李曉亮，魏娜，王鵬程，匡海學(xué)，王秋紅

(1.海南醫(yī)學(xué)院，海南 海口 571199；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；3.廣東藥科大學(xué)，廣東 廣州 510006)

商陸radix phytolaccae又名夜呼(《本經(jīng)》)、野蘿卜、為商陸科植物商陸phytolaccaacinosaroxb.或垂序商陸PhylolaccaamericanaL.的根，多生于樹(shù)林下、林緣、路旁、山溝等濕潤(rùn)地方，我國(guó)大部分地區(qū)都有分布[1]。作為傳統(tǒng)中藥，商陸具有逐水消腫、通利二便、解毒散結(jié)的功效；主治水腫脹滿(mǎn)、二便不通，外治癰腫瘡毒等[2]。商陸中含有多種化學(xué)成分，主要為三萜皂苷類(lèi)、多糖類(lèi)、酚酸類(lèi)、甾醇類(lèi)、黃酮類(lèi)、鞣質(zhì)類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)以及脂溶性成分等[3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)商陸中所含多糖是其增強(qiáng)免疫、抗腫瘤和保護(hù)造血功能的活性成分。課題組前期對(duì)商陸多糖進(jìn)行了深入的研究，將商陸總多糖分離純化得到7種商陸均一多糖[4]。本文通過(guò)觀察商陸均一多糖對(duì)ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞和LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞增殖的影響，為闡明商陸多糖的免疫作用機(jī)制提供參考。

1 材料與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物

商陸總多糖以及7種商陸均一多糖PAP-1、PAP-2、PAP-3、PAP-4、PAP-5、PAP-6和PAP-7均由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)昆明小鼠，雄性，體質(zhì)量(20±2)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全評(píng)價(jià)中心提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

RPMI-1640培養(yǎng)液(美國(guó)Hyclone公司);胎牛血清FBS(美國(guó)Hyclone公司);雙抗(含青霉素和鏈霉素各10000 U·mL-1)(吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司);二甲基亞砜(DMSO)(美國(guó)sigma公司);噻唑藍(lán)(MTT)(美國(guó)sigma公司);刀豆蛋白(ConA)(美國(guó)sigma公司);脂多糖(LPS)(美國(guó)sigma公司);小鼠IL-2細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒(武漢博士德公司，中國(guó));小鼠IL-4細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒(武漢博士德公司，中國(guó));小鼠IL-6細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒(武漢博士德公司，中國(guó));小鼠IFN-γ細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒(武漢博士德公司，中國(guó))。

1.4 儀器與設(shè)備

MS204S分析天平(瑞士梅特勒-托利多儀器公司);CKX41倒置顯微鏡(日本Olympus公司);SW-CJ-2D潔凈工作臺(tái)(蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司);MCO-18M二氧化碳培養(yǎng)箱(日本三洋有限公司);Synergy Mx多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司);TDL-4臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

2 方法

2.1 試劑的配制

含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)液)：量取89 mL RPMI1640培養(yǎng)基，加入10 mL胎牛血清，再加入1 mL雙抗，混合均勻，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，4℃冰箱中保存。

ConA溶液：精密稱(chēng)量ConA 3.5 mg溶于10 mL RPMI1640培養(yǎng)液(不含血清)中，濃度為0.35 mg/mL，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，-20℃冰箱中保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)，10倍稀釋為所用濃度。

LPS溶液：精密稱(chēng)量7 mg LPS溶于10 mL不完全RPMI1640培養(yǎng)液(不含血清)中，濃度為0.7 mg/mL，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，-20℃冰箱中保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)，10倍稀釋為所用濃度。

2.2 小鼠脾淋巴細(xì)胞的制備

參照文獻(xiàn)方法[5-6]，取雄性昆明種小鼠，頸椎脫臼法處死，于超凈臺(tái)中無(wú)菌取脾臟。將脾臟置于盛有RPMI1640培養(yǎng)基的平皿中剪碎，破碎的脾臟置于200目金屬篩網(wǎng)上，用注射器芯研磨透過(guò)篩網(wǎng)，完全培養(yǎng)基沖洗，制成脾細(xì)胞懸液。1 000 r·min-1離心10 min，加入紅細(xì)胞裂解液靜置3 min，1 000 r·min-1離心10 min以除去血紅細(xì)胞。RPMI1640培養(yǎng)基洗3次，每次1 000 r·min-1離心10 min，離心棄上清。用RPMI1640完全培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為4.8×106個(gè)/mL，臺(tái)盼藍(lán)染液檢測(cè)細(xì)胞的存活率，活細(xì)胞比率大于95%即可用于實(shí)驗(yàn)。

2.3 商陸多糖對(duì)小鼠T、B淋巴細(xì)胞增殖的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取各多糖樣品1～2 mg，溶于適量完全培養(yǎng)基中，濃度為4 mg/mL。使用前分別取適量上述多糖溶液稀釋至濃度為5 μg/mL、25 μg/mL和125 μg/mL。將多糖各個(gè)濃度100 μL/孔(陽(yáng)性對(duì)照ConA為5 μg/mL，LPS為10 μg/mL)，均設(shè)6個(gè)復(fù)孔，100 μL/孔，加入96孔培養(yǎng)板中，以RPMI-1640對(duì)照。每孔加細(xì)胞懸液100 μL，置37℃、5% CO2培養(yǎng)48 h，每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL，孵育4 h，棄掉上清液，再加入二甲亞砜100 μL，于微量振蕩器上緩慢作用10 min，在酶標(biāo)儀上于490 nm處測(cè)吸光度值。

