鄭麗莉

(山東協(xié)和學(xué)院，山東 濟(jì)南 250109)

心肌梗死在心血管疾病中死亡率最高，且發(fā)病年齡呈年輕化趨勢(shì)[1]。治療性血管新生成為目前心梗治療的新途徑，該方法通過(guò)藥物治療促進(jìn)缺血心肌微血管形成和冠狀動(dòng)脈分支或側(cè)支循環(huán)的建立，減少心肌細(xì)胞的壞死和凋亡，促進(jìn)心肌修復(fù)。芎歸六君子湯在《醫(yī)學(xué)正傳》六君子湯基礎(chǔ)上，加味補(bǔ)血活血之當(dāng)歸、川芎組成，是治療脾胃氣虛，痰瘀內(nèi)阻的常用方藥。前期研究[2]顯示，冠心病與脾胃具有相關(guān)性；芎歸六君子湯能改善心肌梗死大鼠胃腸道功能和心臟功能，減少梗死面積；調(diào)節(jié)血管新生相關(guān)因子如VEGF、FGF、MMP、TIMP、G-CSF等，促進(jìn)梗死心肌邊緣微血管再生。本研究在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析芎歸六君子湯對(duì)大鼠心肌邊緣Akt蛋白與基因的影響，探討芎歸六君子湯促進(jìn)缺血心肌微血管再生的機(jī)制是否與PI3K/Akt通路有關(guān)，為臨床治療提供客觀依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD雄性大鼠60只，SPF級(jí)，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)自濟(jì)南市朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，合格證號(hào)SCXK(魯)20140007。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

1.2.1 中藥材來(lái)源

建聯(lián)藥店提供，山東中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室鑒定。人參、白術(shù)、茯苓、炙甘草、陳皮、姜半夏、川芎、當(dāng)歸，按3∶3∶3∶2∶1∶2∶3∶3比例，3次煎煮混合，水浴箱60 ℃濃縮，滅菌，1 mL藥液相當(dāng)于0.63 g生藥。

1.2.2 對(duì)照藥

消心痛，國(guó)藥準(zhǔn)字H19991039，魯南貝特制藥。復(fù)方丹參滴丸，國(guó)藥準(zhǔn)字Z10950111，天津天士力公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)器材

Image-Pro PlusVersion4.5.1圖像分析系統(tǒng)；Synergy2酶標(biāo)儀(Thermo multiskan ascent公司)；電泳儀(Bio-rad公司)； ABI PRISM 7000實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)試劑

小鼠抗大鼠CD34單抗(美國(guó)Santa)；SP免疫組化試劑盒(批號(hào)12108A08)；羊抗兔二抗(Jackson公司)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(日本TaKaRa公司，批號(hào)D305)；Akt，p-Akt抗體(北京博奧森生物技術(shù)公司，批號(hào)依次為bs-2056R，Thr308)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組

隨機(jī)分為5組，即假手術(shù)組、模型組、消心痛組、復(fù)方丹參滴丸組、芎歸六君子湯組。

2.2 給藥方法

假手術(shù)組、模型組、消心痛組、復(fù)方丹參滴丸組、芎歸六君子湯組，每日分別灌胃鹽水10 mL/kg、鹽水10 mL/kg、消心痛4.2 mg/kg、復(fù)方丹參滴丸85 mg/kg、芎歸六君子湯6.3 g/kg，共4周。

2.3 模型制備

大鼠麻醉，仰臥，連呼吸機(jī)，氣管插管。備皮消毒，胸部第2～3肋間偏左4～5 mm處開(kāi)胸，剪開(kāi)心包，擠出心臟，迅速結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，記錄肢體II導(dǎo)聯(lián)心電圖。結(jié)扎線下心跳減弱、顏色變白，ST段弓背抬高顯著，提示造模成功。假手術(shù)組穿線不結(jié)扎。術(shù)后肌注青霉素40萬(wàn)U，連續(xù)3 d[3]。

2.4 檢測(cè)指標(biāo)與方法

2.4.1 心功能測(cè)定

連續(xù)測(cè)量3個(gè)心動(dòng)周期內(nèi)的左室內(nèi)徑、室壁厚度和血流速度，計(jì)算左室內(nèi)徑縮短率(LVFS)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)，結(jié)果為平均值。探頭頻率10～12 MHz[4]。

