岳華梅，吳金平，陳細(xì)華，阮 瑞，李創(chuàng)舉

(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢 430223)

近年來，隨著魚粉價格的不斷上升，利用廉價蛋白源替代魚粉已經(jīng)成為當(dāng)前魚類營養(yǎng)與飼料學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[1]。雙低菜籽粕是雙低油菜籽經(jīng)制油加工后的副產(chǎn)品。油菜籽中通常含有30%～40%的菜油，經(jīng)榨取后可產(chǎn)生70%左右的餅粕。但是因其含有多種抗?fàn)I養(yǎng)因子和毒素，如單寧酸、芥子油甙等, 可影響氨基酸的利用、消化酶的活性、礦物鹽的利用，限制了菜粕在魚類飼料中的使用量[2]。研究表明，烏蘇鱧(Pseudobagrusussuriensis)[3]、大黃魚(Pseudosciaenacrocea)[4]和歐洲鰉(Husohuso)[5]對雙低菜粕的表觀消化率低于魚粉。這可能是由于雙低菜粕屬于植物性蛋白原料，其纖維素所占比例較高，而水生動物缺乏消化纖維素的酶系統(tǒng)[6]。當(dāng)飼料中選用植物性蛋白原料(如雙低菜粕)時，其是否影響魚類的蛋白質(zhì)代謝目前研究較少。

飼料在體內(nèi)蛋白酶的作用下水解生成多肽，多肽在肽酶(如氨肽酶N)的作用下水解生成小肽及游離氨基酸，最后被腸道轉(zhuǎn)運(yùn)載體(如小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體)吸收進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)。谷氨酸脫氫酶(GDH)是蛋白質(zhì)分解代謝和非必需氨基酸合成的關(guān)鍵酶，其活性與蛋白質(zhì)合成與分解有直接關(guān)系[7]。GDH 是通過催化體內(nèi)氨基酸氧化脫氨基作用來參與蛋白質(zhì)的分解，具體作用是催化谷氨酸氧化脫氨基生成α-酮戊二酸和氨，其輔酶是NAD+或NADP，也可以催化其逆反應(yīng)參與蛋白質(zhì)的合成[8]。

達(dá)氏鰉(H.dauricus)隸屬鱘形目鱘科鰉屬，主要分布于我國黑龍江阿穆爾河流域，成魚個體較大，屬偏肉食性魚類。近些年來隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，達(dá)氏鰉及其雜交種也作為經(jīng)濟(jì)魚類在全國范圍內(nèi)開展推廣養(yǎng)殖[9]。本團(tuán)隊(duì)前期研究表明，達(dá)氏鰉幼魚對雙低菜粕的粗蛋白及總氨基酸的表觀消化率顯著低于魚粉[10]。本研究旨在克隆蛋白質(zhì)代謝關(guān)鍵基因谷氨酸脫氫酶，分析其序列及組織表達(dá)特征，并試圖從分子層面探究雙低菜粕是否影響達(dá)氏鰉幼魚的蛋白質(zhì)代謝途徑，以期為菜粕在鱘魚飼料配方中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)飼料

所配制飼料配方及營養(yǎng)成分見表1。實(shí)驗(yàn)原料魚粉和雙低菜粕來自武漢大北農(nóng)水產(chǎn)科技有限公司。所有原料粉碎后過60目篩，在基礎(chǔ)飼料中添加0.4%的二氧化鈦?zhàn)鳛闃?biāo)記物，采用逐級混勻法，均勻混合到基礎(chǔ)飼料中，以測定其表觀消化率[10]。取70%添加二氧化鈦的基礎(chǔ)飼料和30%的菜粕，充分混勻后，添加20%左右的水，再次混勻，用小型絞肉機(jī)制成直徑約3 mm的條狀飼料。風(fēng)扇吹干后，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平(干重)

注：*每千克飼料中含有維生素：VB150 mg，VB2200 mg，VB650 mg，VB1220 mg， 葉酸15 mg，VC(30%) 325 mg，泛酸400 mg，肌醇1500 mg，D-生物素(2%) 5 mg，煙酸750 mg，VA 2.5 mg，VE(50%) 100 mg，VD32 mg，VK 20 mg。

