申 慧，張英萍，王利華，沙 航，王詠星，鄒桂偉，梁宏偉

(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830046；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢 430223；3.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasing hormone,GnRH)是由下丘腦分泌的，動物生殖過程中最重要的激素之一，在脊椎動物的性腺發(fā)育、繁殖功能維持中起著重要的作用。它是下丘腦-垂體-性腺(hypothalamic-pituitary-gonadal,HPG)軸的關(guān)鍵信息分子；由下丘腦接收的信息以間歇性脈沖的形式來分泌GnRH，從而刺激垂體前葉分泌促性腺激素(Gonadotropin,GTH)，即促卵泡素(follocle-stimulating hormone,FSH)和黃體生成素(luteinizing hormone,LH)，進(jìn)而促進(jìn)睪丸或卵巢的發(fā)育并分泌睪酮(testosterone,T)或雌二醇(estrogen,E2)，從而調(diào)節(jié)性激素的分泌[1]，調(diào)控性腺影響配子的發(fā)育與成熟[2-3]。脊椎動物中大多數(shù)物種至少存在兩種促性腺激素釋放激素，硬骨魚中一般存在3種類型的促性腺激素釋放激素。促性腺激素釋放激素來源和定位的不同，也造成了不同類型促性腺激素釋放激素在功能方面的差異。脊椎動物具有多個(gè)GnRH亞型，分為三個(gè)主要組分，即GnRH1、GnRH2和GnRH3[4]。一般認(rèn)為存在于下丘腦的組織特異性GnRH為GnRH1，即sbGnRH，主要作用是刺激促性腺激素的釋放。GnRH2在結(jié)構(gòu)上高度保守，包含由中腦神經(jīng)元表達(dá)的所有GnRH形式，主要調(diào)節(jié)性行為和攝食行為。GnRH3目前只在硬骨魚中被發(fā)現(xiàn)，由位于腹側(cè)前腦的神經(jīng)元表達(dá)，且已被證明其發(fā)揮神經(jīng)調(diào)節(jié)功能[5-6]。

中華鱉(Pelodiscussinensis)作為我國重要的水產(chǎn)名優(yōu)經(jīng)濟(jì)動物,2016年全國的養(yǎng)殖產(chǎn)量約34.5萬噸，已成為我國漁業(yè)結(jié)構(gòu)優(yōu)化、農(nóng)民增收致富的重要養(yǎng)殖對象之一[7-8]。中華鱉養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展的同時(shí)，由于養(yǎng)殖戶的盲目引種、不科學(xué)的配組繁殖，使得中華鱉生長速度減慢、群體整齊度降低和畸形率增加，嚴(yán)重制約其產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[9]。中華鱉屬于分批產(chǎn)卵的卵生爬行動物，相比較魚來說，產(chǎn)卵量少，繁殖效率較低，因此對其繁殖機(jī)理的研究不僅有利于改善其繁殖性能，也有利于中華鱉新品系(種)的培育。本試驗(yàn)以中華鱉GnRH1基因?yàn)檠芯繉ο?，對其在不同性別、不同組織和胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)特征進(jìn)行分析，為今后GnRH基因在中華鱉生殖調(diào)控等方面的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用中華鱉收集自安徽省喜佳農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，選取健康且活力好的1齡中華鱉雌雄個(gè)體各3只，其中雄性(395.36±20.55)g，雌性(283.72±18.02)g，活體經(jīng)麻醉后，解剖采集腦、心臟、肝臟、脾臟、肺、肌肉、腸、卵巢或精巢等8組織樣品；參照Tokita等[10]對中華鱉胚胎發(fā)育過程的分期，選取30 ℃孵化條件下中華鱉發(fā)育的第8期、第10期至第18期共10個(gè)時(shí)期的胚胎，每時(shí)期均取3個(gè)重復(fù)樣本；樣品于液氮罐中保存過夜后轉(zhuǎn)至-80 ℃保存。

1.2 總RNA提取及cDNA的合成

取保存的雄性中華鱉腦組織，根據(jù)Trizol試劑說明書提取總RNA，用核酸蛋白定量儀(Nanodrop 2000 Thermo Scientific，美國)檢測提取的RNA濃度并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。使用PrimeScriptTMRT Reagen Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，大連)合成cDNA，同時(shí)使用SMARTerTMRACE 5′、3′ Kit(TaKaRa，大連)分別合成5′、3′ RACE cDNA模板，-20 ℃保存。

