樊潔敏，唐 蓉，王雅瑩，朱軍莉*，陸海霞

（浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江省食品安全重點實驗室，浙江 杭州 310018）

熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）是一種好氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性菌，無菌毛，有數(shù)根極端鞭毛，廣泛存在于水生環(huán)境和食品中，是牛奶、肉制品、水產(chǎn)品等富含蛋白和脂類食品中重要嗜冷腐敗菌[1]。研究表明，熒光假單胞菌分泌的蛋白酶和酯酶等代謝產(chǎn)物難以用瞬時高溫滅活，導致冷藏食品的風味等理化性質變化[2]。在食品環(huán)境中假單胞菌還常在生產(chǎn)設備表面形成生物膜，生物被膜成為假單胞菌的寄所，被膜菌對食品加工過程中各種環(huán)境壓力（低溫、酸、鹽、消毒劑）的抵抗力都有所提高。因此，致腐被膜菌是一種生產(chǎn)加工中生物危害的潛在污染源[3]。

自然界中大部分微生物并非以單個浮游狀態(tài)存在，多以群體生物被膜形式生存。生物被膜是微生物黏附于物體（或人體組織）表面，通過分泌的多糖基質、蛋白質、核酸等構成的胞外聚合物共同組成高度組織化的三維結構[4]。根據(jù)微生物黏附介質可以將生物被膜分為固液被膜、氣固被膜、氣液被膜（薄膜）3 種形式[5]。生物被膜的形成受鞭毛[6]、胞外多聚物等內(nèi)在條件，及菌種、營養(yǎng)條件[7]、溫度[8]、接觸介質[8]類型等外部因素的影響。食品中含有多種金屬元素，而環(huán)境中金屬離子能影響細菌生物被膜的形成和發(fā)展。研究表明，0.5 mmol/L Cu2+能減弱嗜水氣單胞菌生物被膜形成和毒力[9]，添加0.05% Mn2+、Ca2+、Fe2+對單增李斯特菌生物被膜無影響，而Cu2+可抑制被膜形成及胞外多糖分泌[10]，Mg2+、Cu2+、Fe3+在0.25%～1.5%范圍都能抑制副溶血性弧菌生物被膜形成[11]。目前，僅報道環(huán)境金屬離子影響不同種屬細菌的生物被膜形成存在差異影響，而未對作用濃度及機制進行深入研究。海產(chǎn)品和奶制品富含鈣質，已報道Ca2+在0.5%和1%條件下分別能促進副溶血性弧菌[8]和銅綠假單胞菌[12]的生物被膜形成，在2.5～6.5 mmol/L濃度條件下顯著刺激嗜水氣單胞菌的被膜[13]。然而，Ca2+對水產(chǎn)品致腐菌熒光假單胞菌生物被膜形成的影響仍鮮見報道。

鑒于此，本研究分析不同濃度CaCl2對熒光假單胞菌生物被膜、胞外聚合物、薄膜形成、細胞運動性的影響，并觀察Ca2+作用下生物被膜結構的變化，實時熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測被膜相關基因動態(tài)變化，從多角度探究Ca2+對熒光假單胞菌被膜形成的調控作用，旨在闡明食品中內(nèi)源成分影響腐敗菌生物被膜的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

熒光假單胞菌PF07分離于腐敗冷藏大黃魚，被鑒定為特定腐敗菌，16S RNA登錄號KT716389。

LB肉湯、PCA瓊脂和泳動性培養(yǎng)基（胰蛋白胨1%，NaCl 0.5%，瓊脂0.3%） 青島海博生物有限公司；CaCl2阿拉丁有限公司；熒光染料SYTO9美國Thermo Fisher公司；96、24、6 孔細胞培養(yǎng)板美國Costar公司。

1.2 儀器與設備

LRH-250A型生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；VICTOR X酶標儀 美國Perkin Elmer公司；臺式高速冷凍離心機 美國Sigma公司；LSM 710共聚焦掃描顯微鏡 德國Zeiss公司；QuantStudioTM6Flex實時熒光定量PCR儀 美國Life Technologies公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化培養(yǎng)