**每千克飼料中含有礦物鹽：Ca(H2PO4)21 800 mg，KH2PO41 350 mg，NaCl 500 mg，MgSO4·7H2O 750 mg，NaH2PO4、2H2O 650 mg，KI 1.5 mg，COSO4·6H2O 2.5 mg，CuSO4·5H2O 15 mg， ZnSO4·7H2O 350 mg，F(xiàn)eSO4·7H2O 1 250 mg，MnSO4·4H2O 80 mg，Na2SeO36.00 mg。

1.2 實(shí)驗(yàn)魚養(yǎng)殖及樣品采集

達(dá)氏鰉幼魚來源于黑龍江撫遠(yuǎn)江段野生個體自然繁殖，所得魚苗隨后飼養(yǎng)于長江水產(chǎn)研究所荊州太湖基地。挑選初始體重為(66.79±2.18 g)的達(dá)氏鰉幼魚120尾，隨機(jī)分養(yǎng)于6個流水養(yǎng)殖桶中(直徑105 cm，體積0.43 m3)，每桶放魚20尾，其中3桶魚飼喂基礎(chǔ)飼料組飼料，另外3桶魚飼喂菜粕組飼料。經(jīng)基礎(chǔ)飼料投喂2周后，開始用實(shí)驗(yàn)飼料投喂，每天表觀飽食投喂2次(08:00，15:00)。實(shí)驗(yàn)期間采取自然光照，水源為過濾后的地下水，水溫18.2～20.0 ℃，溶氧≥5 mg/L，pH 7.8～8.2。實(shí)驗(yàn)飼料共投喂4周，取樣前對實(shí)驗(yàn)魚進(jìn)行24 h饑餓處理，然后隨機(jī)選取4條魚，經(jīng)0.05% MS-222(Sigma)麻醉后，解剖取肝臟和腸組織，保存于RNAlater(Qiagen)保存液中，-80 ℃存放備用。組織表達(dá)分析所選用達(dá)氏鰉為9月齡(體長35 cm，體重585.4 g)，分別取心、肝、脾、肌肉、腸、下丘腦、垂體組織，浸泡于RNAlater(Qiagen)保存液中，-80 ℃存放備用。

1.3 總RNA 提取

采用RNeasyPlus Mini Kit 試劑盒(Qiagen)進(jìn)行組織總RNA 的提取，并參照PrimeScriptRT reagent Kit With gDNA Eraser(TaKaRa)試劑盒合成單鏈cDNA 用于熒光定量PCR分析。

1.4 谷氨酸脫氫酶基因ORF序列克隆及分析

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已有的達(dá)氏鱘下丘腦轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(未發(fā)表數(shù)據(jù))，搜索得到gdh同源基因的序列片段信息，設(shè)計嵌套引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物純化后連入pMD19-T 載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(DH5α)，挑取陽性克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證。本研究所有引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成(表2)。采用NCBI Conserved Domain Database對所得序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)。對推導(dǎo)的達(dá)氏鰉GDH氨基酸序列與NCBI中查詢得到的其它物種GDH序列運(yùn)用Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo)進(jìn)行序列一致性比對，并利用MEGA X 軟件以鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，自展法(Bootstrap)檢驗(yàn)系統(tǒng)分支的置信度(重復(fù)次數(shù)為1 000)。所選取物種GDH氨基酸序列對應(yīng)的NCBI序列號如下：人(CAA30521.1)、小鼠(EDL24875.1)、西部錦龜(XP_005294054.1)、綠海龜(EMP30951.1)、熱帶爪蟾(AAH84455.1)、非洲爪蟾(NP_001087023.1)、斑馬魚(NP_997741.1)、泥鰍(AEX31556.1)、黃鱔(AEX31558.1)、大西洋鮭(NP_001117108.1)、虹鱒(CAD11803.1)、羅氏沼蝦(ATN39850.1)、中華絨螯蟹(AEO72077.1)、凡納濱對蝦(ACC95446.1)。

