的面積隨時(shí)間不斷增大，第 30天后腫瘤截面積-時(shí)間曲線出現(xiàn)平臺(tái)（圖1B）。

皮下移植瘤的ADC值先逐漸下降，于第 13天ADC值-時(shí)間曲線出現(xiàn)平臺(tái)，然后反向上升（圖1C）；原位移植瘤ADC值-時(shí)間曲線的變化相似，于第28天腫瘤ADC值出現(xiàn)平臺(tái)，繼而反向上升，但轉(zhuǎn)折點(diǎn)的出現(xiàn)早于生物發(fā)光成像（圖1D）。

皮下移植瘤與原位移植瘤的光子數(shù)-時(shí)間曲線隨時(shí)間增加，光子數(shù)升高后出現(xiàn)下降。皮下移植瘤光子數(shù)-時(shí)間曲線的轉(zhuǎn)折點(diǎn)出現(xiàn)于第17天（圖1E）；而原位移植瘤的轉(zhuǎn)折點(diǎn)出現(xiàn)于第35天（圖1F）。

2.2 皮下移植瘤和原位移植瘤的生長(zhǎng)方式與轉(zhuǎn)移MRI胃癌小鼠皮下移植瘤始終呈膨脹性生長(zhǎng)，邊界清楚，無向下浸潤。觀察結(jié)束后切除皮下移植瘤，瘤體均具有完整的包膜，對(duì)鄰近組織無浸潤。5枚原位移植瘤早期邊界清晰，接種第28天瘤體與鄰近器官分界欠清，交界面凹凸不平，呈浸潤性生長(zhǎng)。觀察結(jié)束切除原位移植瘤，瘤體與周圍器官均粘連嚴(yán)重，連同鄰近組織共同切除。各原位移植瘤轉(zhuǎn)移情況見表1。

移植瘤的轉(zhuǎn)移MRI中，結(jié)合軸位、冠狀位、矢狀位，皮下移植瘤與原位移植瘤小鼠均未見轉(zhuǎn)移。在生物發(fā)光成像中，5只皮下移植瘤小鼠與5只原位移植瘤小鼠在移植瘤部位以外均未見發(fā)光。病理切片中，皮下移植瘤小鼠的各部位均未見轉(zhuǎn)移。原位移植瘤小鼠肝、脾、胰腺、食管和結(jié)腸可見受侵，腸系膜及后腹膜內(nèi)可見廣泛脈管癌栓，各小鼠受累情況見表 1。但MRI與光學(xué)成像均未見顯示。

圖1 胃癌皮下移植瘤與原位移植瘤的截面積-時(shí)間、ADC值-時(shí)間及光子數(shù)-時(shí)間曲線。A、C、E為皮下移植瘤；B、D、F為原位移植瘤

