李 堯，賈 睿，杜金梁，曹麗萍，顧鄭琰，錢 皓，鄭 濤，Galina Jeney，徐 跑,，殷國俊,

(1.南京農業(yè)大學無錫漁業(yè)學院，江蘇無錫 214081；2.中國水產科學院淡水漁業(yè)研究中心，農村農業(yè)部淡水漁業(yè)種質資源利用重點實驗室，江蘇無錫 214081；3.中國水產科學研究院淡水漁業(yè)研究中心，魚類免疫藥理國際聯(lián)合實驗室，江蘇無錫 214081；4.National Agricultural Research Center,Research Institute for Fisheries and Aquaculture,Anna Light 8,Szarvas 5440,Hungary)

集約化養(yǎng)殖條件下，魚類不可避免地受到多種應激因子的刺激，會產生大量的活性氧自由基(ROS)引起氧化應激反應[1]。氧化應激狀態(tài)下，過多的ROS可攻擊生物膜、蛋白質和DNA，造成機體組織損傷，進而影響魚類正常的生理和行為活動[2]。過氧化氫(H2O2)為典型的ROS之一，可直接氧化細胞膜上的脂質和蛋白質，引起氧化損傷，甚至導致細胞死亡。 因此常用于構建氧化應激或氧化損傷模型[3]。在哺乳動物中，由H2O2損傷的肝臟和肝細胞模型通常用于篩選肝臟保護劑[4]。在魚類中也已報道H2O2可誘導草魚卵巢細胞損傷[5]。

中草藥在我國歷史悠久，被廣泛用于水產動物的健康養(yǎng)殖和疾病防治中[6-7]。中草藥制劑在草魚、團頭魴等的炎癥防治、免疫力增強方面具有顯著作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)一些中草藥對氧化應激誘導的魚類肝損傷具有治療作用[9]。白芍提取物(PARE，paeoniae alba radix extract)是從植物芍藥根中提取的天然化合物,其主要活性成分為芍藥苷、羥基芍藥苷、芍藥花苷、芍藥內酯苷和苯甲酞等[10]，具有抑制活性氧自由基形成、清除多余自由基、減輕氧化損傷誘導的肝損傷等作用[11-12]。在水產動物中，陳錫強等[13]研究發(fā)現(xiàn)白芍提取物能夠抑制轉基因斑馬魚節(jié)間血管生長，提高免疫能力和具有抗腫瘤作用；王慶奎等[14]發(fā)現(xiàn)白芍提取物能夠增強斑點叉尾鮰血液白細胞吞噬能力，對血液生化指標具有積極作用。但是關于白芍提取物對魚類肝損傷保護和抗氧化性能方面的研究還未見報道。

本實驗在飼料中添加白芍提取物，通過檢測肝、鰓、肌肉和血清中生化指標的變化來評估其對羅非魚(Oreochromisniloticus)抗氧化能力的影響；并用H2O2誘導羅非魚肝損傷，測定其血清和肝組織中生化指標和基因表達的變化，評估白芍提取物對肝損傷和炎癥反應的保護作用，為魚類保肝藥物的開發(fā)提供一些理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗用魚

實驗羅非魚由中國水產科學研究院淡水漁業(yè)研究中心養(yǎng)殖基地提供。實驗正式開始前，實驗魚被暫養(yǎng)于循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中(水溫(30±2)℃，pH 6.8～7.6，溶解氧> 6 mg/L，每天10%的水交換量)；并以2%體重的基礎飼料飼喂，一天兩次(8∶30、15∶30)?；A飼料配方見表1[15]。

表1 基礎飼料組成及營養(yǎng)水平

注：每公斤飼料含維生素：VA 10 mg，VB150 mg，VB2200 mg，VB3500 mg，VB650 mg，VB75 mg，VB11 15 mg，VB120.1 mg，VC 1 000 mg，VD 0.05 mg，VE 400 mg，VK 40 mg,肌醇2 000 mg，膽堿5 000 mg。

每公斤飼料含礦物質：FeSO4·7H2O 372 mg，CuSO4·5H2O 25 mg，ZnSO4·7H2O 120 mg，MnSO4·H2O 5 mg，MgSO42 475 mg，NaCl 1 875 mg，KH2PO41 000 mg，Ca(H2PO4)22 500 mg。

