張斌，徐春江，查芳芳，丁慎華，朱薇珊，錢雪梅

(復(fù)旦大學附屬中山醫(yī)院青浦分院，上海 201700)

原發(fā)性肝癌(primary liver cancer，PLC)是全球范圍內(nèi)最常見、最致命的腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率分別居所有腫瘤的第 7 位和第 4 位[1]，其5 年總生存率仍徘徊在3～5%之間，也是我國發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一[2-3]。肝癌患者早期往往癥狀缺乏，許多患者在體檢中無意發(fā)現(xiàn)，而一旦發(fā)現(xiàn)，常常是中晚期，甚至出現(xiàn)多臟器的轉(zhuǎn)移，治療難度很大，也缺乏特效的藥物治療。目前其發(fā)病機制還不十分清楚[4]，多認為與表觀遺傳改變、染色體改變、等位基因丟失、基因突變以及分子細胞通路的改變等多因素密切相關(guān)，因而積極探索肝癌發(fā)病機制，并研究早期診斷、預(yù)防和治療方法，是肝癌防治的關(guān)鍵。健脾解毒方由黨參、生黃芪及生白術(shù)等組成，具有益氣健脾、理氣解毒等多種作用，在臨床運用中顯示了較好的抗腫瘤作用，尤其對胃腸道腫瘤及肝癌等有較好的療效，為探索其機制，我們前期運用健脾解毒中藥對二甲基亞硝胺誘導大鼠肝癌模型進行了干預(yù)，發(fā)現(xiàn)中藥有延緩肝癌發(fā)病的作用，其機制部分與其下調(diào)大鼠肝組織PI3K/AKT信號通路的表達有關(guān)[5-6]。為進一步探討其機制，本研究采用健脾解毒中藥藥物血清對肝癌HepG2細胞進行干預(yù)，以探索健脾解毒中藥對肝癌細胞增殖及凋亡的影響，并探索PI3K/AKT信號通路與肝癌發(fā)病的相關(guān)性，為中藥抗肝癌作用提供依據(jù)。

1 材料及儀器

1.1 細胞株

中國科學院上海細胞庫為本研究提供了肝癌細胞HepG2，采用RPMI 1640進行細胞培養(yǎng)，其培養(yǎng)液中含有100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素及10%胎牛血清，其中培養(yǎng)箱條件設(shè)置為37℃、5%CO2，每隔3～4 d進行傳代，選擇對數(shù)生長期的肝癌細胞用于科研。

1.2 實驗大鼠

采用雄性SD大鼠，共20只，平均體質(zhì)量(100±10)g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院實驗動物房，該動物房為SPF級別，大鼠采取普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水，用于制備藥物血清。

1.3 藥物

中藥方劑由生黃芪、八月札、薏苡仁、野葡萄藤、豬苓、黨參、生白術(shù)及紅藤組成，藥物比例10∶10∶10∶8∶10∶5∶5∶8，水煎濃縮成每毫升含生藥1.30 g，保存于4℃冰箱中。PI3K抑制劑LY294002(美國Sigma-Aldrich公司)。

1.4 主要試劑

胎牛血清、0.25%胰酶-EDTA 、RPMI 1640培養(yǎng)液及小牛血清等購自Thermo Fisher Scientific公司；Sigma公司提供了二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑藍(MTT)及Trizol RNA試劑，上海碧云天生物技術(shù)有限公司為本研究提供了鼠抗人SEPP1單克隆抗體及兔抗人GAPDH單克隆抗體。

1.5 儀器設(shè)備

96孔培養(yǎng)板購自Nunc公司；電子天平為MettlerToledo公司產(chǎn)品。CO2培養(yǎng)箱購自Binder公司；多功能倒置相差顯微鏡的型號為(Olympus CK40)，ELX-800全自動酶標儀。

