朱燦燦，陳 晨，王大慧，衛(wèi)功元*

（蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇 蘇州 215123）

普魯蘭是一種由α-1,4-糖苷鍵連接的麥芽三糖重復(fù)單位經(jīng)α-1,6-糖苷鍵聚合而成的水溶性直鏈微生物多糖[1-2]。普魯蘭安全無毒，具有可塑性、成膜性、吸附性以及耐熱、耐鹽和耐酸堿等優(yōu)良特性，因此，在食品加工、生物醫(yī)藥、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域均具有廣泛的應(yīng)用前景[3-7]。

作為一種高分子聚合物，普魯蘭大多是由出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）在好氧條件下利用簡單糖類物質(zhì)合成并分泌到胞外的[8]。在普魯蘭的發(fā)酵生產(chǎn)過程中，多糖的產(chǎn)量和分子質(zhì)量是兩個重要的過程參數(shù)，前者的大小主要取決于前體物質(zhì)的供給以及出發(fā)菌株合成普魯蘭的能力，而后者則與普魯蘭的降解密切相關(guān)[9]。出芽短梗霉胞內(nèi)的α-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶（α-phosphoglucose mutase，PGM）、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（uridine diphosphate glucose pyrophosphorylase，UGP）和葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（glucosyltransferase，F(xiàn)KS）是普魯蘭合成代謝途徑中的3 個關(guān)鍵酶，是控制普魯蘭能否實(shí)現(xiàn)高效合成的瓶頸因素[10]；胞外的普魯蘭降解酶（包括α-淀粉酶和普魯蘭酶等）主要參與普魯蘭的降解反應(yīng)，最終影響到普魯蘭的分子質(zhì)量[11-12]，而分子質(zhì)量的大小又將決定普魯蘭的應(yīng)用范圍[13]。

在普魯蘭的生物合成過程中，前體物質(zhì)尿苷二磷酸葡萄糖（uridine diphosphate glucose，UDPG）和能量物質(zhì)ATP的供給與消耗速率是影響普魯蘭產(chǎn)量和合成效率的關(guān)鍵因素，而胞內(nèi)UDPG和ATP含量均與底物的種類和水平密切相關(guān)[14-15]。出芽短梗霉能利用多種簡單糖類物質(zhì)（如葡萄糖、蔗糖和木糖等）作為底物合成普魯蘭[2]。Sheng Long等[16]通過對胞內(nèi)呋喃果糖苷酶的活性進(jìn)行檢測，認(rèn)為蔗糖是實(shí)現(xiàn)普魯蘭高產(chǎn)較為理想的底物；薛文嬌等[17]運(yùn)用發(fā)酵動力學(xué)模型探討了不同蔗糖質(zhì)量濃度下普魯蘭發(fā)酵過程中的細(xì)胞生長、多糖合成和底物消耗的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)采用50 g/L蔗糖補(bǔ)料分批發(fā)酵比分批發(fā)酵更為高效；Chen Yefu等[18]通過優(yōu)化發(fā)酵條件，提高了由木糖和半纖維素水解液生物合成普魯蘭的產(chǎn)量和效率。然而，截至目前，鮮有針對出芽短梗霉利用不同糖類物質(zhì)合成普魯蘭生理機(jī)制的研究報(bào)道。為此，本研究考察不同底物條件對普魯蘭分批發(fā)酵產(chǎn)量和分子質(zhì)量的影響，并從發(fā)酵動力學(xué)、關(guān)鍵酶活性以及胞內(nèi)物質(zhì)和能量代謝等角度對普魯蘭生物合成的生理生化機(jī)制進(jìn)行解析，研究結(jié)果將為具有不同應(yīng)用潛力的普魯蘭的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

A. pullulans CCTCC M 2012259由蘇州大學(xué)微生物生理與代謝調(diào)控研究室保藏。

種子培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，自然pH值。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖（或蔗糖，或木糖）100 g/L，酵母粉3 g/L，(NH4)2SO40.6 g/L，K2HPO42 g/L，NaCl 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，pH 3.8。

