張 超，馬 曉，劉 倩，吳利敏，劉慧芬，李學(xué)軍，王璐明

(河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453007)

NR5a2(nuclear receptor subfamily 5，group A，member 2)又稱LRH-1(肝受體同系物)，是一種孤核受體，也是需要配體激活的轉(zhuǎn)錄因子。在小鼠[1](Musmusculus)、牙鲆[2](Paralichthysolivaceus)、赤點石斑魚[3](Epinephelusakaara)中發(fā)現(xiàn)NR5a2可以結(jié)合Cyp19a1a啟動子，進(jìn)而激活其轉(zhuǎn)錄活性。此外，在牙鲆中還發(fā)現(xiàn)NR5a2可以與Foxl2協(xié)同作用，調(diào)節(jié)Cyp19a1a的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[2]。當(dāng)NR5a2僅在赤點石斑魚成熟卵巢細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)時，Cyp19a1a基因的表達(dá)水平下降[3-4]。Cyp19a1a基因編碼的芳香化酶是雄激素轉(zhuǎn)換為雌激素的關(guān)鍵限速酶，而雌激素在脊椎動物卵巢分化，雌性性別特征的維持中有重要的作用。NR5a2作為Cyp19a1a轉(zhuǎn)錄因子之一，對Cyp19a1a基因的表達(dá)也有一定的調(diào)節(jié)作用，深入研究NR5a2和Cyp19a1a在性別分化中的功能具有重要意義。

中華鱉(Pelodiscussinensis)，又稱甲魚、水魚、團(tuán)魚等，隸屬于龜鱉目(Testudinate)鱉科(Tironychidae)中華鱉屬(Pelodiscus)，是我國廣泛養(yǎng)殖的名貴水產(chǎn)品之一，具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值。目前對中華鱉的研究多集中在性別決定與分化、免疫和營養(yǎng)等方面[5-7]。爬行動物的性別決定有基因型性別決定(GSD)和環(huán)境性別決定類型(ESD)。前期研究多認(rèn)為中華鱉屬于ESD中的TSD類型，隨著研究發(fā)展深入，越來越多證據(jù)表明中華鱉屬于GSD型[8]。養(yǎng)殖過程中，雄鱉比雌鱉生長速度快。因此，深入研究中華鱉性別分化與發(fā)育機(jī)制，有助于建立提高雄鱉孵化率或全雄鱉培育方法，對中華鱉養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展有重要意義。本實驗克隆了中華鱉NR5a2基因，通過實時熒光定量PCR技術(shù)研究中華鱉NR5a2基因在不同組織以及不同時期胚胎中的表達(dá)，為進(jìn)一步研究其功能提供依據(jù)，也為中華鱉性別發(fā)育研究提供資料。

1 材料與方法

1.1 實驗用中華鱉組織及胚胎的收集

本實驗所選用的成熟雌性/雄性中華鱉和受精卵采自固始縣晨源水產(chǎn)養(yǎng)殖合作社，隨機(jī)選取成熟雌性、雄性中華鱉各6只，分別取心臟、肝臟、脾臟、腦、胃、肌肉、精巢、卵巢組織置于無酶管中，后將組織存放在-80 ℃冰箱備用。受精卵通過恒溫恒濕培養(yǎng)箱進(jìn)行孵化，孵化溫度為31.5 ℃，濕度控制在75%～90%。孵化過程中根據(jù)中華鱉胚胎發(fā)育圖譜[9]收集性腺分化前后不同時期(16-23期)[10-11]性腺-中腎復(fù)合體(AKG)，每個時期取6個樣品。

1.2 中華鱉NR5a2基因全長的克隆

1.2.1 引物設(shè)計

根據(jù)Ensemble數(shù)據(jù)庫中的中華鱉NR5a2基因cDNA序列(ENSPSIG00000003632.1)設(shè)計引物F1/R1進(jìn)行cDNA序列的驗證，同時設(shè)計GSP 5′/NP5′和GSP3′/NP3′引物用于基因全長的克隆(表1)。此外，根據(jù)克隆得到的中華鱉NR5a2基因cDNA全長設(shè)計特異性引物用于熒光定量PCR表達(dá)實驗。在熒光定量PCR實驗中選用的內(nèi)參基因為GAPDH[9,12]。引物通過Primer 5.0 設(shè)計，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

表1 實驗中所用引物序列

1.2.2 RNA的提取和NR5a2的克隆

取卵巢組織以及不同發(fā)育時期個體AKG，RNAiso plus(TaKaRa，大連)提取總RNA。ND-2000核酸蛋白儀測定RNA濃度與OD值，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，總RNA置于-80 ℃保存。按照Prime ScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(TaKaRa，大連)的操作說明進(jìn)行中華鱉卵巢總RNA反轉(zhuǎn)錄，通過特異性引物NR5a2-F1/R1擴(kuò)增NR5a2 cDNA部分序列。在已獲得部分序列的基礎(chǔ)上設(shè)計3′ RACE 和5′RACE的基因特異性引物(表1)，按照SMART 5′ RACE & 3′ RACE 試劑盒(TaKaRa，大連)說明書合成3′-RACE-Ready cDNA和5′-RACE-Ready cDNA，分別進(jìn)行3′非編碼區(qū)和5′非編碼區(qū)的擴(kuò)增。將擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行克隆、測序，獲得所需片段并進(jìn)行拼接，得到該基因cDNA序列全長。

