王利華，羅相忠，王 丹，李 偉，李 忠，鄒桂偉，梁宏偉,3

(1.中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢 430223；2.中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所，廣州 510380；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水生動物基因組學重點實驗室，武漢 430223)

鲌屬(Culter)隸屬于鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)鲌亞科(Cultrinae)，為東亞特有鯉科魚類，主要分布在中國、朝鮮、越南和俄羅斯等國[1]。在我國，除新疆和青藏高原外，廣泛分布在各大江河、湖泊和水庫中，已成為我國重要的經(jīng)濟魚類。鲌屬魚類共有9個種和亞種，由于其肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)價值高，越來越受到水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的重視，養(yǎng)殖產(chǎn)量持續(xù)增加。然而，由于過度捕撈、棲息地破壞以及水質(zhì)污染等因素的影響，天然鲌類資源數(shù)量銳減，野生鲌種群呈現(xiàn)出低齡化和小型化[2-3]。而鲌屬有些物種外部形態(tài)差異較小，準確鑒定存在一定的困難。

DNA條形碼(DNA barcoding)是2003年Hebert提出的利用線粒體DNA(mitochondrial DNA)特定片段進行物種分類鑒定的技術(shù)，并希望能賦予所有生物各自的條形碼[4]，即生物體內(nèi)能夠代表該物種，有足夠變異且容易擴增的DNA片段[5]，目前已經(jīng)廣泛應用于物種的鑒定[6-7]。在線粒體的13個編碼蛋白基因中，細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ(Cytochrome C oxidase subunit I，COⅠ)和細胞色素b(Cytochrome b，Cytb)基因是其中結(jié)構(gòu)和功能研究最為清楚，且長度適宜、相對保守、進化速度適中，具有足夠多能夠區(qū)分近緣種的變異[8,9]，已被作為DNA條形碼廣泛用于水產(chǎn)物種的鑒定、群體遺傳結(jié)構(gòu)和種群資源狀況分析[10]。

開展水產(chǎn)種質(zhì)資源鑒定、遺傳評價和挖掘利用研究的前提是對物種的準確分類和鑒定。形態(tài)學鑒定作為一種重要的傳統(tǒng)分類鑒定方法為物種的分類鑒定奠定了堅實的基礎，但該方法依賴于形態(tài)學特征和鑒定者的經(jīng)驗，而魚類的外部形態(tài)特征又往往受到棲息環(huán)境、發(fā)育階段以及性別異型的影響而存在一定的差異，增加了分類鑒定的難度，極易造成混淆，加之由于分類學觀點不同所形成的分類系統(tǒng)也往往差異較大，鑒定時有時會產(chǎn)生一些爭議或錯誤[11]。很多魚類的分類鑒定已經(jīng)無法靠單一的形態(tài)學鑒定來完成，DNA條形碼技術(shù)因不受物種發(fā)育階段和生長環(huán)境等因素的限制，且對于鑒定隱存種以及形態(tài)不易區(qū)分的物種具有明顯的優(yōu)勢，是對傳統(tǒng)形態(tài)分類學方法的有力補充[12]。

為了獲得DNA條形碼在鲌屬魚類分類鑒定中的有效性，本研究通過分析達氏鲌、海南鲌、尖頭鲌、蒙古鲌、擬尖頭鲌和翹嘴鲌6種鲌屬魚類線粒體COⅠ和Cytb基因片段的序列特征、種內(nèi)和種間的遺傳距離以及分子系統(tǒng)進化關(guān)系，探究COⅠ和Cytb基因作為DNA條形碼在鲌屬魚類物種分類鑒定中的適用性，為鲌屬魚類的準確鑒定、種質(zhì)資源的保護以及可持續(xù)挖掘利用等提供了基礎依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及DNA提取

依據(jù)《中國動物志 硬骨魚綱 鯉形目》對收集的魚類標本進行分類鑒定，共得到6種鲌屬魚類，樣品編號及采集地點等信息見表1。將標本保存于無水乙醇中，存放在中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所長江流域漁業(yè)生物標本庫中。取肌肉組織樣品進行基因組DNA的提取，提取采用本實驗室改進的高鹽法[13]，DNA經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物設計、PCR擴增及測序

線粒體COⅠ和Cytb基因分別采用通用引物COI-F：TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC，COI-R：TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA和Cytb-F：GACTTGAAAAACCACCGTTG，Cytb-R：CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC進行擴增[14]，引物由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成。

PCR擴增反應總體積為25 μL，包含10×PCR Buffer 2.5 μL，0.25 mmol/L dNTP 2 μL，Taq DNA 聚合酶(Takara)1 μL，0.2 mmol/L上下游引物各1 μL，模板DNA 50 ng，最后由超純水補足體系。反應在S1000型PCR儀上進行，擴增程序為：94 ℃預變性5 min，每個循環(huán)94 ℃變性30 s，(COⅠ，52 ℃；Cytb，47 ℃)退火45 s，72 ℃延伸50 s，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增產(chǎn)物經(jīng)2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 研究所用樣本信息