磷酸葡萄糖變位酶聯(lián)免疫分析測試盒 上海皓塵生物科技有限公司；尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶聯(lián)免疫分析測試盒 上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司；所有試劑均為國產(chǎn)分析純，購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BIOTECH-5BGZ攪拌式發(fā)酵罐 上海保興生物設(shè)備工程有限公司；LD5-2A離心機(jī) 北京京立離心機(jī)有限公司；1525高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國Waters公司；T6新世紀(jì)紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SW-CJ-2A超凈工作臺 吳江市龍宏凈化設(shè)備有限公司；HZ-2010K恒溫?fù)u瓶柜 太倉市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司；LDZX-50KB滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 種子培養(yǎng)

將在-70 ℃超低溫冰箱中保藏的菌種（1 mL）接種入裝有50 mL種子培養(yǎng)基的三角瓶中，于30 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)24 h。

1.3.2 分批培養(yǎng)

按照10%（V/V）的接種量將種子接種至裝有3 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中，在30 ℃、400 r/min和3 L/min通氣量的條件下進(jìn)行分批培養(yǎng)。pH值采用梅特勒電極在位監(jiān)測，并通過自動流加3 mol/L H2SO4或3 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為3.8±0.02。

1.3.3 細(xì)胞干質(zhì)量與普魯蘭產(chǎn)量測定

取20 mL發(fā)酵液，80 ℃水浴15 min滅活，冷卻至室溫后在12 000 r/min離心10 min。沉淀用蒸餾水洗滌3 次，收集細(xì)胞后于70 ℃烘干至質(zhì)量恒定，計(jì)算得到細(xì)胞干質(zhì)量；取離心后的上清液10 mL，加入2 倍體積無水乙醇，4 ℃處理12 h，12 000 r/min離心10 min，將沉淀于70 ℃烘干至質(zhì)量恒定，計(jì)算得到普魯蘭產(chǎn)量。

1.3.4 無細(xì)胞提取物的制備

取5 mL發(fā)酵液，于4 ℃、12 000 r/min離心10 min，生理鹽水洗滌2 次后，將濕細(xì)胞重新懸浮在5 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖溶液（pH 7.0）中，超聲破碎10 min（破碎10 s，間隔10 s），在4 ℃、12 000 r/min離心20 min后得到的上清液即為無細(xì)胞提取物，用于測定胞內(nèi)物質(zhì)含量和關(guān)鍵酶活性。

1.3.5 指標(biāo)測定

發(fā)酵液中葡萄糖和木糖的測定采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法[19]；蔗糖先用6 mol/L鹽酸在沸水中處理10 min，然后采用DNS法進(jìn)行測定；普魯蘭分子質(zhì)量的測定采用黏度法[20]。

胞內(nèi)UDPG含量采用HPLC法進(jìn)行測定[21]。色譜柱為Supelcosil LC-18-DB柱（4.6 mm×250 mm），流動相為40 mmol/L三乙胺-乙酸緩沖液（pH 6.0），流速1 mL/min，柱溫22 ℃，檢測波長254 nm。

胞內(nèi)NADH和ATP的測定采用HPLC法[15]。

1.3.6 酶活性測定

普魯蘭合成能力測定采用全細(xì)胞轉(zhuǎn)化法[22]。取5 mL發(fā)酵液，12 000 r/min離心10 min，將濕細(xì)胞重懸于5 mL轉(zhuǎn)化液（5 g/L葡萄糖，0.2 g/L MgSO4·7H2O，pH 6.0）中，然后在30 ℃、200 r/min搖床中轉(zhuǎn)化3 h。轉(zhuǎn)化結(jié)束后，檢測生成的普魯蘭含量。

普魯蘭降解酶系活性測定[23]。取5 mL發(fā)酵液，12 000 r/min離心10 min，將上清液與普魯蘭標(biāo)準(zhǔn)品混合后于50 ℃水浴鍋中保溫反應(yīng)3 h。反應(yīng)結(jié)束后，立即在100 ℃加熱終止反應(yīng)，測定反應(yīng)前和反應(yīng)后上清液中還原糖的濃度。在50 ℃條件下，將每分鐘釋放1 μmol還原糖所參與普魯蘭降解的酶量定義為1 個酶活單位（U）。