1.3 中華鱉GnRH 1基因全長cDNA的克隆

根據(jù)GenBank中華鱉GnRH1基因mRNA預(yù)測序列(XM_014569063.2)，設(shè)計(jì)克隆GnRH1基因中間片段引物(表1)。PCR體系參考PCR Master Mix試劑說明書(20 μL)，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 3 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司測序。根據(jù)獲得的GnRH1基因中間序列設(shè)計(jì)用于5′ 和3′ RACE擴(kuò)增的引物(表1)。3′ RACE采用引物GnRH1-3′ outer和試劑盒提供的接頭引物3′ adapter進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，接著以引物GnRH1-3′ inner和3′ adapter進(jìn)行巢式PCR二輪擴(kuò)增。5′ RACE采用引物GnRH1-5′ outer和試劑盒接頭引物5′ adapter以加尾的cDNA為模板進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，然后以GnRH1-5′ inner引物和5′ adapter進(jìn)行巢式PCR第二輪擴(kuò)增。PCR目的條帶純化回收后連接到pUC-19T載體，后轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中培養(yǎng)，挑取陽性克隆送至武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司測序。

1.4 中華鱉GnRH 1基因全長及序列分析

將克隆得到的片段通過DNAMAN軟件進(jìn)行拼接，并用ORFfinder(https://www.ncbi.nlm.n ih.gov/o-rffinder/)在線工具預(yù)測基因的開放閱讀框(ORF)位置；然后利用Expasy-ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)將其翻譯為氨基酸序列并預(yù)測蛋白的相對分子質(zhì)量和等電點(diǎn)；采用在線工具SignaIP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/Sign-alP/)和TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分別對其信號肽以及跨膜區(qū)進(jìn)行預(yù)測；利用Net-Phos 3.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預(yù)測氨基酸功能位點(diǎn)；使用DNAMAN軟件對中華鱉GnRH1及其同源氨基酸序列進(jìn)行比對；使用Prabi-Geland在線工具(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopm.html)預(yù)測氨基酸的二級結(jié)構(gòu)；使用SWISS-MODEL在線工具(https://www.swissmodel.expasy.org/)構(gòu)建蛋白三維模型。

表1 中華鱉GnRH 1基因序列擴(kuò)增引物信息

1.5 中華鱉GnRH 1系統(tǒng)發(fā)育分析

從GenBank下載墨西哥箱龜(Terrapenemexicanatriunguis,XP_024067919.1)、西部頸龜(Chrysemyspictabellii,XP_005285222.1)、綠海龜(Cheloniamydas，EMP30498.1)、美國短吻鱷(Alligatormississippiensis，KYO44455.1)、揚(yáng)子鱷(A.sinensis，XP_014377775.1)、原雞(Gallusgallus，NP_001074346.1)、綠頭鴨(Anasplatyrhynchos，XP_012959602.1)、卡氏小鼠(Muscaroli，XP_021038275.1)、人(Homosapiens，NP_000816.4)、牛(Bostaurus，NP_001071605.1)、馬(Equuscaballus，XP_003364546.3)、非洲象(Loxodontaafricana，XP_023406765.1)、白鯨(Delphinapterusleucas，XP_022450743.1)、帝王鮭(Oncorhynchustshawytscha，XP_024296453.1)、銀大馬哈魚(Oncorhynchuskisutch，XP_020344148.1)、斑馬擬麗魚(Maylandiazebra，XP_004544170.1)、大黃魚(Larimichthyscrocea，KKF17334.1)、青鳉(Oryziaslatipes，NP001098169.1)、黃鱔(Monopterusalbus，XP_020446236.1)等20種物種的GnRH1氨基酸序列，利用MEGA 7.0軟件經(jīng)Clustalw序列比對后，以鄰接法(Neighbor-Joining)1 000次bootstraps，構(gòu)建基于GnRH1氨基酸序列的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 GnRH 1基因mRNA在中華鱉不同組織及不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)特征

以雌雄個(gè)體不同組織和不同發(fā)育時(shí)期胚胎的cDNA作為熒光定量PCR(qRT-PCR)模板，依據(jù)中華鱉GnRH1基因設(shè)計(jì)qRT-PCR引物，18s rRNA內(nèi)參基因引物采用已發(fā)表序列[11](表1)。利用ABI 7500熒光定量PCR儀檢測GnRH1 mRNA相對表達(dá)情況，每個(gè)樣品重復(fù)3次。PCR反應(yīng)體系為20 μL：2×SYBR Premix ExTaq 10 μL，10 μmol/L 上下游引物各 0.4 μL，ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL，cDNA 2 μL，超純水 6.8 μL；擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性 30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火34 s，共40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃退火 60 s，95 ℃ 15 s。結(jié)果采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)分析利用SPSS 22.0軟件中的單因素方差分析，差異顯著性以P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)，數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。