PCR擴增產(chǎn)物用DNA片段凝膠回收試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)進行膠回收純化后，使用Solution I(Takara)將純化產(chǎn)物與pMD18-T載體(Takara)連接克隆，挑選陽性菌落，送至武漢天一輝遠生物科技有限公司進行測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

獲得的6種魚類基因序列通過DNAStar軟件對其進行比對和人工校正后，與GenBank中已提交序列比對驗證，并從GenBank得到5種鲌屬魚類線粒體全基因組11個(序列信息見表1)，獲取COⅠ和Cytb相應擴增區(qū)域。利用DnaSP 5.10軟件計算序列的保守位點(C)、變異位點(V)、簡約信息位點(Pi)及自裔位點(S)等參數(shù)；MEGA 7.0計算堿基組成、序列間的堿基變異頻率和序列間的轉(zhuǎn)換、顛換頻率和轉(zhuǎn)換顛換比等。利用DAMBE 5.02進行序列替代飽和度分析，并利用MEGA 7.0通過K2P(Kimura 2-parameter)雙參數(shù)替代模型計算種內(nèi)距離和種間距離，并以此模型構(gòu)建鲌屬六種魚類基于COⅠ和Cytb基因片段的鄰接(Neighbor-Joining，NJ)樹，以三角魴(Megalobramaterminalis，GP7)和團頭魴(Megalobramaamblycephala，GP8 )為外群，采用1 000次自展分析檢驗(bootstrap)各個節(jié)點的置信度[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿基組成及序列變異

2.1.1COⅠ的堿基組成特點分析

獲得6種鲌屬魚類50條COⅠ基因序列長度為645 bp，其中，保守位點582個，變異位點63個，簡約信息位點56個和自裔位點7個，沒有發(fā)現(xiàn)任何堿基的插入和缺失(表2)，共發(fā)生轉(zhuǎn)換17次，顛換2次，轉(zhuǎn)換位點與顛換位點比率R為6.68。COⅠ基因序列的A、T、G和C堿基平均含量分別為25.65%、28.18%、18.33%和27.84%，(A+T)含量53.83%明顯高于(G+C)的含量46.17%，堿基G的含量最低，表現(xiàn)出明顯的堿基偏倚性，堿基組成在6種鲌屬魚間無顯著差異，與其他硬骨魚類線粒體COⅠ基因堿基組成的基本特征一致[15]；COⅠ第一密碼子的GC平均含量為58.57%，第二和第三密碼子的平均含量分別為43.33%和37.18%。堿基變異主要發(fā)生在第三位密碼子，堿基變異較大，進化速度最快，第二密碼子位點最穩(wěn)定，無轉(zhuǎn)換與顛換發(fā)生。

表2 6種鲌屬魚類COⅠ基因序列堿基組成

注：ii=不變位點數(shù)；si=轉(zhuǎn)換數(shù)；sv=顛換數(shù)；R=si/sv，表3同。

2.1.2Cytb的堿基組成特點分析

50個個體Cytb基因片段長度為970 bp的，包含保守位點824個，變異位點146個，簡約信息位點139個，自裔位點7個，轉(zhuǎn)換與顛換比率R為9.53.Cytb基因序列的平均堿基組成為27.97% A、27.93% T、14.53% G、29.57% C(表3)，AT含量為55.90%，明顯高于GC含量(44.10%)，堿基G含量約為C含量的1/2，明顯低于其他3種堿基含量，與已報道魚類線粒體Cytb基因序列特征一致[16]，不同鲌屬魚的Cytb序列堿基組成無明顯差異；Cytb第一密碼子的GC平均含量為43.99%，第二密碼子為46.17%，第三密碼子為41.56%；轉(zhuǎn)換位點和顛換位點總數(shù)分別為45個和5個，堿基變異均勻的分布于該序列的各個區(qū)域，但有明顯的密碼子偏好，第一密碼子的轉(zhuǎn)換和顛換位點最多，分別為29個和3個，堿基轉(zhuǎn)換與顛換的比值為8.20，轉(zhuǎn)換明顯多于顛換。