表1 原位瘤累及深度及全身受累部位

3 討論

通過動(dòng)態(tài)觀察得知，皮下移植瘤截面積-時(shí)間曲線與光子數(shù)-時(shí)間曲線的主要形態(tài)差別在于光子數(shù)曲線存在轉(zhuǎn)折點(diǎn)（約第17天），與既往研究結(jié)果相似[11-12]，光子數(shù)在腫瘤生長(zhǎng)早期與腫瘤負(fù)荷密切相關(guān)，后期兩者相關(guān)性不再可靠。這是由于生物發(fā)光光學(xué)信息來源于細(xì)胞內(nèi)部報(bào)告基因，決定了其高度特異性[7,13-14]。因此，光學(xué)信號(hào)的強(qiáng)弱可以評(píng)價(jià)腫瘤內(nèi)活性細(xì)胞的變化[7-9]。早期腫瘤增殖活躍，瘤內(nèi)以實(shí)質(zhì)細(xì)胞為主，光學(xué)信號(hào)呈逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)，腫瘤繼續(xù)生長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)間質(zhì)逐漸增多，出現(xiàn)大量新生血管及纖維，并可見出血，而這些間質(zhì)成分參與構(gòu)成腫瘤的大小并不參與光學(xué)信號(hào)的發(fā)出[11]。同時(shí)，隨著腫瘤進(jìn)一步生長(zhǎng)，造成血供不足，瘤內(nèi)出現(xiàn)大量壞死，壞死組織并不能發(fā)出光學(xué)信號(hào)，以上因素共同導(dǎo)致隨著腫瘤截面積的進(jìn)一步增大，光學(xué)信號(hào)值卻下降[15]。因此，與生物發(fā)光成像相比，MRI的截面積曲線可以更好地反映腫瘤的生長(zhǎng)速度。但光子數(shù)的曲線特點(diǎn)卻與ADC值曲線類似，均出現(xiàn)轉(zhuǎn)折點(diǎn)。但ADC值-時(shí)間曲線的轉(zhuǎn)折點(diǎn)出現(xiàn)得更早（約第9天），且于第13天出現(xiàn)平臺(tái)，然后反向上升。ADC值反映了組織內(nèi)水分子的擴(kuò)散受限程度，由于擴(kuò)散受限程度越大，ADC值越低，腫瘤生長(zhǎng)早期異常增殖明顯，擴(kuò)散受限逐漸加重，故ADC值逐漸下降。隨著腫瘤進(jìn)一步生長(zhǎng)，細(xì)胞質(zhì)水分喪失，細(xì)胞間質(zhì)中的膠原、基質(zhì)腫脹、崩解和斷裂均使水分子擴(kuò)散受限得到緩解，ADC值停止繼續(xù)下降，曲線出現(xiàn)轉(zhuǎn)折點(diǎn)，生長(zhǎng)末期細(xì)胞核出現(xiàn)濃縮、碎裂和溶解，壞死的細(xì)胞和崩解的間質(zhì)融合液化，ADC值反向上升。ADC值-時(shí)間曲線轉(zhuǎn)折點(diǎn)的出現(xiàn)早于光子數(shù)-時(shí)間曲線，提示腫瘤細(xì)胞在徹底失活前（光學(xué)信號(hào)消失前），其所處的微環(huán)境可能已經(jīng)發(fā)生變化，ADC值能夠更敏感地反映組織結(jié)構(gòu)的變化，與既往研究結(jié)果相似[16-18]，腫瘤的生長(zhǎng)動(dòng)力曲線并不能很好地反映瘤內(nèi)成分的變化；而ADC值則可以反映細(xì)胞的結(jié)構(gòu)改變，是早期預(yù)測(cè)腫瘤壞死的敏感指標(biāo)。DWI信號(hào)的變化可以反映病理下不同結(jié)構(gòu)甚至分化程度。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ADC值反映細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化的敏感性高于反映細(xì)胞活性的生物發(fā)光成像。

對(duì)于原位移植瘤，后期由于受生長(zhǎng)空間限制，腫瘤生長(zhǎng)曲線出現(xiàn)平臺(tái)，曲線的轉(zhuǎn)折點(diǎn)與原位移植瘤光子數(shù)曲線轉(zhuǎn)折點(diǎn)出現(xiàn)的時(shí)間幾乎相同，從而可以判斷第35天原位移植瘤內(nèi)成分出現(xiàn)變化，而這一變化在ADC值-時(shí)間曲線中于第28天即可顯示。

T1WI、T2WI觀察原位移植瘤在生長(zhǎng)后期（第28天后）出現(xiàn)浸潤性，而皮下移植瘤始終呈膨脹生長(zhǎng)。既往研究發(fā)現(xiàn)，適宜的宿主環(huán)境是移植瘤克隆形成的必需條件[19-20]。受局部組織免疫反應(yīng)的影響，皮下移植瘤周圍易形成鼠源性纖維包膜[21]；而原位移植瘤模型由于細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境更接近實(shí)際情況，更有利于進(jìn)行腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究[8]。本研究中胃癌原位移植瘤生長(zhǎng)方式的變化可以更準(zhǔn)確地反映惡性腫瘤的生物學(xué)行為，而MRI能夠反映胃癌生長(zhǎng)方式的變化。本實(shí)驗(yàn)中，MRI與光學(xué)成像均未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移。通過鏡下觀察發(fā)現(xiàn)癌栓長(zhǎng)徑約0.1～0.3 mm，且多位于小鼠體內(nèi)較深部，截面內(nèi)腫瘤細(xì)胞數(shù)約2×102個(gè)，故病灶體積較小、脈管內(nèi)腫瘤細(xì)胞數(shù)量過少等因素致使脈管內(nèi)微轉(zhuǎn)移灶很難通過生物發(fā)光成像在體表被探及[22-23]。同時(shí)MR的體素大小也限制了轉(zhuǎn)移灶在MRI中的顯示。

由于本研究為腫瘤連續(xù)在體動(dòng)態(tài)觀察，故僅進(jìn)行了終點(diǎn)時(shí)的影像-病理對(duì)照，對(duì)于腫瘤生長(zhǎng)進(jìn)程中的病理對(duì)照有待進(jìn)一步展開工作探討。

總之，MRI及光學(xué)成像可以評(píng)價(jià)胃癌生物學(xué)行為的演變。DWI-ADC與生物發(fā)光成像均可以早期提示腫瘤內(nèi)活性成分的變化，且DWI-ADC的敏感性高于生物發(fā)光成像。