2 結(jié)果

2.1 中華鱉GnRH 1基因的克隆及序列特征

克隆獲得的中華鱉GnRH1基因全長cDNA共為546 bp，5′ UTR區(qū)99 bp，3′ UTR區(qū)168 bp，編碼區(qū)279 bp，含有1個(gè)加尾信號序列AATAAA(491 bp處)及PolyA(30 bp)尾，共編碼92個(gè)氨基酸；具有N端信號肽(1～23 aa)、核心十肽區(qū)域(24～33 aa)和相關(guān)肽區(qū)域(37～92 aa)，以及斷裂位點(diǎn)GKR(34～36 aa)，符合GnRH蛋白典型結(jié)構(gòu)特征(圖1)。

圖1 中華鱉GnRH 1 cDNA 序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 GnRH 1 cDNA sequence and putative amino acid of P.sinensis

2.2 中華鱉GnRH 1氨基酸序列

采用MEGA 7軟件構(gòu)建基于中華鱉GnRH1和其他20個(gè)物種氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)。結(jié)果表明，中華鱉首先與龜鱉目的墨西哥箱龜、西部頸龜、綠海龜聚為一支，然后與爬行綱的美國短吻鱷、揚(yáng)子鱷再聚為一支，最后與鳥綱中的原雞和綠頭鴨聚在一起，5種哺乳綱物種和6個(gè)硬骨魚綱物種均單獨(dú)聚為一支。

圖2 基于GnRH 1氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree for different species based on GnRH 1 AA sequences“☆”表示中華鱉

2.3 中華鱉GnRH 1基因的生物信息學(xué)

中華鱉GnRH1 cDNA序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列。起始密碼子和終止密碼子用灰色陰影部分標(biāo)出，GnRH1信號肽用單下劃線表示，斷裂位點(diǎn) GKR 用雙下劃線表示，GnRH1核心十肽置于方框內(nèi)，GnRH1相關(guān)肽(GAP)用虛下劃線表示，*表示終止密碼子，波浪線代表3′非翻譯區(qū)加尾信號AATAAA(圖3)。

中華鱉GnRH1基因編碼的蛋白質(zhì)理論分子質(zhì)量為10.23 kDa，分子式為C454H725N121O135S6，理論等電點(diǎn)pI為5.65，不穩(wěn)定指數(shù)為53.10，脂溶指數(shù)為86.96，總平均疏水指數(shù)為-0.172，為親水性蛋白。信號肽和跨膜區(qū)預(yù)測結(jié)果顯示，該蛋白信號肽切割位點(diǎn)位于第23和24個(gè)氨基酸殘基之間，N-端具有一個(gè)由23個(gè)氨基酸組成的信號肽以及一個(gè)跨膜區(qū)(7～29 aa)，為分泌蛋白；磷酸化位點(diǎn)有5個(gè)Ser，1個(gè)Thr，1個(gè)Tyr；無N糖基化位點(diǎn)。該蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋占68.48%，隨機(jī)卷曲占20.65%，β-轉(zhuǎn)角占6.52%?；谕窗被針?gòu)建的中華鱉GnRH1氨基酸三維模型(圖4)，顯示該蛋白為單鏈蛋白。

圖3 GnRH 1氨基酸序列比對Fig.3 Multiple sequences alignment of GnRH 1 amino acidsquences from different species黑色標(biāo)注保守氨基酸，紅色標(biāo)注相似性大于75%的氨基酸，藍(lán)色標(biāo)注相似性大于50%的氨基酸

圖4 中華鱉GnRH 1蛋白三級結(jié)構(gòu)模式圖Fig.4 Tertiary structure pattern of GnRH 1 protein in P.sinensis

2.4 中華鱉GnRH 1基因表達(dá)特征

通過qRT-PCR對中華鱉GnRH1基因在雌雄不同種組織中的表達(dá)特異性進(jìn)行分析，結(jié)果表明(圖5)，GnRH1基因在所檢測的8組織中均有表達(dá)，但表達(dá)量存在較大差異。雌性和雄性個(gè)體中GnRH1基因均在腦中表達(dá)量最高，在心臟中表達(dá)量最低，幾乎不表達(dá)，在腸和脾臟組織中略有表達(dá)。在雌雄個(gè)體之間，在雄性腦和性腺中的表達(dá)量顯著高于雌性(P<0.05)。中華鱉GnRH1基因在第8期、第10期至第18期10個(gè)發(fā)育時(shí)期胚胎中的表達(dá)情況如圖6所示，GnRH1基因在第8期到第11期表達(dá)量很低，第12期開始表達(dá)量顯著增高，并維持到第14期，第15期又出現(xiàn)顯著增高，第16期表達(dá)量最高，然后呈下降趨勢。

圖5 中華鱉GnRH 1基因在成體組織的表達(dá)分析Fig.5 The expression of GnRH 1 in adult tissues of P.sinensis1：心臟；2：肝臟；3：腸；4：腦；5：肌肉； 6：性腺；7：肺；8：脾臟；*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)

圖6 中華鱉GnRH 1基因在胚胎各時(shí)期的表達(dá)Fig.6 The expression of GnRH 1 in different stages of embryo不同字母表示差異顯著(P<0.05)