將-80 ℃保藏的熒光假單胞菌甘油菌劃線于LB平板，在28 ℃培養(yǎng)過夜24 h后，挑去單菌落接種于LB培養(yǎng)基。在28 ℃、200 r/min過夜活化2 次后，離心收集菌體，采用比濁法用無菌生理鹽水將菌體濃度準備至約108CFU/mL，待用。

1.3.2 浮游菌和生物被膜測定

分別配制含0、0.1、1、10、20 mmol/L CaCl2的LB肉湯，滅菌，按1%將活化備用的PF07菌接種到不同濃度CaCl2的LB肉湯，將接種的肉湯添加至96 孔板，每個濃度加5 個孔，每孔200 μL。28 ℃靜置培養(yǎng)2～4 h后，取培養(yǎng)物進行系列稀釋，挑去合適的稀釋度涂布平板計數(shù)瓊脂，在28 ℃培養(yǎng)48 h計數(shù)，計算浮游菌的生長。同時參考Djordjevic等[14]方法用結晶紫法測定被膜含量，將孔板輕輕倒去上清液，用滅菌的磷酸緩沖液清洗2 次后，干燥，用結晶紫染色15 min，清洗干燥，加入33%冰醋酸靜置5 min，用酶標儀測定590 nm波長處OD值。

1.3.3 細菌的胞外多糖測定

將1.3.2節(jié)中已接種PF07菌的不同濃度CaCl2-LB肉湯，分別添加至6 孔板，每個濃度加3 個孔，每孔9 mL。28 ℃靜置培養(yǎng)12 h和24 h后取出，去菌懸液后，用磷酸緩沖液重懸菌體，用細胞破碎儀在50 kHz超聲5 min后，在80 ℃水浴30 min，4 ℃離心（15 000×g，30 min），用0.22 μm濾膜過濾。采用苯酚-硫酸法[15]測定被膜胞外多糖含量。

1.3.4 細菌薄膜觀察

將1.3.2節(jié)中已接種PF07菌的不同濃度CaCl2-LB肉湯，分別添加至24 孔板，每孔2 mL。菌液在28 ℃靜置培養(yǎng)12、24、36 h和48 h后取出孔板。參考Marsden等[16]用無菌牙簽挑破薄膜，透光進行薄膜的透明度、黏稠性和厚度等定性觀察。

1.3.5 細菌泳動性觀察

參考Sperandio等[17]的方法，配制含0、0.1、1、10、20 mmol/L不同濃度CaCl2的泳動培養(yǎng)基（1%胰蛋白胨、0.5%氯化鈉、0.3%瓊脂），取3 μL過夜培養(yǎng)的PF07菌液接種在平板中心，在28 ℃靜置培養(yǎng)12、24、36 h和48 h，測量泳動圈的直徑。

1.3.6 共聚焦掃描顯微鏡觀察被膜結構

將PF07菌體按1%分別接種到含0、1、20 mmol/L CaCl2的LB肉湯中，在28 ℃靜置培養(yǎng)24 h后取出，倒去菌液。參考SYTO-9染料說明書和Liu Li等[18]方法，將SYTO-9稀釋500 倍后添加至培養(yǎng)皿，于室溫靜置15 min。SYTO-9的激發(fā)和發(fā)射波長大約在480 nm和500 nm，圖像使用Zeiss LSM 710共聚焦掃描顯微鏡，在63×油鏡下采集圖像，使用ZEN 2012軟件處理圖像，生成三維結構。

1.3.7 實時熒光定量PCR檢測

參考1.3.6節(jié)方法培養(yǎng)24 h獲得菌體，分別提取總RNA，用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄cDNA，獲得的cDNA在-20 ℃?zhèn)溆谩晒舛縋CR體系（20 μL）：RNAfree水8 μL，Power SYBR Master Mix 10 μL；上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL；模板cDNA 1.0 μL。反應條件：95 ℃、10 min；40 個循環(huán)（95 ℃、15 s；60 ℃、60 s，收集熒光）；60～95 ℃，熔點曲線分析。每個樣品重復3 次，以16S rRNA基因作為內(nèi)參基因，各個基因的相對表達水平以2Ct內(nèi)參基因-Ct目的基因進行統(tǒng)計分析。引物序列如表1所示。