表3 6種鲌屬魚類Cytb基因序列堿基組成

2.2 COⅠ與Cytb遺傳距離分析

生物條形碼協(xié)會(Consortium for the Barcode of Life，CBOL)推薦K2P雙參數(shù)模型作為計算遺傳距離的方法[17]?；?0個個體COⅠ和Cytb基因序列，采用K2P雙參數(shù)模型統(tǒng)計的六種鲌屬魚類的種內(nèi)、種間的遺傳距離見表4和表5?；贑OⅠ基因序列的種內(nèi)遺傳距離為0%～0.3%，平均遺傳距離為0.17%，種間遺傳距離為0.3%～5.0%，平均遺傳距離為3.54%，種間遺傳距離是種內(nèi)遺傳距離的20.82倍；基于Cytb基因序列的種內(nèi)遺傳距離為0%～0.4%，平均遺傳距離為0.18%，種間遺傳距離為0.1%～7.4%，平均遺傳距離為5.92%，種間遺傳距離是種內(nèi)遺傳距離的32.89倍；基于COⅠ和Cytb基因序列的六種鲌屬魚類種內(nèi)遺傳距離均小于2%的標準[18]，大部分魚類的種間與種內(nèi)遺傳距離的比值均符合“10×規(guī)則”[19]，COⅠ與Cytb均能作為條形碼較好地區(qū)分6種鲌。但是，也有一些魚類種間的遺傳距離小于10倍的種內(nèi)遺傳距離?；贑OⅠ基因序列的翹嘴鲌和海南鲌、尖頭鲌和擬尖頭鲌之間的種間距離/種內(nèi)遺傳距離小于10×的標準，然而，基于Cytb基因序列的翹嘴鲌與海南鲌種間距離/種內(nèi)距離符合10×標準，但尖頭鲌與擬尖頭鲌的種間距離/種內(nèi)距離仍然小于10×標準。

表4 鲌屬六種魚類基于COⅠ基因序列的種內(nèi)和種間遺傳距離

表5 鲌屬六種魚類基于Cytb基因序列的種內(nèi)和種間遺傳距離

2.3 飽和度分析

COⅠ和Cytb基因的序列替代飽和度分別運用DAMBE 5.02軟件進行測試，得出的結(jié)果如表6、表7所示，Iss

表6 COⅠ基因飽和度分析結(jié)果

表7 Cytb基因飽和度分析結(jié)果

2.4 系統(tǒng)進化樹分析

采用鄰接法構(gòu)建鲌屬六種魚類的NJ樹，以三角魴(Megalobramaterminalis，GP7)和團頭魴(M.amblycephala，GP8 )作為外群，進行1 000次自展分支檢驗構(gòu)建鄰接進化樹(NJ)，構(gòu)建的基于COⅠ和Cytb基因序列的系統(tǒng)進化樹見圖1和圖2，基于COⅠ與Cytb基因序列的分子進化樹結(jié)果基本一致，基本上同一物種的個體首先聚在一起，再與同一屬的其他物種序列聚在一起，翹嘴鲌全部個體聚在一起形成一個單系(節(jié)點支持率為100%、99%)，達氏鲌(節(jié)點支持率為98%、100%)和蒙古鲌(節(jié)點支持率為99%、100%)的全部個體也分別形成單系，海南鲌6個體形成一個單系(節(jié)點支持率為100%、100%)，這4種鲌均能得到有效區(qū)分。而擬尖頭鲌在基于COⅠ構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹中未能首先聚在一起，但基于Cytb的系統(tǒng)進化樹中能夠得到有效區(qū)分。

圖1 基于COⅠ基因的六種鲌屬魚類NJ系統(tǒng)進化樹Fig.1 NJ tree based on COⅠsequences of 6 Culter species注：C.dabryi 1-10，本研究序列；C.dabryi 11-15，GenBank獲取序列；C.recurviceps 1-5，本研究序列；C.recurviceps 6，GenBank獲取序列；C.mongolicus 1-10，本研究序列；C.mongolicus 11，GenBank獲取序列；C.oxycephaloides 1-3，本研究序列，C.oxycephaloides 4-5，GenBank獲取序列；C.alburnus1-10，本研究序列；C.alburnus11-12，GenBank獲取序列.

圖2 鲌屬六種魚類基于Cytb基因的NJ系統(tǒng)進化樹Fig.2 NJ tree based on Cytb sequences of 6 Culter species注：C.dabryi 1-10，本研究序列；C.dabryi 11-15，GenBank獲取序列；C.recurviceps 1-5，本研究序列；C.recurviceps6，GenBank獲取序列；C.mongolicus 1-10，本研究序列；C.mongolicus 11，GenBank獲取序列；C.oxycephaloides 1-3，本研究序列，C.oxycephaloides 4-5，GenBank獲取序列；C.alburnus1-10，本研究序列；C.alburnus11-12，GenBank獲取序列.