2.4.2 心肌梗死邊緣區(qū)微血管密度(MVD)測(cè)定

取梗死邊緣心肌，制片，SP法染色，一抗?jié)舛?∶100。評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)：找到心梗邊緣區(qū)，400倍視野下計(jì)數(shù)，棕黃色的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù)為一個(gè)血管，但管腔超過(guò)8個(gè)紅細(xì)胞、帶有較厚肌層的血管除外。每張切片隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野,其均值即為該樣本的MVD 值[5]。

2.4.3 Western blotting法檢測(cè)梗死邊緣心肌總Akt(T-Akt)、磷酸化Akt( P-Akt)蛋白的表達(dá)

標(biāo)本100 mg，提總蛋白，BCA 法測(cè)定含量。取50 μg總蛋白，聚丙烯酰胺變性凝膠電泳分離蛋白，PVDF轉(zhuǎn)膜，于1% 脫脂奶粉TBST緩沖液封閉，加一抗，4℃過(guò)夜，加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育，洗膜，顯色，凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果，以β-actin為內(nèi)參。以P-Akt、T-Akt的條帶與β-actin的光密度比值表示蛋白的表達(dá)水平。

2.4.4 實(shí)時(shí)熒光定量

RT-PCR 檢測(cè)檢測(cè)梗死邊緣心肌Akt mRNA表達(dá)：取梗死邊緣組織，TrizoL試劑盒提取總RNA，電泳鑒定RNA并定量，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)參數(shù):95℃預(yù)變性15 min，1個(gè)循環(huán);95℃變性10 s，60℃20 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。采用相對(duì)定量2-△△Ct法比較各組Akt mRNA表達(dá)差異[6]。大鼠Akt上游引物5,-TAGGCATCCCTTCCTTACAGC-3，下游引物5,-CGCTCACGAGACAGGTGGA-3，退火溫度60℃，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度113 bps；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參照，大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)上游引物5,-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3，下游引物5,-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3，退火溫度60℃，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度95 bps。

2.5 統(tǒng)計(jì)方法

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 芎歸六君子湯對(duì)心梗大鼠心功能的影響

與假手術(shù)組相比，模型對(duì)照組超生心動(dòng)圖顯示LVEF、LVFS降低，說(shuō)明心臟功能顯著下降(P<0.01)。給藥后各組顯著改善，其中芎歸六君子湯組效果最為顯著(P<0.01)。見(jiàn)表1。

3.2 芎歸六君子湯對(duì)大鼠心梗邊緣微血管數(shù)量和密度的影響

與假手術(shù)組相比，模型對(duì)照組新生微血管數(shù)量顯著增加(P<0.01)，說(shuō)明心肌梗死后自發(fā)性微血管新生進(jìn)行修復(fù)。各用藥組微血管數(shù)量較之模型對(duì)照組顯著增加(P<0.01)，且芎歸六君子湯組微血管數(shù)量最多(P<0.01)。見(jiàn)表1。

分組LVEF(%)LVFS(%)MVC/MVD假手術(shù)組79.35±5.1548.23±3.5411.45±1.33模型對(duì)照組 42.36±3.24ΔΔ21.39±2.65ΔΔ32.57±3.52ΔΔ消心痛組56.81±4.53▲▲26.16±3.23▲▲46.51±4.57▲▲丹參滴丸組58.37±4.27▲▲28.73±2.31▲▲51.28±4.33▲▲芎歸六君子湯組68.53±5.13▲▲★★●●37.56±2.57▲▲★★●73.65±5.14▲▲★★●●

注：與假手術(shù)組相比，ΔΔP<0.01；與模型對(duì)照組相比，▲▲P<0.01；與消心痛組相比，★★P<0.01；與丹參滴丸組相比，●P<0.05,●●P<0.01

3.3 芎歸六君子湯對(duì)梗死邊緣心肌組織Akt蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組相比，模型對(duì)照組總Akt、磷酸化Akt及二者比值均顯著升高(P<0.05)，說(shuō)明心肌梗死后Akt蛋白表達(dá)增多。各用藥組較之模型對(duì)照組顯著升高，芎歸六君子湯組效果顯著優(yōu)于消心痛組及丹參滴丸組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