3 討論與結(jié)論

本研究克隆獲得的中華鱉GnRH1基因包括99 bp 5′端非編碼區(qū)，279 bp完整編碼區(qū)和168 bp 3′端非編碼區(qū)，共編碼92個(gè)氨基酸，核心十肽為QHWSYGLQPG。GnRH1基因編碼蛋白含有一個(gè)由23氨基酸構(gòu)成的信號肽，為分泌蛋白和親水性蛋白，預(yù)測三維結(jié)構(gòu)為單鏈蛋白，符合GnRH蛋白的典型特征，這與京海黃雞GnRH1蛋白性質(zhì)的研究具有相似的結(jié)果[12]。不同物種間GnRH1氨基酸序列具有較高的保守性，中華鱉與綠海龜?shù)南嗨菩宰罡邽?1%，與同為爬行綱的墨西哥箱龜、西部頸龜、美國短吻鱷和揚(yáng)子鱷同源性分別89%、88%、75%和75%。系統(tǒng)發(fā)育表明，所分析的物種分為爬行類、鳥類、哺乳類及魚類，與其分類地位一致，中華鱉與同為龜鱉目的綠海龜親緣關(guān)系最近。研究表明GnRH1的信號肽和核心十肽部分非常保守，但在不同物種間，GAPs同源性很低[14]。GnRH1是促進(jìn)性激素分泌的激素的主要形式，在不同物種中的特異性比較高，對個(gè)體性腺發(fā)育和配子生成有重要作用[9,13]。

在牙鲆、圓斑星鰈、美洲鰣魚和許氏平鮋等眾多物種中GnRH1基因的表達(dá)特征呈現(xiàn)出表達(dá)的普遍性，但在一些不同的物種中也存在差異[14-17]。美洲鰣魚中GnRH1的表達(dá)呈現(xiàn)出性別二態(tài)性，雌性美洲鰣魚腦組織中GnRH1的表達(dá)水平顯著高于雄性，從生長上來看，雌性個(gè)體往往比雄性個(gè)體大，呈現(xiàn)出生長差異。Swapna等研究了GnRH1基因在羅非魚雌雄間性的差異性表達(dá)發(fā)現(xiàn)，雄性羅非魚GnRH分泌神經(jīng)元比雌性提前出現(xiàn)10 d，數(shù)量上也高于雌性；雄性羅非魚的生長速度快于雌性，且體型往往比雌性大，分泌時(shí)間與分泌水平表現(xiàn)出的差異，可能與性別的分化以及生長的速度有關(guān)[18]。在魚類中，GnRH類似物可促進(jìn)垂體中生長激素(Growth hormone，GH)的分泌與合成，提高魚類的生長速率，給鯉、草魚、羅非魚和黑鯛等注射GnRH類似物可以提高其血清中的GH水平從而提高其生長速率[19-21]。本研究中中華鱉GnRH1表達(dá)呈現(xiàn)性別差異性，且在雄性個(gè)體的腦和性腺組織中的表達(dá)高于雌性，從二者的生長情況上來看，雄性個(gè)體往往比雌性大，呈現(xiàn)出生長上的差異，這與在美洲鰣魚及羅非魚中的研究類似[16，18]。

基于Tokita等[10]對中華鱉胚胎發(fā)育的分期，30 ℃孵化的第15 天處于胚胎發(fā)育處于第14期和第15期之間。本研究中中華鱉GnRH1在胚胎發(fā)育第15期表達(dá)量急劇上升，與李慧君[22]認(rèn)為在第15天原始性腺形成的觀點(diǎn)一致，表明該基因的表達(dá)與胚胎性腺發(fā)育有著密切關(guān)系。在美洲鰣魚、大菱鲆、條紋鱸[16,23-25]等的研究中也發(fā)現(xiàn)GnRH1的表達(dá)與性腺發(fā)育存在周期間一致性變化，推測該基因在中華鱉中與性腺發(fā)育同樣密切相關(guān)，后續(xù)將進(jìn)行相關(guān)研究驗(yàn)證。

本研究克隆獲得了中華鱉GnRH1基因序列，其編碼蛋白含有一個(gè)由23氨基酸構(gòu)成的信號肽，為分泌蛋白和親水性蛋白；并獲得了GnRH1基因在中華鱉不同組織及不同發(fā)育時(shí)期胚胎中的表達(dá)特征，為深入了解中華鱉生長繁殖的調(diào)控機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。但是由于僅研究了1齡雌雄中華鱉不同組織中的表達(dá)差異，后續(xù)還需要對中華鱉GnRH1基因在不同發(fā)育階段組織中的表達(dá)特征進(jìn)行進(jìn)一步的研究，以期獲得與雌雄生長差異之間的關(guān)系。