PGM活性：采用磷酸葡萄糖變位酶聯(lián)免疫分析測試盒進(jìn)行測定；UGP活性：采用尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶聯(lián)免疫分析測試盒進(jìn)行測定，具體操作步驟參照試劑盒說明書執(zhí)行；FKS活性：測定方法參見文獻(xiàn)[15]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3 次檢測結(jié)果的平均值。Excel 2010軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同底物對普魯蘭分批發(fā)酵的影響

圖1 不同底物條件下的細(xì)胞生長和普魯蘭分批發(fā)酵過程Fig. 1 Time-course curve of cell growth and pullulan production using different sugars as substrates

不同底物（葡萄糖、蔗糖和木糖）條件下的A. pullulans CCTCC M 2012259細(xì)胞生長、普魯蘭生物合成以及分子質(zhì)量的變化情況如圖1所示?？梢钥闯?，出芽短梗霉細(xì)胞能夠很好地利用3 種糖進(jìn)行生長并合成普魯蘭，細(xì)胞干質(zhì)量和普魯蘭產(chǎn)量分別在72 h和120 h時達(dá)到最大值，而普魯蘭最大分子質(zhì)量則出現(xiàn)在18 h。此外，細(xì)胞利用單糖（葡萄糖和木糖）比利用蔗糖時具有更高的生長速率。然而，在發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源供給一定的情況下，3 種糖作為碳源時的最終細(xì)胞干質(zhì)量沒有顯著差異。

表1 不同底物條件下的普魯蘭分批發(fā)酵動力學(xué)參數(shù)Table 1 Fermentation kinetic parameters using different sugars as substrates

與細(xì)胞生長不同的是，底物對普魯蘭生物合成具有較大的影響。利用蔗糖可以獲得更高的普魯蘭合成速率和產(chǎn)量，最終普魯蘭產(chǎn)量比利用葡萄糖和木糖時分別提高了15.5%和19.1%；而利用葡萄糖更有利于獲得較高的分子質(zhì)量，普魯蘭的最大分子質(zhì)量和最終分子質(zhì)量（120 h）均高于利用蔗糖和木糖時的水平。此外，與已有研究[15]相比，初糖質(zhì)量濃度為100 g/L時的普魯蘭得率和生產(chǎn)強(qiáng)度均處于較高的水平（表1）。綜合普魯蘭分批發(fā)酵過程（圖1）以及其他動力學(xué)參數(shù)（表1）結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，蔗糖有利于獲得更高的普魯蘭產(chǎn)量而葡萄糖有助于維持更高的普魯蘭分子質(zhì)量。以下將分別從關(guān)鍵酶活性以及物質(zhì)和能量代謝的角度對不同底物影響普魯蘭生物合成的生理機(jī)制進(jìn)行探討。

2.2 普魯蘭合成能力和降解酶活性

在分批發(fā)酵過程中，普魯蘭生物合成速率的高低由胞內(nèi)合成酶系的能力決定[22]，而普魯蘭分子質(zhì)量的大小則與胞外的降解酶系活性密切相關(guān)[15,23]。為此，分別測定分批發(fā)酵前期出芽短梗霉細(xì)胞的普魯蘭合成能力和發(fā)酵后期降解酶活性，結(jié)果見圖2。可以看出，無論細(xì)胞利用何種糖作為碳源，發(fā)酵前期（18 h）的細(xì)胞均具有更高的普魯蘭合成能力，而發(fā)酵后期（72 h）的胞外普魯蘭降解酶系具有更高的活性。與此同時，相較于葡萄糖和木糖，蔗糖不僅提高了普魯蘭的合成能力，而且也提升了胞外普魯蘭降解酶系的活性。

圖2 不同底物條件下的普魯蘭合成能力和降解酶系活性Fig. 2 Pullulan biosynthesis and pullulan-degrading activity with different substrates

2.3 普魯蘭合成關(guān)鍵酶活性

圖3 不同底物條件下的普魯蘭合成關(guān)鍵酶活性Fig. 3 Key enzymes activities involved in pullulan biosynthesis with different substrates