1.2 藥品、試劑及儀器

白芍提取物(白芍苷10%)購于西安匯林生物科技有限公司(陜西西安)；實驗所用的麻醉劑和H2O2試劑購自南京凱基生物技術有限公司(江蘇南京)，磷酸鹽緩沖液從Sigma Company(St.Louis，MO，USA)訂購；總蛋白(TP)、白蛋白(Alb)、谷丙轉氨酶(GPT)、谷草轉氨酶(GOT)、超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)等試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 實驗設計與養(yǎng)殖

將健康的羅非魚隨機分為5組，空白對照組(不添加藥物，不注射H2O2)、H2O2組(不添加藥物，注射H2O2)和白芍提取物組(0.5、1、5 g/kg，注射H2O2)，每組設置3個重復，每缸15尾魚?？瞻讓φ战M和H2O2組投喂基礎日糧，白芍提取物組分別投喂含0.5、1、5 g/kg白芍提取物的日糧。飼養(yǎng)60 d后，對所有魚進行稱重，并從空白對照組和白芍提取物組(0.5、1、5 g/kg)分別隨機選取15條羅非魚置于0.05% MS-222水溶液中(三甲基甲磺酸鹽，Sigma，MO，USA)麻醉，采集血液、肝、鰓和肌肉組織檢測SOD、 GSH、T-AOC和MDA，評估白芍提取物對羅非魚抗氧化能力的影響。

氧化損傷實驗：投喂60 d后，每組隨機挑選15條羅非魚進行氧化損傷實驗?？瞻讓φ战M腹腔注射生理鹽水，H2O2組和白芍提取物組腹腔注射300 mmol/L H2O2。24 h后，將實驗魚置于0.05% MS-222水溶液中麻醉，并立即采集血液和肝組織，檢測血清GPT、 GOT、 TP和Alb等生化指標，肝勻漿SOD、GSH、T-AOC和MDA等生化指標和TNF-α、IL-1β、IL-8和IL-10的基因表達，評估白芍提取物對羅非魚肝損傷和炎癥反應的保護作用。

1.4 生化指標檢測

按照試劑盒說明書，用相應的試劑盒分別測定血清生化指標GPT、GOT、TP、Alb、SOD、GSH、T-AOC和MDA；肝、鰓和肌肉組織勻漿生化指標SOD、GSH、T-AOC和MDA。

1.5 實時熒光定量PCR檢測

取適量的肝組織加入RNAiso Plus(Takara，大連)提取總RNA。通過Gene Quant1300紫外可見分光光度計(GE Healthcare Biosciences公司)測定RNA的濃度和純度，然后通過反轉錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，TaKaRa)合成cDNA。

使用實時熒光定量PCR技術檢測TNF-α、IL-1β、IL-8和IL-10的基因表達量。PCR反應根據(jù)TB GreenTMPremix Ex TaqTMII(TaKaRa)試劑盒說明書。反應條件為：預變性 95 ℃ 、10 s；40個循環(huán) 95 ℃、5 s，60 ℃、 1 min。內參引物和特異性引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。引物序列見表2，β-actin基因作為內參基因，用2-△△Ct方法分析基因相對表達量。

表2 qRT-PCR引物

1.6 計算公式

特定生長率(SGR)= [ lnWt-lnW0]/t×100%;

飼料系數(shù)(FCR)= FI/(Wt-W0)

式中，W0為魚初體均重(g)；Wt為魚末體均重(g)；t為飼喂天數(shù)(d)；FI為每尾魚平均攝食飼料總量(風干樣重)(g)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 20.0軟件包進行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)值均以均值±標準誤表示。所有數(shù)據(jù)通過單因素方差進行(ANOVA)統(tǒng)計學分析，并對不同組間數(shù)據(jù)進行 Tukey 多重比較，P<0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 白芍提取物對羅非魚生長的影響

表3數(shù)據(jù)顯示，羅非魚投喂含白芍提取物的飼料60 d后，特定生長率略高于對照組，餌料系數(shù)略低于對照組，但均無顯著性差異。

表3 白芍提取物對羅非魚生長的影響

2.2 白芍提取物對羅非魚肝、鰓、肌肉和血清抗氧化能力和脂質過氧化的影響

表4所示，在肝組織中，與對照組相比， 1和5 g/kg白芍提取物顯著提高了SOD活力、促進了GSH和T-AOC的形成、降低了MDA含量 。鰓組織中，SOD、GSH和 T-AOC水平在 5 g/kg白芍提取物組中被顯著提高，同時MDA形成被顯著抑制。肌肉組織中，三種不同濃度白芍提取物對抗氧化能力和脂質過氧化水平沒有顯著影響。血清中，與對照組相比，5 g/kg白芍提取物顯著提高了SOD酶活性和T-AOC水平，同時1 g/kg 白芍提取物也提高了T-AOC水平。