表1 PF07被膜相關基因引物Table 1 Primer sequences used for PCR amplification of biofilmforming genes in PF07

1.4 數(shù)據(jù)處理

生物被膜結晶紫檢測樣品重復5 次，胞外多糖、運動性、實時熒光定量PCR等樣品檢測每組設3 次重復，采用Microsoft Excel和Origin 8.5進行數(shù)據(jù)處理和作圖，用SPSS17.0的ANOVA進行方差分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 Ca2+對熒光假單胞菌PF07生物被膜形成的影響

圖1 Ca2＋濃度對熒光假單胞菌PF07生物被膜形成的影響Fig. 1 Effect of Ca2+ concentration on biofilm formation of PF07 at 28 ℃

如圖1所示，Ca2+添加能影響PF07生物被膜的形成，其中0.1、1、10 mmol/L Ca2+促進被膜形成，12 h后被膜分別增加25.1%、35.7%和22.6%。隨著Ca2+濃度增加，熒光假單胞菌促進作用呈現(xiàn)先增強后減弱的趨勢，而20 mmol/L Ca2+對整個被膜周期影響微弱。渠宏雁等[9]發(fā)現(xiàn)Ca2+濃度對副溶血性弧菌生物被膜的促進也表現(xiàn)先增加后減弱，其中0.5% Ca2+的促進率最強，與本結果相似。同時隨著培養(yǎng)時間的延長，Ca2+刺激熒光假單胞菌被膜形成逐步減弱，其中1 mmol/L Ca2+在12 h表現(xiàn)最強，之后24 h Ca2+影響逐步降低。該現(xiàn)象與Ca2+與細胞和黏附基質表面帶負電的基團結合引起的架橋作用有關[19]，隨著Ca2+濃度增加可能導致細菌與表面的靜電排斥力高于吸引力，減少細菌的黏附量。

2.2 Ca2+對PF07浮游菌生長的影響

圖2 Ca2＋濃度對熒光假單胞菌PF0生長的影響Fig. 2 Effect of Ca2+ concentration on planktonic cell growth of PF07

如圖2所示，熒光假單胞菌PF07在28 ℃生長較快，18 h逐步進入穩(wěn)定期。PF07培養(yǎng)12 h和24 h的浮游菌數(shù)分別為達到7.75、8.59（lg（CFU/mL）），而Ca2+對PF07浮游菌生長影響較小，0.1 mmol/L低濃度Ca2+作用下PF07浮游菌生長初期有微弱的抑制，20 mmol/L Ca2+對浮游菌對數(shù)生長期略有促進，而培養(yǎng)24 h后0.1～10 mmol/L Ca2+對熒光假單胞菌PF07穩(wěn)定期細菌密度無影響，提示Ca2+對生物被膜的促進作用與浮游細菌生長無關。

2.3 Ca2+對熒光假單胞菌PF07胞外多糖的影響

圖3 Ca2＋濃度對熒光假單胞菌PF07被膜胞外多糖含量的影響Fig. 3 Effect of Ca2+ concentration on exopolysaccharide protein production of PF07

如圖3所示，Ca2+能影響熒光假單胞菌被膜胞外多糖的形成。1 mmol/L和10 mmol/L Ca2+在培養(yǎng)12 h促進PF07胞外多糖分泌，而20 mmol/L則表現(xiàn)抑制。培養(yǎng)24 h后0.1 mmol/L和1 mmol/L Ca2+促進PF07多糖分泌量為23.4%和47.7%，而10 mmol/L和20 mmol/L作用下減少15.5%和38.3%多糖含量。Ca2+對PF07胞外多糖的作用呈現(xiàn)濃度依賴性，低濃度下表現(xiàn)促進，高于10 mmol/L逐步抑制，其中1 mmol/L Ca2+促進效果最強。該作用趨勢可能是由于Ca2+和細菌表面多糖靜電結合，從而改變被膜的黏附特性[20]。同時，金屬離子對被膜聚合物的架橋作用并不穩(wěn)定，高濃度離子環(huán)境中可能降低胞外多糖分泌的現(xiàn)象。唐連鳳等[21]發(fā)現(xiàn)Ca2+促進Shewanella oneidensis MR-1胞外多糖的分泌，2.1 mmol/L Ca2+環(huán)境中促進作用最強，且細菌外表面褶皺及變形程度最大，濃度增加則作用減弱。