PGM、UGP和FKS是普魯蘭生物合成途徑中的3 種關(guān)鍵酶，其活性大小與普魯蘭能否高效合成密切相關(guān)[10]。為此，對不同培養(yǎng)階段下的各關(guān)鍵酶活性進(jìn)行測定，結(jié)果見圖3。可以發(fā)現(xiàn)，不論細(xì)胞利用葡萄糖、蔗糖還是木糖，3 種關(guān)鍵酶均在發(fā)酵前期保持較高的活性，隨后逐漸下降。此外，在普魯蘭合成期（18、36 h），蔗糖存在下的PGM、UGP和FKS活性均高于葡萄糖和木糖；至72 h時，不同底物條件下的各關(guān)鍵酶活性差異不大。由此可見，蔗糖比葡萄糖和木糖更有利于將3 種關(guān)鍵酶活性維持在較高的水平，從而促進(jìn)普魯蘭的生物合成。

2.4 胞內(nèi)UDPG水平

UDPG是普魯蘭生物合成的直接前體物質(zhì)[1,24]，胞內(nèi)UDPG水平是決定普魯蘭合成速率的關(guān)鍵因素。出芽短梗霉細(xì)胞進(jìn)入普魯蘭合成期（36、72 h）時的胞內(nèi)UDPG含量見圖4?？梢钥闯?，細(xì)胞在利用葡萄糖、蔗糖和木糖合成普魯蘭時，胞內(nèi)UDPG在發(fā)酵前期（36 h）比后期（72 h）具有更高的水平。同時，細(xì)胞利用蔗糖后能將底物更多地轉(zhuǎn)化為UDPG并積累在胞內(nèi)，這為普魯蘭的進(jìn)一步過量合成提供了更高的內(nèi)在驅(qū)動力。

圖4 不同底物條件下的胞內(nèi)UDPG含量Fig. 4 Levels of intracellular UDPG with different substrates

2.5 胞內(nèi)能量物質(zhì)水平

在普魯蘭生物合成過程中，除前體物質(zhì)UDPG以外，充足的能量供給也是普魯蘭過量合成的必要條件[15,25]。為此，測定不同培養(yǎng)階段出芽短梗霉細(xì)胞內(nèi)與能量代謝有關(guān)的輔因子NADH和ATP含量。圖5表明，在快速生長期（18 h），細(xì)胞利用葡萄糖和蔗糖后胞內(nèi)NADH和ATP含量明顯高于利用木糖的結(jié)果；至36 h時，利用蔗糖的細(xì)胞其胞內(nèi)NADH和ATP含量最高；而在72 h時，胞內(nèi)NADH和ATP含量均處于較低水平。由此可見，在普魯蘭合成期，蔗糖可提供比葡萄糖和木糖更多的能量物質(zhì)，以保障普魯蘭過量合成對ATP的需求。

圖5 不同底物條件下的胞內(nèi)NADH和ATP含量Fig. 5 Levels of intracellular NADH and ATP with different substrates

3 討 論

目前已經(jīng)有不少關(guān)于出芽短梗霉細(xì)胞利用不同糖類物質(zhì)作為底物合成普魯蘭的文獻(xiàn)報(bào)道[26-29]。然而，普魯蘭的合成是一個復(fù)雜的生物過程，相關(guān)生理生化機(jī)制至今仍未完全搞清楚[1,16]。普魯蘭的合成效率、產(chǎn)量以及分子質(zhì)量等指標(biāo)會隨著底物的不同而發(fā)生變化[2,6]，但是鮮有研究對這些差異產(chǎn)生的原因進(jìn)行探索。為此，本實(shí)驗(yàn)研究底物對普魯蘭分批發(fā)酵的影響，重點(diǎn)對蘊(yùn)含在其中的生理機(jī)制進(jìn)行解析。