2.4 商陸多糖對(duì)小鼠T、B淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響

制備小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×107個(gè)/mL，加入到96孔培養(yǎng)板中，設(shè)對(duì)照組、商陸總多糖組及均一多糖各組(PAP-X的終濃度為5、25、125 μg/mL)，每一質(zhì)量濃度4個(gè)復(fù)孔，置于37℃、含5%的CO2條件下分別培養(yǎng)48 h，收集上清液測(cè)定細(xì)胞因子含量。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 商陸多糖對(duì)小鼠T、B淋巴細(xì)胞增殖的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。由結(jié)果可知，商陸總多糖PAP在25 μg/mL、125 μg/mL的濃度下能夠顯著刺激脾淋巴細(xì)胞增殖(P<0.05)。七種商陸均一多糖中，PAP-2、PAP-4、PAP-5、PAP-6及PAP-7對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖產(chǎn)生顯著的增強(qiáng)作用，而PAP-1、PAP-3的不同濃度對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖影響不明顯(P>0.05)。

表1 商陸多糖對(duì)小鼠T、B淋巴細(xì)胞增殖活性的影響

注：與空白組相比，##P<0.01；與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01

3.2 商陸多糖對(duì)小鼠T、B淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。從結(jié)果可知，與空白組比較，商陸總多糖PAP在25 μg/mL、125 μg/mL的濃度下能夠顯著刺激脾細(xì)胞分泌IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ。七種商陸均一多糖中，PAP-2、PAP-4、PAP-5、PAP-6及PAP-7對(duì)小鼠脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子產(chǎn)生非常顯著的增強(qiáng)作用，而不同濃度的PAP-1、PAP-3對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子影響不顯著(P>0.05)。

組別濃度(μg/mL)IL-2(pg/mL)IL-4(pg/mL)IL-6(pg/mL)IFN-γ(pg/mL)空白組—46.33±6.16145.12±16.2592.24±9.9818.99±2.43PAP548.12±7.02147.05±17.3293.12±10.0219.24±3.052552.17±7.52*149.22±16.87102.45±10.14*23.11±3.21*12560.82±7.13**155.21±17.29*134.52±14.13**29.47±4.71**PAP-1545.71±5.42150.24±15.8189.85±8.1018.29±3.562548.23±4.27143.20±17.2795.31±9.0718.33±3.2912549.54±7.14151.03±19.2996.87±10.1119.28±4.41PAP-2545.42±4.05144.21±16.5194.58±9.3220.15±3.152548.51±5.57148.18±15.33105.31±10.07*22.09±2.78*12565.12±5.12**179.21±16.29**121.77±13.24**27.68±3.65**PAP-3546.26±6.20148.17±16.0890.27±8.2416.31±2.412547.03±6.35145.33±19.3692.38±9.3518.57±2.8512549.18±7.25150.23±20.3095.97±11.2519.47±3.54PAP-4547.02±4.24143.89±17.3493.36±9.5718.15±2.042550.25±5.05*146.34±16.67105.31±10.44*19.17±2.5712565.41±6.33**183.21±17.55**117.74±11.54**23.24±3.04*PAP-5548.28±5.57142.47±16.2790.36±9.6818.77±2.562549.32±6.31147.57±15.7899.47±10.55*18.17±2.1412551.14±5.73*194.07±19.45**117.74±11.54**22.14±3.14*PAP-6551.48±5.31*144.27±15.3599.78±9.98*19.07±2.962558.37±6.09**148.10±16.27106.37±11.64**22.17±2.56*12553.14±6.73*152.07±14.45*129.54±12.37**31.47±3.77**PAP-7547.42±5.21147.24±16.0694.78±10.9819.75±2.362550.35±6.21*145.57±15.3795.37±10.5820.09±2.7512564.03±7.52**151.88±15.35*116.37±12.57**25.47±3.57*

注：與空白組相比，*P<0.05，**P<0.01

4 討論

脾臟是機(jī)體最大的免疫器官，是免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)的重要器官，是T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的定居場(chǎng)所[7-8]。T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞是構(gòu)成機(jī)體免疫器官及系統(tǒng)的基本單位，在免疫應(yīng)答過(guò)程中起核心作用，其增殖是反映細(xì)胞免疫最直接的指標(biāo)[9]。活化的免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞經(jīng)刺激合成、分泌具有多種生物活性的細(xì)胞因子，如IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ等是機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中重要的調(diào)節(jié)因子。其中IL-2和IFN-γ主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，在誘發(fā)器官特異性自身免疫、器官移植排斥反應(yīng)和抗感染免疫中起著重要的免疫調(diào)節(jié)作用[10]。IL-2是由活化的T細(xì)胞產(chǎn)生的一種免疫調(diào)節(jié)因子，能夠促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖與分化，具有廣譜的免疫增強(qiáng)活性[11]。IL-4又稱(chēng)B細(xì)胞生長(zhǎng)因子，可增強(qiáng)IgG和IgE水平，也可促進(jìn)T細(xì)胞增殖。IL-6可誘導(dǎo)B細(xì)胞分化，還能與IL-1協(xié)同促進(jìn)T細(xì)胞增殖[12]。IFN-γ可增強(qiáng)NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞溶酶體的活力，從而起到免疫調(diào)節(jié)作用[13-14]。本研究采用小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，觀察商陸均一多糖對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，商陸總多糖以及均一多糖中的PAP-2、PAP-4、PAP-5、PAP-6和PAP-7對(duì)小鼠T、B淋巴細(xì)胞增殖具有顯著的促進(jìn)作用，并且能夠促進(jìn)細(xì)胞因子IL-2，IL-4，IL-6和IFN-γ的分泌。通過(guò)本研究，進(jìn)一步深化了對(duì)商陸多糖的免疫調(diào)節(jié)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和功效的認(rèn)識(shí)，為合理開(kāi)發(fā)商陸藥材提供理論依據(jù)。