2.4 Ca2+對熒光假單胞菌PF07薄膜形成的影響

薄膜是在細菌靜置培養(yǎng)中氣液體交界面處形成的特殊生物被膜，被稱作“流動的生物被膜”。與固液被膜相似，薄膜中菌體更易接觸氧氣，且因缺少支持物表現(xiàn)較脆弱[22]。如圖4所示，熒光假單胞菌PF07培養(yǎng)12 h逐步形成透明稀薄薄膜，劃痕不清晰，添加0.1 mmol/L和1 mmol/L Ca2+的薄膜與對照組無差異，而高濃度Ca2+下薄膜厚度明顯下降，20 mmol/L Ca2+中無成形的薄膜。培養(yǎng)至24 h對照組已形成不透明、致密的薄膜，厚度和黏度明顯增加，劃痕清晰且無褶皺。而0.1 mmol/L和1 mmol/L Ca2+增加薄膜厚度和黏度，并不易劃破，而高濃度Ca2+被膜變薄，易劃破。培養(yǎng)36～48 h后，對照組、0.1 mmol/L和1 mmol/L Ca2+添加組被膜厚度繼續(xù)增加，不易劃破，劃痕表面形成褶皺，而黏度略下降。相似地，高濃度Ca2+下薄膜無增厚，膜孔分離，底部變渾濁。可見，Ca2+顯著影響熒光假單胞菌薄膜的形成，其中0.1～1 mmol/L低濃度促進薄膜形成，增加薄膜厚度和機械強度，而10～20 mmol/L高濃度則抑制薄膜形成、降低厚度和黏稠性，推測可能與Ca2+改變菌體被膜胞外聚合物分泌特性有關[23-24]。

圖4 Ca2＋濃度對熒光假單胞菌PF07薄膜的影響Fig. 4 Effect of Ca2+ concentration on pellicle formation of PF07

2.5 Ca2+對熒光假單胞菌PF07泳動性的影響

細菌運動性與被膜形成關系密切，運動性促進被膜在表面延伸，有助于浮游菌轉變?yōu)楸荒ぞ鶾25]。如圖5所示，隨著培養(yǎng)時間延長熒光假單胞菌PF07泳動性逐步增強，在48 h后細菌泳動圈直徑為73.0 mm。Ca2+能影響熒光假單胞菌的泳動性，其中Ca2+加速菌體的泳動性，而10 mmol/L和20 mmol/L Ca2+抑制泳動。熒光假單胞菌PF07在0.1、1、10 mmol/L和20 mmol/L Ca2+作用下培養(yǎng)48 h后分別增加6.8%和20.5%，及減少24.7%和31.5%。已報道假交替單胞菌在10 mmol/L Ca2+作用下菌體鞭毛的結構蛋白表達降低，鞭毛形成減少[26]?？梢姡蜐舛菴a2+促進PF07泳動性，高濃度則表現(xiàn)抑制，可能與不同Ca2+濃度下菌體鞭毛結構蛋白差異變化相關。

圖5 Ca2＋濃度對熒光假單胞菌PF07運動性的影響Fig. 5 Effect of Ca2+ concentration on swimming motility of PF07

2.6 Ca2+對熒光假單胞菌PF07被膜結構的影響

圖6 Ca2＋濃度對熒光假單胞菌PF07被膜結構的影響Fig. 6 Effect of Ca2+ concentration on biofilm structure of PF07