分組nT-AktP-AktP-Akt/T-Akt假手術(shù)組120.428 1±0.014 20.102 6±0.012 10.239 1±0.011 2模型對(duì)照組120.520 8±0.025 1Δ0.180 1±0.013 4Δ0.345 7±0.007 9Δ消心痛組120.601 7±0.015 8▲0.291 4±0.015 2▲0.484 3±0.013 5▲丹參滴丸組120.616 0±0.016 5▲0.301 6±0.015 6▲0.489 6±0.015 1▲芎歸六君子湯組120.755 4±0.014 8▲▲★●0.426 9±0.014 7▲▲★●0.565 1±0.013 4▲▲★●

注：與假手術(shù)組相比，ΔP<0.05；與模型對(duì)照組相比，▲P<0.05,▲▲P<0.01；與消心痛組相比，★P<0.05；與丹參滴丸組相比，●P<0.05

3.4 芎歸六君子湯對(duì)梗死邊緣心肌組織Akt mRNA表達(dá)的影響

與假手術(shù)組相比，模型對(duì)照組Akt mRNA表達(dá)升高顯著(P<0.01)。各給藥組均有增加，其中芎歸六君子湯組增加最為顯著(P<0.05)。見(jiàn)表3。

4 討論

心肌梗死是指在冠狀血管病變基礎(chǔ)上，冠脈的血流急劇減少或中斷，使心肌長(zhǎng)時(shí)間缺血缺氧，最終導(dǎo)致心肌壞死。心梗發(fā)生后，凋亡相關(guān)機(jī)制首先啟動(dòng)，凋亡復(fù)合體形成，多種蛋白酶被活化，進(jìn)而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。急劇缺血缺氧導(dǎo)致肌原纖維斷裂，肌絲增寬，左室進(jìn)行性擴(kuò)張，心功能下降。治療性血管再生可促進(jìn)冠脈側(cè)支循環(huán)的建立和開(kāi)放，為缺血心肌提供血供，減少心肌細(xì)胞的凋亡，有效改善心功能，成為心梗治療的研究熱點(diǎn)。

分組n△Ct△△Ct2-△△Ct假手術(shù)組122.523 3±0.009 8 0±0.009 8 1±0.006 8模型對(duì)照組12 1.458 9±0.025 3-1.064 4±0.025 32.091 7±0.036 8ΔΔ消心痛組121.282 4±0.052 6-1.241 0±0.052 62.365 0±0.085 7丹參滴丸組120.946 3±0.065 6-1.577 1±0.065 62.986 5±0.133 8▲▲★芎歸六君子湯組120.573 3±0.068 9-1.950 0±0.068 93.867 8±0.186 0▲▲★★●

注：與假手術(shù)組相比，ΔΔP<0.01；與模型對(duì)照組相比，▲▲P<0.01；與消心痛組相比，★P<0.05,★★P<0.01；與丹參滴丸組相比，●P<0.05

LVEF和LVFS是反映心功能的重要指標(biāo)。LVEF是指心室舒張末，每搏輸出量與心室容積的比例，反映心室的收縮力和射血能力。LVFS代表左心室環(huán)形心肌的收縮能力[7]。研究顯示，芎歸六君子湯給藥4周后，LVEF和LVFS顯著提高，說(shuō)明左室收縮和舒張功能以及室壁順應(yīng)性顯著改善。

MVD指每個(gè)視野內(nèi)微血管數(shù)量，能夠較準(zhǔn)確反映梗死心肌微血管新生的情況。CD34是高度糖基化的跨膜糖蛋白，選擇性地表達(dá)于造血干/祖細(xì)胞表面，是血管生長(zhǎng)過(guò)程中的內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志物，會(huì)隨著細(xì)胞的成熟逐漸減弱至消失。研究結(jié)果顯示，模型組微血管數(shù)量顯著高于假手術(shù)組，說(shuō)明心梗后出現(xiàn)了自發(fā)性代償性微血管新生，與心肌缺血缺氧、炎癥反應(yīng)等有關(guān)，但此種再生非常緩慢，難以形成有效的側(cè)支循環(huán)。各給藥組尤其是芎歸六君子湯組微血管數(shù)量顯著高于模型對(duì)照組，說(shuō)明給藥后，微血管數(shù)量增加，更能及時(shí)促進(jìn)側(cè)支循環(huán)形成，增加血供。