1.3 中華鱉NR5a2基因的序列分析

利用DNAman軟件對中華鱉NR5a2基因的測序結(jié)果進(jìn)行拼接；利用Open Reading Frame(ORF)Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)推算其開放閱讀框及編碼的氨基酸序列；通過SignalP 4.1 serves(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測其信號肽結(jié)合位點； SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析；使用ClustalX2進(jìn)行氨基酸序列同源性比對；運用MAGA7.0軟件通過鄰接法(NJ法)(bootstrap values為1 000)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 qRT-PCR分析中華鱉NR5a2基因的組織特異性表達(dá)

按照Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒(TaKaRa，大連)操作說明進(jìn)行不同發(fā)育時期性腺中腎復(fù)合體RNA的反轉(zhuǎn)錄，選用特異性引物qNR5a2-F/R(表1)進(jìn)行qRT-PCR，以GAPDH為內(nèi)參基因(表1)。反應(yīng)體系(10 μL)：TB Green Master Mix 5 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 3.2 μL；PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 預(yù)變性30 s，95 ℃ 變性5 s，58 ℃ 退火30 s，40個循環(huán)，每個組織分別取自3只中華鱉，即3個平行。采用2-△△Ct法計算中華鱉NR5a2基因的相對表達(dá)量，結(jié)果采用SPSS16.0軟件進(jìn)行ANOVA單因素方差分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SD)表示。

2 結(jié)果分析

2.1 中華鱉NR5a2基因序列分析

本實驗克隆得到中華鱉NR5a2基因cDNA序列全長為2 674 bp，開放閱讀框長1 608 bp,編碼535個氨基酸，5′-UTR長40 bp，3′-UTR長1 026 bp(圖1)。使用ProtParam預(yù)測該基因編碼的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為60.5 kDa，等電點為8.57。

圖1 中華鱉NR5a2基因序列和氨基酸序列Fig.1 Full-length nucleotide cDNA sequences and deduced amino acid sequences of NR5a2 in P.sinensis小寫字母表示5′和3′非編碼區(qū)；大寫字母表示編碼區(qū)。預(yù)測的結(jié)構(gòu)域ZnF-C4用下劃線表示，預(yù)測的結(jié)構(gòu)域HOLI由陰影區(qū)表示，*表示終止密碼子。

對中華鱉NR5a2編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該序列無明顯信號肽位點，也不存在蛋白跨膜區(qū)域。在疏水性/親水性分析中發(fā)現(xiàn)其疏水性殘基比例大于親水性殘基比例，其中疏水性最大值為-2.778，親水性最大值為2.411。SMART分析表明中華鱉NR5a2含有一個保守的ZnF-C4結(jié)構(gòu)域和一個保守的HOLI結(jié)構(gòu)域(圖2-A)。通過 DNASTAR.Lasergene.v7.1 軟件中的Protean程序?qū)χ腥A鱉NR5a2基因蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行預(yù)測，其蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中的Alpha螺旋、Beta折疊、Turn轉(zhuǎn)角以及Coil卷曲螺旋分布如圖所示(圖2-B)，結(jié)果表明該蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要由Alpha螺旋和Coil卷曲螺旋構(gòu)成，分別占45.61%和45.05%。SWISS-MODEL在線預(yù)測軟件對中華鱉NR5a2基因編碼蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測結(jié)果如圖所示(圖2-C)。

2.2 中華鱉NR5a2基因氨基酸同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

使用Megalign軟件進(jìn)行中華鱉NR5a2氨基酸序列與其他物種NR5a2氨基酸進(jìn)行比對(圖3)。結(jié)果表明中華鱉與西部錦龜?shù)南嗨菩宰罡撸瑸?9.2%，其次是原雞，相似性為98.4%(表2)。通過MEGA5.1軟件，采用鄰接(Neighbor-Joining)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。結(jié)果顯示中華鱉與西部錦龜?shù)倪M(jìn)化關(guān)系最近，其次是原雞、紫翅瓊鳥和揚(yáng)子鱷。

圖2 NR5a2編碼氨基酸序列分析Fig.2 The sequence analysis of protein of NR5a2A：NR5a2編碼蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測；B：NR5a2編碼蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測；C：NR5a2編碼蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

圖3 不同物種NR5a2基因氨基酸同源性比較Fig.3 Alignment of amino acid sequences of NR5a2 gene in different species使用Megalign軟件進(jìn)行多序列對比，其中黑色底紋代表氨基酸相似度為100%，灰色底紋代表氨基酸相似度為75%。

表2 預(yù)測的中華鱉NR5a2氨基酸序列與其他物種NR5a2氨基酸序列的比對

圖4 NR5a2基因編碼氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based amino acid sequences of NR5a2