3 討論

3.1 COⅠ與Cytb基因序列

鲌屬六種魚類的COⅠ與Cytb基因AT含量都明顯高于GC的含量，與在硬骨魚類上的堿基組成一致[14,16]。COⅠ第一密碼子的GC平均含量最高，第三密碼子含量最低，與彭居俐等[19]報道的鯉科鲌屬魚類結(jié)果相符，也與柳淑芳等[20]報道的石首魚科的結(jié)果一致；Cytb第一密碼子的平均GC含量為43.99%，第二密碼子含量最高(46.17%)，第三密碼子的GC含量最低，這與劉璐等[7]報道的鯔科魚類的結(jié)果一致，COⅠ和Cytb基因序列的GC含量(46.17%、44.10%)均低于AT(53.83%、55.90%)含量，表明了鲌屬魚類線粒體基因組在進化上存在很強的GC→AT的選擇壓力，符合線粒體基因組的堿基組成特點[7]。在DNA的進化過程中，通常轉(zhuǎn)換發(fā)生的頻率比顛換高的多，進化速率由轉(zhuǎn)換與顛換的比值R來衡量[21]。COⅠ和Cytb基因序列的轉(zhuǎn)換顛換比R分別為6.68和9.53，遠大于2，表明基因序列替換遠未達到飽和[11,19]。

3.2 物種鑒定

Ward研究了隸屬于11個門的13 320個物種的COⅠ序列，認為2%的遺傳距離可以有效區(qū)分為不同物種，大多數(shù)種內(nèi)序列之間的差異均低于1%[15]。Avise等[22]也確定了2%的Cytb序列差異用于區(qū)分脊椎動物的不同物種，本研究中，COⅠ和Cytb鲌屬六個種群內(nèi)差異均遠小于臨界值，與謝佳燕等[23]在鯉科鲌屬魚類線粒體COⅠ基因DNA條形碼種內(nèi)遺傳距離均小于1%的研究結(jié)果相一致。但是，基于COⅠ基因序列的翹嘴鲌和海南鲌種間/種內(nèi)遺傳距離小于10，而基于Cytb基因序列的種間/種內(nèi)遺傳距離符合10×規(guī)則，可能由于COⅠ基因序列片段較短，包含的信息還比較有限，將COⅠ與Cytb基因結(jié)合起來用于DNA條形碼來進行鲌屬魚類的分類鑒定更加可靠；然而，無論基于COⅠ還是Cytb基因序列，尖頭鲌和擬尖頭鲌種間/種內(nèi)遺傳距離均小于10，究其原因可能是：尖頭鲌和擬尖頭鲌數(shù)量偏少，本研究中只收集到尖頭鲌1尾個體，擬尖頭鲌也僅有5條，且GenBank中沒有尖頭鲌的基因序列信息，兩個物種親緣關(guān)系較近，形態(tài)特征存在很多相似之處，尖頭鲌與擬尖頭鲌的外部形態(tài)差別較小，僅依據(jù)COⅠ和Cytb序列提供的變異信息不足以將物種有效分開，因此，僅使用COⅠ和Cytb作為DNA條形碼仍顯不足，還需要收集更多的憑證標本，聯(lián)合更多的線粒體DNA分子標記或核基因分子標記進行進一步的深入研究。

3.3 基于COⅠ與Cytb鲌屬魚類的系統(tǒng)進化分析

線粒體DNA具有進化速率快，呈母系遺傳等特點，相對于AFLP、ISSR和RAPD等序列分析方法而言，在系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系構(gòu)建方面更加準確和可靠[24,25]。本研究利用獲得的COⅠ和Cytb基因片段進行鲌屬魚類的系統(tǒng)發(fā)育研究結(jié)果顯示，翹嘴鲌均先與海南鲌聚在一起形成一個姐妹群，然后再與達氏鲌相聚，形成一個單系群，親緣關(guān)系較近，這與馮曉宇等報道的鲌屬研究結(jié)果基本一致[26]；尖頭鲌和擬尖頭鲌聚合后再與蒙古鲌聚為一支，也形成一個單系群，具有較近的親緣關(guān)系，節(jié)點支持率均較高?；趦蓚€基因序列得到的系統(tǒng)進化樹高度相似，說明本研究得到的鲌屬六種魚的系統(tǒng)關(guān)系具有較高的可靠性。但與Zhang等[27]在鲌屬形態(tài)學分類中翹嘴鲌和海南鲌聚在一起后與達氏鲌和尖頭鲌聚合的姐妹群形成一個單系，然后與擬尖頭鲌聚在一起，最后與蒙古鲌聚合的結(jié)果不完全相符，這可能是由于分子系統(tǒng)發(fā)育與形態(tài)特征存在不一致的現(xiàn)象造成的，也可能是由于本研究中樣本數(shù)偏少，序列包含的信息不足導致的。因此，下一步將更大范圍內(nèi)采集鲌屬魚類，收集更多的憑證標本，結(jié)合形態(tài)學，進行鲌屬魚類的系統(tǒng)進化關(guān)系研究。