2 方法

2.1 中藥藥物血清制備

20只大鼠隨機分為兩組，其中A組：健脾解毒方藥物血清組，健脾解毒方按成人體重用藥劑量將生藥換算為50 g/kg的濃度，連續(xù)5 d給大鼠灌胃；B組為空白對照組，采取連續(xù)5 d給大鼠灌服等體積的生理鹽水。實驗前禁食12 h，末次給藥后2 h,腹主動脈采血，離心，分離血清，56℃滅活，使用0.22 μm微孔過濾除菌分裝，上述血清保存條件為-80℃冰箱。

2.2 細胞培養(yǎng)

采用10%胎牛血清的培養(yǎng)液進行肝癌細胞的培養(yǎng)，培養(yǎng)箱設(shè)置為37℃、5%CO2飽和濕度，每2～3 d進行傳代，換液48 h后收集細胞用于研究。實驗分組如下：①空白對照組；②空白血清組：加入體積分數(shù)為10%的空白血清；③中藥組(L)：加入體積分數(shù)為10%的中藥藥物血清；④中藥組(M)：加入體積分數(shù)為15%的中藥藥物血清；⑤中藥組(H):加入體積分數(shù)為20%的中藥;⑥LY294002組:加入終濃度50 μmol/L的LY294002。

2.3 細胞增殖測定

采取MTT法進行測定，取對數(shù)生長期的肝癌細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，細胞濃度為1×104，每孔約200 μL。培養(yǎng)24 h后，廢棄培養(yǎng)液，重新加入溫育液，于培養(yǎng)24 h及48 h時每孔加入20 μL的MTT 液(5 mg/mL)，培養(yǎng)4 h后廢棄上清，加入DMSO，采用酶標儀進行測定，取490 nm波長處測量吸光度(OD值)。計算抑制率(%)=(1-用藥組平均OD值/對照組平均OD值)×100%。

2.4 細胞凋亡率

收集培養(yǎng)的肝癌細胞，1 000 r/min離心5 min后，廢棄上清液，采用PBS進行清洗2次，將緩沖液、AnnexinⅤ-FITC 抗體及PI染液依次加入，在室溫下避光放置15 min，送流式細胞儀進行檢測。實驗重復(fù)3次。

2.5 蛋白表達檢測

采取Western blot法進行檢測，具體參考文獻[5]方法進行。重復(fù)檢測3次。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS15.0軟件進行統(tǒng)計分析，各組數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標準差(means±sd)進行表示，其中組間比較采用t檢驗方法，方差分析采用單因素法進行比較，結(jié)果按照P<0.05為統(tǒng)計有差異。

3 結(jié)果

3.1 健脾解毒中藥對肝癌細胞增殖的影響

表1對各組細胞增殖進行了比較，發(fā)現(xiàn)LY294002組及各中藥劑量組均有顯著抑制肝癌細胞增殖的作用，尤其是LY294002及高劑量中藥組的抑制作用最大(P<0.01)，其次為中低劑量中藥組。表明健脾解毒中藥藥物血清對肝癌細胞增殖有一定的抑制作用，尤其是中高劑量組抑制作用更加明顯。

表1 各組細胞增殖比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與LY294002組比較，△△P<0.01

3.2 健脾解毒中藥對肝癌細胞凋亡的影響

采用流式細胞儀比較了各組細胞的凋亡率，發(fā)現(xiàn)LY294002組及各劑量中藥組均有顯著促進肝癌細胞凋亡作用，尤其是LY294002組及中高劑量中藥組作用最強(P<0.01)，表明健脾解毒中藥藥物血清對肝癌細胞有促進凋亡作用(見表2及圖1)。

表2 各組肝癌細胞凋亡情況比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與LY294002組比較，△△P<0.01

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01圖1 各組細胞凋亡率比較

3.3 肝癌細胞AKT、PI3K蛋白表達

采用Western blot對各組肝癌細胞的AKT及PI3K蛋白表達情況進行了比較，發(fā)現(xiàn)LY294002組及中高劑量中藥組有顯著下調(diào)AKT及PI3K蛋白表達的作用，而低劑量中藥組僅對PI3K有輕度下調(diào)，對AKT表達影響不明顯(見表3及圖2)。上述研究表明健脾解毒中藥抑制肝癌細胞增殖可能與下調(diào)AKT及PI3K蛋白表達有關(guān)。