2.3 中華鱉NR5a2基因的組織特異性表達(dá)及不同發(fā)育階段變化

熒光定量PCR結(jié)果表明，NR5a2基因在中華鱉的心臟、肝臟、脾臟、腦、胃、肌肉、精巢、卵巢中均表達(dá)。其中，在肝臟中表達(dá)量最高，其次是卵巢，在肝臟和卵巢組織中NR5a2的相對表達(dá)量顯著高于其他組織(P<0.05)(圖5)。31.5 ℃條件下孵育，在中華鱉胚胎發(fā)育不同時期均在AKG中檢測到NR5a2表達(dá)，在胚胎發(fā)育17期(性腺分化開始階段)時表達(dá)量最高，隨著發(fā)育的進(jìn)程表達(dá)量顯著下降(圖6)。

圖5 NR5a2基因在中華鱉不同組織中的相對表達(dá)量Fig.5 Real-time PCR quantification of NR5a2 expression in different tissues of P.sinensis不同小寫字母表示NR5a2基因在不同組織中的差異顯著性(P<0.05)。

圖6 NR5a2基因在中華鱉胚胎不同發(fā)育時期的相對表達(dá)量(孵化溫度：31.5 ℃)Fig.6 The relative expression of NR5a2 gene at different developmental stages of P.sinensis embryo( incubation temperature :31.5 ℃)不同小寫字母表示NR5a2基因在不同發(fā)育時期的差異顯著性(P<0.05)。

3 討論

本實驗通過RACE方法克隆得到中華鱉NR5a2基因cDNA序列全長，共2 674 bp，其ORF框長度為1 608 bp，編碼535個氨基酸，具有一個ZnF-C4結(jié)構(gòu)域和一個HOLI結(jié)構(gòu)域，這與二花臉豬[13](Erhualianpig)、黃顙魚[14](Pelteobagrusfulvidraco)等物種中的研究結(jié)果類似。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明中華鱉NR5a2編碼氨基酸序列與西部錦龜、雞、揚(yáng)子鱷等物種具有較高的相似性，親緣關(guān)系較近，和斑馬魚(Daniorerio)、青鳉(Oryziaslatipes)、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)等物種的相似性較低，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這一結(jié)果與中華鱉在不同物種中的分類地位表現(xiàn)一致。

NR5a2是核受體超家族中的重要一員，在生長發(fā)育、細(xì)胞分化等方面發(fā)揮重要的作用，研究發(fā)現(xiàn)該基因主要在肝胰臟以及卵巢組織中表達(dá)。NR5a2可與7-α-羥化酶基因啟動子區(qū)特異性結(jié)合并激活其轉(zhuǎn)錄，平衡動物體內(nèi)膽汁酸水平[15]。Falender等[16]在嚙齒動物卵巢研究表明NR5a2可以調(diào)節(jié)雌激素的合成。Duggavathi等[17]敲除小鼠顆粒細(xì)胞NR5a2后發(fā)現(xiàn)卵巢中雌激素含量降低，排卵量減少。姚勇等[13]研究指出NR5a2在二花臉豬卵巢組織中高表達(dá)，可能促進(jìn)卵泡的形成和排卵，參與生殖活動。本實驗通過熒光定量PCR技術(shù)檢測NR5a2在中華鱉不同組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，NR5a2在各組織中均有表達(dá)，在肝臟組織和卵巢組織中表達(dá)量較高，這表明NR5a2可能在中華鱉生殖功能和肝功能調(diào)控中有重要作用。

性別分化是水產(chǎn)動物研究熱點之一，Cyp19a1a是雌激素合成的關(guān)鍵基因，對動物的性別分化與發(fā)育，尤其是卵巢的分化和功能維持有重要作用。在虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[4]、赤點石斑魚[18]等研究中，NR5a2可作為轉(zhuǎn)錄因子與Cyp19a1a啟動子結(jié)合，調(diào)控Cyp19a1a轉(zhuǎn)錄表達(dá)從而調(diào)節(jié)雌激素水平。在牙鲆[19]中，NR0b1和NR5a2可通過調(diào)控Cyp19a1a的表達(dá)間接調(diào)節(jié)E2水平，參與牙鲆性腺分化。此外，Yan等[20]在河豚(Tetraodontidae)性別分化關(guān)鍵時期檢測到NR5a2高表達(dá)。王莉等[11]、葛楚天等[11]研究表明，中華鱉性腺分化時間為胚胎發(fā)育17期。本實驗通過qRT-PCR檢測NR5a2在中華鱉胚胎不同發(fā)育時期的表達(dá)情況。結(jié)果表明，NR5a2在胚胎發(fā)育16期(性腺分化之前)已表達(dá)，在 17期(性腺分化初期)表達(dá)水平最高，隨后表達(dá)水平下降。Cyp19a1在胚胎發(fā)育17期開始顯著增加[12]，推測NR5a2可能作為轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控Cyp19a1表達(dá)，從而參與中華鱉性腺分化調(diào)控。