首先，根據(jù)普魯蘭的生物合成代謝途徑，發(fā)酵培養(yǎng)基中的糖類物質(zhì)經(jīng)出芽短梗霉細(xì)胞代謝，在PGM和UGP的作用下形成前體物質(zhì)UDPG，然后UDPG在FKS的作用下形成麥芽三糖，最后再在FKS的作用下跨膜聚合形成普魯蘭[30-31]。因此，在底物糖類物質(zhì)充足的前提下，提高PGM和UGP活性有助于加快UDPG的合成速率；同時，較高的胞內(nèi)UDPG水平和FKS活性也更有利于提高普魯蘭的合成速率，并最終提高普魯蘭產(chǎn)量[24]。本研究結(jié)果表明，出芽短梗霉細(xì)胞在利用蔗糖時具有更高的PGM、UGP和FKS活性，胞內(nèi)UDPG水平更高，體現(xiàn)出細(xì)胞具有更強(qiáng)的普魯蘭合成能力，因此在底物濃度相同的情況下，可以獲得更高的普魯蘭產(chǎn)量。葡萄糖和木糖也可以直接用于合成普魯蘭，然而其關(guān)鍵酶活性和前體物質(zhì)含量均低于利用蔗糖時的水平。

其次，作為一種微生物多糖，分子質(zhì)量是普魯蘭這種聚合物的重要特征之一，而分子質(zhì)量的大小也是影響普魯蘭應(yīng)用范圍的主要因素[32]。有研究報(bào)道，在發(fā)酵后期普魯蘭分子質(zhì)量的降低與普魯蘭降解酶系活性有關(guān)[22]。Manitchotpisit等[12]將普魯蘭在合成過程中的降解歸功于細(xì)胞分泌的α-淀粉酶或普魯蘭酶，這種過程的最終結(jié)果不是普魯蘭的完全降解，而是普魯蘭長鏈中的小部分α-1,4-或α-1,6-糖苷鍵發(fā)生斷裂，導(dǎo)致普魯蘭分子質(zhì)量的降低。由于分批發(fā)酵過程中α-淀粉酶和普魯蘭酶活性較低[33]，很難獲得準(zhǔn)確數(shù)據(jù)，因此常用普魯蘭降解酶系的活性來表示[23]。本研究結(jié)果表明，在葡萄糖存在的情況下，普魯蘭降解酶系的活性一直處于相對較低的水平；而蔗糖和木糖則有利于提高降解酶系的活性，普魯蘭在降解酶的作用下，最終的分子質(zhì)量均低于利用葡萄糖時的水平。由此可見，蔗糖有利于提高普魯蘭產(chǎn)量和得率，但葡萄糖卻有助于將普魯蘭分子質(zhì)量維持在較高水平。

此外，在普魯蘭生物合成中，ATP是不可或缺的能量物質(zhì)。Taguchi等[14]報(bào)道過在不添加ATP的情況下，無細(xì)胞酶液無法利用底物在胞外合成普魯蘭。在好氧發(fā)酵條件下，胞內(nèi)ATP是由NADH經(jīng)氧化磷酸化過程合成的，因此胞內(nèi)NADH含量及其轉(zhuǎn)化速率將直接影響到ATP的供給效率[15]。本研究中胞內(nèi)NADH和ATP含量測定結(jié)果表明，出芽短梗霉細(xì)胞在利用蔗糖和葡萄糖時，胞內(nèi)能量代謝物質(zhì)的水平相對較高，特別是在普魯蘭快速合成期更為顯著，這為普魯蘭的過量合成提供了充足的能量保障。而木糖作為一種五碳糖，在其參與普魯蘭合成之前，需要經(jīng)歷較長的代謝途徑并消耗一定的能量[18]，因此胞內(nèi)NADH和ATP含量一直處于較低的水平，最終降低了普魯蘭的合成速率和產(chǎn)量。

綜上，考察葡萄糖、蔗糖和木糖3 種底物對普魯蘭分批發(fā)酵的影響，發(fā)現(xiàn)蔗糖有利于普魯蘭的高產(chǎn)而葡萄糖有助于獲得更高的分子質(zhì)量。在分析發(fā)酵動力學(xué)參數(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合關(guān)鍵酶活性以及胞內(nèi)物質(zhì)和能量代謝水平，部分解析了不同底物影響普魯蘭生物合成的生理生化機(jī)制。研究結(jié)果增加了對普魯蘭產(chǎn)量和分子質(zhì)量影響因素的認(rèn)識，同時也為深入探究不同分子質(zhì)量普魯蘭的高產(chǎn)提供思路。