熒光假單胞菌在穩(wěn)定期后分泌大量胞外聚合物，生物膜厚度增加，是生物被膜生長的成熟期。共聚焦掃描顯微鏡觀察Ca2+環(huán)境下熒光假單胞菌PF07生物被膜結構變化，如圖6所示。熒光假單胞菌經(jīng)24 h培養(yǎng)后0、1、20 mmol/L Ca2+處理組的生物被膜厚度分別為20.0、40.0、25.0 μm。并且，添加1 mmol/L Ca2+不僅顯著增加PF07被膜的厚度，還使被膜變得非常致密，在頂部和底部聚集大量菌體和分泌物。高濃度Ca2+處理被膜厚度略有增厚，然而被膜中熒光強度弱于對照組，被膜菌體分布減少，分泌物量降低。Sarkisova等[27]觀察發(fā)現(xiàn)1 mmol/L和10 mmol/L Ca2+作用下銅綠假單胞菌被膜厚度增加約10 倍，并且出現(xiàn)明顯的細胞凝集現(xiàn)象。

2.7 Ca2+對熒光假單胞菌PF07被膜相關基因表達量的影響

圖7 Ca2＋濃度對熒光假單胞菌PF07被膜相關基因表達量的影響Fig. 7 Effect of Ca2+ concentration on the expression levels of biofilm-related genes in PF07

如圖7所示，PF07培養(yǎng)24 h后，1 mmol/L Ca2+顯著促進黏附素基因lapA、藻多糖基因alg、鞭毛合成蛋白基因flgA、AHLs合成酶基因luxI四種基因相對表達量，分別為對照組的3.3、3.1、2.9 倍和3.9 倍。而20 mmol/L Ca2+對菌體中l(wèi)apA、alg、flgA的相對表達量無影響，卻增加luxI相對表達量，為對照組的1.9 倍。兩種濃度的Ca2+對熒光假單胞菌3 種被膜相關基因lapA、alg、flgA表達量存在差異，基因表達與被膜菌、胞外多糖、運動性表型現(xiàn)象較一致。研究報道，Ca2+調控銅綠假單胞菌[27]、霍亂弧菌[28]、大腸桿菌[29]等眾多細菌被膜形成有關基因的表達，包括胞外多糖分泌、泳動行為、群體感應、鐵離子攝取行為等。菌體內(nèi)Ca2+結合蛋白參與菌體的黏附，且在菌體凝集中起重要作用。同時，Ca2+作為感應分子，調節(jié)被膜相關成分的表達。已發(fā)現(xiàn)Ca2+不僅促進銅綠假單胞菌被膜形成，而且浮游菌和被膜菌的alg基因表達分別提高3 倍和8 倍[27]。相對于1 mmol/L Ca2+環(huán)境，20 mmol/L Ca2+作用下熒光假單胞菌被膜相關基因表達無影響，推測高濃度Ca2+可能解離胞外聚合物結構，進而降低含量。兩種濃度Ca2+均能增加熒光假單胞菌luxI的相對表達量，提示Ca2+影響被膜形成與群體感應的AHLs活性有關。AHLs能與細菌特異性蛋白結合并激活細胞基因的轉錄表達，影響細菌運動性、胞外多糖的分泌影響，調控生物被膜的散播[30]。研究表明，Ca2+對熒光假單胞菌生物被膜黏附、胞外分泌物、薄膜、運動性的影響與群體感應LuxI/LuxR參與的調控內(nèi)在相關，深層調控機制有待于進一步研究。

3 結 論

環(huán)境Ca2+影響水產(chǎn)品腐敗熒光假單胞菌的生物被膜形成特性，不同濃度Ca2+表現(xiàn)差異的作用方式。低濃度Ca2+添加能促進PF07生物被膜形成，隨著濃度增加促進作用減弱，其中1 mmol/L Ca2+顯著促進PF07被膜菌、胞外多糖、薄膜和泳動性。共聚焦掃描顯微鏡證實1 mmol/L Ca2+刺激PF07被膜厚度和細胞凝集，使被膜結構更致密，其與Ca2+刺激lapA、alg和flgA三種被膜相關基因表達量有關。研究發(fā)現(xiàn)Ca2+添加促進菌體群體感應luxI基因的表達，提示Ca2+對熒光假單胞菌被膜的影響與群體感應活性密切相關。因此，應更多關注食品加工環(huán)境中離子成分對腐敗微生物的黏附和被膜形成的影響，有效避免和減少腐敗微生物對食品污染。