表4 注射H2O2前白芍提取物對羅非魚肝、鰓、肌肉和血清SOD、GSH、T-AOC和 MDA的影響

注：同一行數(shù)值右上角標有不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 白芍提取物對H2O2損傷后羅非魚血清GPT和GOT活性的影響

如圖1所示， H2O2損傷后GPT和GOT活性極顯著升高，而三種不同濃度白芍提取物的飼料預處理后，GPT和GOT活力均極顯著下降。

圖1 白芍提取物對H2O2處理后羅非魚血清GPT和GOT活性的影響Fig.1 Effects of PARE on serum GPT and GOT after H2O2 injection0.5 group示0.5 g/kg白芍提取物組；1 group示1 g/kg白芍提取物組；1.5 group示1.5 g/kg白芍提取物組不同字母表示組間具有差異顯著P<0.05，下同

2.4 白芍提取物對H2O2損傷后羅非魚血清TP和Alb含量的影響

由圖2可知，與空白對照組相比，H2O2組中TP和Alb含量顯著降低，而三種不同濃度白芍提取物的飼料預處理后，血清TP含量降低被顯著抑制；同樣，5 g/kg白芍提取物預處理后，血清Alb水平也呈現(xiàn)了類似的變化。

2.5 白芍提取物對H2O2損傷后羅非魚肝臟SOD、 GSH、T-AOC和 MDA的影響

通過測定肝組織勻漿中的SOD、GSH、T-AOC和MDA來評估白芍提取物的抗氧化能力和對羅非魚肝損傷的保護作用。如圖3所示， H2O2處理24 h后，SOD、 GSH和T-AOC水平顯著下降，而MDA含量顯著升高。與H2O2組相比，1 g/kg白芍提取物預處理后， SOD水平和GSH含量顯著升高；同時1和5 g/kg白芍提取物也顯著提高了T-AOC水平；與此相反，三種不同濃度的白芍提取物預處理顯著抑制了MDA形成。

2.6 白芍提取物對H2O2損傷后羅非魚肝TNF-α、 IL-1β、 IL-8 和IL-10基因表達的影響

如圖4所示，與對照組相比，H2O2損傷引起了TNF-α、IL-1β和IL-8基因顯著上調，以及IL-10基因顯著下調。與H2O2組相比，三種不同濃度的白芍提取物顯著抑制了TNF-α、IL-1β和IL-8基因的上調，同時IL-10基因的下調在0.5和1 g/kg白芍提取物作用也被顯著抑制。

圖2 白芍提取物對H2O2處理后羅非魚血清TP和Alb的影響Fig.2 Effects of PARE on serum TP and Alb after H2O2 injection

圖3 白芍提取物對H2O2處理后羅非魚肝臟SOD、GSH、T-AOC和 MDA的影響Fig.3 Effects of PARE on liver SOD,GSH,T-AOC and MDA after H2O2 injection

圖4 白芍提取物對H2O2處理后羅非魚肝TNF-α、IL-1β、IL-8 和 IL-10基因表達的影響Fig.4 The changes of TNF-α,IL-1β,IL-8 and IL-10 mRNA levels in liver of tilapia treated with H2O2

3 討論

與哺乳動物類似，魚類也具有抗氧化系統(tǒng)，主要由抗氧化酶(如SOD等)和非酶抗氧化物質(如GSH等)，在抵御氧化應激、清除多余自由基和維持機體氧化還原狀態(tài)的動態(tài)平衡中起重要作用。同時，抗氧化系統(tǒng)與機體免疫力密切相關，其各成分的活性或含量的變化與多種疾病相關。已有研究表明氧化應激以及抗氧化能力的降低與肝損傷的發(fā)生密切相關[16]。