血管新生是一個(gè)高度受控的復(fù)雜的程序化的級(jí)聯(lián)過(guò)程，血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移是基礎(chǔ)性環(huán)節(jié)，多種內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和信號(hào)通路參與其中。心肌缺血缺氧會(huì)激活PI3K/Akt 信號(hào)傳導(dǎo)通路，即磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PKB或Rac)通路。該通路廣泛存在于細(xì)胞中，在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、遷移等多種生理活動(dòng)發(fā)揮關(guān)鍵作用，其功能涉及細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等諸多方面。

PI3K下游有多種效應(yīng)分子，其中Akt處于通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。許多生長(zhǎng)因子、激素、細(xì)胞因子與其相對(duì)應(yīng)的受體結(jié)合，活化脂質(zhì)激酶 PI3K，并且激活 Akt，在細(xì)胞質(zhì)膜中生成 PIP3。Akt與 PIP3 相結(jié)合，導(dǎo)致 Akt 轉(zhuǎn)位至細(xì)胞膜?；罨腁kt能夠通過(guò)下游多個(gè)凋亡、增殖等調(diào)控因子，減少心肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)血管新生，減輕心肌損傷。第一，Akt能促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2 生成，抑制 Bax、Bad 及 caspase等促凋亡蛋白的形成，或者使 GSK-3β(糖原合成酶激酶 3β)發(fā)生磷酸化而失去誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力，多途徑抑制細(xì)胞凋亡，發(fā)揮心肌保護(hù)作用[8]。第二，Akt可以介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。VEGF和bFGF可以增加微血管的通透性，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，是參與血管新生的重要生長(zhǎng)因子。VEGF通過(guò)整合素相關(guān)激酶(ILK)誘導(dǎo)Akt/PKB的磷酸化，抑制Akt/PKB蛋白降解，增加絲/蘇氨酸激酶的穩(wěn)定性，從而誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增生和移行[9]。PI3K/Akt可以激活激酶鼠雙微體基因-2 編碼蛋白，促進(jìn)細(xì)胞分泌 VEGF；同時(shí)，VEGF可反饋性激活PI3K/Akt通路，進(jìn)一步促進(jìn)血管新生[10]。bFGF與FGFRl受體結(jié)合，通過(guò)PI3K/Akt通路將信號(hào)傳入細(xì)胞核內(nèi)，促進(jìn)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和遷移[11]。

芎歸六君子湯源于《醫(yī)學(xué)正傳》六君子湯加味當(dāng)歸、川芎而成，功能補(bǔ)氣化痰活血，多用于治療脾胃疾病證屬氣虛痰瘀者。該研究用于治療心肌梗死，人參、白術(shù)、茯苓、甘草健脾補(bǔ)氣，氣有推動(dòng)之功效，可以改善心臟功能，促進(jìn)射血能力。氣能生血，脾胃為氣血生化之源，促進(jìn)血液化生，促進(jìn)微血管新生；心梗后，氣血瘀滯，瘀血不去，新血不生，通過(guò)川芎、當(dāng)歸和半夏等活血化痰，祛除痰瘀，加之當(dāng)歸兼具補(bǔ)血活血之效，進(jìn)一步促進(jìn)新血生成，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果微血管新生、側(cè)支循環(huán)建立相吻合。關(guān)于對(duì)PI3K/Akt通路的影響，說(shuō)明中藥可以通過(guò)多途徑、多靶點(diǎn)對(duì)疾病進(jìn)行干預(yù)，體現(xiàn)了中醫(yī)整體論證的優(yōu)勢(shì)。

綜合以上研究，可初步推斷，芎歸六君子湯促進(jìn)梗死心肌血管新生的原理，可能與PI3K/Akt 信號(hào)通路激活，皮細(xì)胞增殖、分化和遷移相關(guān)。前期研究顯示，芎歸六君子湯能顯著促進(jìn)VEGF和bFGF在心肌中的蛋白和基因表達(dá)，結(jié)合本研究結(jié)果，PI3K/Akt 信號(hào)通路的激活，可能依賴于VEGF和bFGF與相應(yīng)特異性受體的結(jié)合。關(guān)于VEGF和bFGF與PI3K/Akt通路的相關(guān)性，尚有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探討。