表2 實(shí)驗(yàn)所用引物序列

1.5 實(shí)時熒光定量PCR

根據(jù)所得到達(dá)氏鰉gdhcDNA 序列設(shè)計定量引物(表2)，進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)。達(dá)氏鰉apN及pepT1基因的熒光定量引物設(shè)計參考自達(dá)氏鱘下丘腦轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫搜索得到的相應(yīng)同源基因的部分片段序列，并進(jìn)行測序驗(yàn)證。達(dá)氏鰉hsp90和18sRNA的熒光定量引物參考文獻(xiàn)[11]。實(shí)驗(yàn)按SYBRPremix ExTaqTM(Perfect Real Time)試劑盒說明書進(jìn)行操作，重復(fù)3次，以達(dá)氏鰉18S RNA作為內(nèi)參基因。擴(kuò)增反應(yīng)在 Bio-Rad CFX96 Real Time System 儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，53 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，共40個循環(huán)。結(jié)果采用2-ΔΔCt分析法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.6 統(tǒng)計分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，并采用SPSS 22.0對各實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05表示差異顯著，P≥0.05表示沒有顯著性差異。使用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果

2.1 達(dá)氏鰉谷氨酸脫氫酶基因的cDNA序列擴(kuò)增及分析

本研究克隆得到達(dá)氏鰉谷氨酸脫氫酶基因gdh的完整ORF序列。該序列全長1 635 bp，編碼544個氨基酸。結(jié)構(gòu)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)，達(dá)氏鰉GDH擁有兩個ELFV_dehydrog超家族結(jié)構(gòu)域(圖1，下劃線標(biāo)示)。氨基酸序列多重比對結(jié)果表明，達(dá)氏鰉GDH的氨基酸序列較為保守，與其它代表性脊椎動物的同源蛋白序列一致性均大于85%(圖2)。進(jìn)一步運(yùn)用Mega X軟件構(gòu)建了基于GDH氨基酸序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，結(jié)果顯示，哺乳類代表物種人和小鼠先與爬行類的西部錦龜聚為一支，然后再與兩棲類的熱帶爪蟾及非洲爪蟾聚為一支，隨后這5個物種再與軟骨魚類達(dá)氏鰉聚為一類，而所有的硬骨魚類聚為單獨(dú)的一支。

圖1 達(dá)氏鰉gdh的ORF cDNA全長序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 The full-length ORF cDNA sequences of gdh and their putative amino acidsELFV_dehydrog結(jié)構(gòu)域用下劃線標(biāo)示

2.2 谷氨酸脫氫酶基因gdh的組織表達(dá)分析

采用熒光定量PCR法檢測了gdhmRNA在達(dá)氏鰉各組織(心、肝、脾、腸、肌肉、下丘腦、垂體)中的表達(dá)。gdh在所有檢測的組織中都有表達(dá)，其中在腸中的轉(zhuǎn)錄水平最高，在肌肉中的轉(zhuǎn)錄水平最低(圖4)。

2.3 雙低菜粕添加對gdh、apN、pepT1及hsp90基因表達(dá)的影響

在基礎(chǔ)飼料中添加雙低菜粕作為蛋白原料制備飼料投喂達(dá)氏鰉幼魚，檢測其對蛋白質(zhì)代謝相關(guān)基因gdh、apN、pepT1及應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因hsp90表達(dá)的影響。熒光定量PCR分析結(jié)果顯示，在肝臟中，gdh和hsp90的表達(dá)量在菜粕組和基礎(chǔ)飼料組沒有明顯變化(圖5A)。而在腸中，菜粕組gdh和apN基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于基礎(chǔ)飼料組；pepT1基因在菜粕組的表達(dá)量雖也高于基礎(chǔ)飼料組，但是差異不顯著(圖5B)。

圖2 達(dá)氏鰉與其他代表性物種的GDH氨基酸序列多重比對分析Fig.2 Multiple sequence alignment of GDH between H. dauricus and other vertebrates除達(dá)氏鰉外，其它所有序列來源于Genbank。相同的氨基酸殘基用黑色陰影高亮顯示，60%一致的氨基酸殘基用灰色陰影表示

圖3 采用MEGA X軟件構(gòu)建的基于GDH氨基酸序列的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 NJ phylogenetic tree based on GDH amino acid sequences by MEGA X