H2O2為常見的氧化劑，廣泛用于誘導多種細胞和動物建立氧化應激模型[17-18]。在肝細胞中，H2O2處理可能導致細胞膜脂質過氧化和蛋白質氧化，破壞細胞膜結構和功能，并伴隨著細胞質酶GPT和GOT的滲漏[19-21]，因此， GPT和GOT為經典的肝損傷評價指標。本研究中，H2O2處理后，血清中GPT和GOT的酶活性顯著增加，表明氧化應激引起嚴重的肝損傷。而白芍提取物處理組中GPT和GOT活性顯著降低，同時TP和Alb 含量的顯著降低，表明白芍提取物對H2O2誘導的肝損傷具有保護作用，同時抑制肝組織中蛋白損傷。有研究者推測這種保護機制與其抗磷脂氧化作用有關[22]。在哺乳動物中的研究發(fā)現(xiàn)白芍提取物能夠有效地抗脂質氧化，抑制了GPT和GOT從肝細胞釋放到血液中，保護細胞膜的完整性，本實驗結果和在小鼠的研究結果一致[11]。

研究發(fā)現(xiàn)多種藥物的抗氧化能力在肝保護中起著主要作用[22]。哺乳動物中的研究表明，白芍提取物能夠顯著提高SOD活性和T-AOC的含量，緩解自由基對細胞結構的損傷[22]。本研究結果顯示，白芍提取物可有效提高血清、肝和鰓中SOD、T-AOC和GSH水平，表明白芍提取物可提高羅非魚抗氧化能力。同時本研究結果還顯示，白芍提取物預處理可不同程度地抑制了SOD、GSH和T-AOC水平的下降，這表明白芍提取物能促進羅非魚肝組織中抗氧化酶活力和抗氧化物質的形成，進而清除多余的自由基，抑制氧化應激引起的肝損傷。

脂質過氧化是肝損傷的重要指標之一，MDA是脂質過氧化物的分解產物，其水平的升高可以反映肝臟脂質過氧化損傷程度[23]。秦亞東等研究結果顯示，白芍提取物可抑制MDA的上升，阻止脂質過氧化引起的肝細胞損傷[22]。本實驗結果顯示，H2O2可顯著增加羅非魚肝組織MDA的含量，促使肝細胞脂質過氧化，加劇羅非魚肝損傷；而不同水平的白芍提取物處理后MDA的生成顯著被抑制。表明白芍提取物可以抑制H2O2引起的羅非魚肝組織中脂質過氧化的產生，改善氧化應激，保護羅非魚肝組織細胞膜的結構與功能不受過氧化物的損害。這與在小鼠和其他哺乳動物中的研究結果一致[12]。

研究表明炎癥反應為肝損傷發(fā)生的主要癥狀之一。TNF-α、IL-1β和IL-8是魚類炎癥反應中關鍵的細胞因子，在肝損傷中起著重要的作用[24]。H2O2誘導的肝損傷發(fā)生時，肝臟Kupffer細胞會分泌促炎性因子如TNF-α、IL-1β和IL-8等[25]，同時啟動炎癥信號通路加重炎癥反應，并誘發(fā)肝損傷和纖維化[26]。本實驗結果也表明，H2O2損傷顯著促進了TNF-α、IL-1β和IL-8基因表達的上調，表明氧化應激誘導炎癥反應。而用0.5、1和5 g/kg白芍提取物的飼料飼喂后，羅非魚肝組織中TNF-α、IL-1β和IL-8基因水平均顯著降低，這表明白芍提取物具有抗炎作用，可顯著緩解羅非魚肝組織炎癥反應，抑制肝損傷發(fā)生。

IL-10為炎癥反應過程中最主要的負調節(jié)細胞因子，具有廣泛的抑制炎癥活性作用[23]。IL-10能夠抑制TNF-α產生，調節(jié)肝細胞增殖，在肝損傷中發(fā)揮著極其重要的保護作用[24]。在小鼠中的研究表明，內源性IL-10通過減輕炎癥反應而影響肝細胞壞死，修復肝損傷[27]。本試驗結果顯示，H2O2可顯著降低羅非魚肝組織IL-10的基因表達量，促使肝細胞損傷；而白芍提取物(0.5和1 g/kg)處理后IL-10的基因表達量均顯著上升。表明白芍提取物可促進IL-10表達，抑制氧化應激引起的炎癥反應，進而有效保護肝損傷，本研究結果與在小鼠和其他哺乳動物中的研究結果一致[28]。以上結果也表明白芍提取物保肝作用與其抗炎性作用相關。