表3 各組細胞蛋白表達比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，；與LY294002組比較，△P<0.05,△△P<0.01

注：A.空白對照組；B.空白血清組；C.中藥組(L);D.中藥組(M);E.中藥組(H);F.LY294002組圖2 各組細胞蛋白表達情況

4 討論

肝癌的發(fā)生與等位基因丟失、染色體改變、基因突變、表觀遺傳改變以及分子細胞通路等多因素改變密切相關(guān)，其中針對分子細胞通路的研究受到很多學者的高度重視。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin、RAS和PI3K/AKT/mTOR信號通道與肝癌發(fā)病關(guān)系密切[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，在PI3K/AKT通道中，PI3K是一種脂類激酶，可以催化磷脂酰肌醇D3磷酸化，與細胞異常增殖有關(guān)。AKT是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，參與細胞增殖的調(diào)節(jié)、膜蛋白轉(zhuǎn)運、核糖體合成及蛋白質(zhì)降解等過程，是激活PI3K下游最主要的信號分子[9]，PI3K/AKT通路調(diào)控細胞代謝、蛋白合成、細胞增殖與凋亡等重要生理過程[10-13]，共同參與細胞增殖和存活的調(diào)節(jié)，其異常表達與多種腫瘤發(fā)病密切有關(guān)，也與肝癌發(fā)病密切相關(guān)[14-15]。因而該通道受到很多學者的重視，已經(jīng)針對該通道開發(fā)了PI3K抑制劑，AKT抑制劑和mTOR抑制劑等抗腫瘤藥物，大大改善了患者的病情發(fā)展，有很好的臨床運用前景。

中醫(yī)文獻中有“臌脹”“肝積”“癮瘕”“積聚”“黃疸”“脅痛”等名詞的記載都與肝癌相關(guān)，中醫(yī)對肝癌病因病機的認識，包括內(nèi)因及外因，其中內(nèi)因主要是勞倦內(nèi)傷、脾運失健、情志失調(diào)、志郁不達及肝失疏泄；外因歸為濕熱毒邪、內(nèi)侵肝膽、嗜好煙酒、化濕生熱及久蘊生毒。在病機方面認為肝脾腎三臟同病是發(fā)病的關(guān)鍵，逐漸出現(xiàn)肝郁脾虛血瘀，造成濕、熱、氣、血、毒聚結(jié)成塊，可形成肝積。健脾解毒方為上海中醫(yī)藥大學范忠澤教授的抗腫瘤經(jīng)驗方，經(jīng)過多年臨床研究，認為肝癌發(fā)生多由飲食不節(jié)(潔)、情志不遂、勞倦等多種因素引起邪毒內(nèi)生而引起，病機特點是本虛標實，本虛以脾氣虛為主，標實為邪毒(熱、濕熱毒邪)郁肝，治以益氣健脾，理氣解毒。范教授據(jù)此選擇了生黃芪、八月札、薏苡仁、野葡萄藤、豬苓、黨參、生白術(shù)、紅藤等進行組方，通過臨床運用，發(fā)現(xiàn)對包括肝癌、胃腸道腫瘤及肺癌等均有較好效果，目前此方已經(jīng)獲得國家專利。為了探索該方在肝癌防治中的作用機制，我們前期研究發(fā)現(xiàn)，該方可以較好的延緩DNE誘導大鼠肝癌的發(fā)生和發(fā)展，其機制部分與中藥調(diào)控PI3K/AKT信號通路的表達有關(guān)[5-6]。為進一步探索其機制，本課題在前期研究工作基礎(chǔ)上，選擇人肝癌HepG2細胞開展研究，發(fā)現(xiàn)該方有下調(diào)PI3K/AKT表達的作用。同時選擇PI3K抑制劑LY294002作為對照,發(fā)現(xiàn)中藥有類似LY294002作用,有抑制肝癌細胞增殖、促進細胞凋亡的作用，有進一步進行臨床推廣和研究的價值。