圖4 達(dá)氏鰉gdh基因在不同組織中的表達(dá)Fig.4 The transcription distribution of gdh in different tissues of H. dauricus

圖5 兩種蛋白原料對肝臟gdh、hsp90及腸gdh、apN、pepT1基因表達(dá)的影響Fig.5 The transcription differences of gdh and hsp90 in the liver(A) and gdh, apN, and pepT1 in the intestine(B) by the two different protein ingredients diets每組選取4尾魚進(jìn)行分析，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*代表差異顯著(P<0.05)

3 討論

本研究從達(dá)氏鰉中克隆得到谷氨酸脫氫酶基因的ORF序列，氨基酸序列多重比對結(jié)果表明GDH在脊椎動物中較為保守，暗示其具有保守的生物學(xué)功能。谷氨酸是含量最高的游離氨基酸之一，廣泛分布于各種組織中，包括腦、骨骼肌、肝、腎、腸和脂肪等組織中。本研究也發(fā)現(xiàn)達(dá)氏鰉gdh基因在所有組織中廣泛表達(dá)(圖4)，這與其對谷氨酸的分解代謝功能是相一致的。在凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)[12]、明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)[13]及斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)[14]中，gdh在肌肉中大量表達(dá)，這可能與甲殼動物的大量氨基酸代謝發(fā)生在肌肉中有關(guān)。在湘云鯽和紅鯽中，gdh在肝臟和前腸中表達(dá)量都較高[15]。本研究中達(dá)氏鰉gdh在腸中表達(dá)量最高，在肝臟組織中也有大量表達(dá)。腸道是魚類氨基酸消化、吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)的主要場所。另外，大量的研究證實(shí)GDH在肝臟和腸中的氨氮代謝中也發(fā)揮重要作用[12-14]。因此，GDH在肝臟和腸道中的高表達(dá)與其參與氨基酸消化及氨氮代謝功能相一致。

熱休克蛋白又稱為應(yīng)激蛋白, 包含HSP90、HSP70、HSP60等蛋白家族。它是生物細(xì)胞(包括原核細(xì)胞及真核細(xì)胞)在受熱、生物應(yīng)激、理化因素等應(yīng)激原刺激后, 發(fā)生熱休克反應(yīng)時所產(chǎn)生的一類伴隨細(xì)胞蛋白[16]。在本研究中，當(dāng)在飼料中添加雙低菜粕時，肝臟中hsp90的表達(dá)沒有發(fā)生變化(圖5A)，這說明雙低菜粕的添加沒有引起達(dá)氏鰉魚體的應(yīng)激反應(yīng)。

在本團(tuán)隊(duì)前期研究中，達(dá)氏鰉對魚粉組總氨基酸的表觀消化率(98.62%±3.86%)顯著高于豆粕組(85.68%±3.97%)[10]。為了研究飼料中添加雙低菜粕是否會引起達(dá)氏鰉蛋白質(zhì)代謝水平的升高，分別檢測了與蛋白質(zhì)消化相關(guān)的gdh、apN基因及多肽轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的pepT1基因的表達(dá)變化。GDH主要催化谷氨酸的去氨基化，生成副產(chǎn)品氨，參與氮代謝循環(huán)。APN屬于鋅金屬肽酶家族的一個成員，屬肽鏈端解，其在腸道中主要參與氨基酸的N端水解，以將小的多肽消化成氨基酸[17-18]。動物腸道小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體pepT1的主要功能是將小肽從細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，在動物吸收外源小肽中起關(guān)鍵作用[19]。本研究結(jié)果顯示，雙低菜粕組腸道中g(shù)dh和apN的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于基礎(chǔ)飼料組，pepT1的變化沒有顯著性差異(圖5B)。這說明為了更好地消化植物性蛋白質(zhì)，達(dá)氏鰉體內(nèi)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄水平得到提高，但是小肽轉(zhuǎn)運(yùn)過程變化不顯著。以上結(jié)果暗示，在達(dá)氏鰉飼料中添加雙低菜粕，需綜合考慮其對生長及體內(nèi)蛋白代謝水平的影響。