趙 婷，吳佳穎，陳黃曌,2，梁 攀，孟江飛，張振文,*

（1.西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院食品與生物工程學院，河南 鄭州 450046）

類黃酮物質是植物酚類次生代謝物，由苯環(huán)上連有一個或多個羥基構成[1]。在葡萄與葡萄酒中類黃酮物質占有舉足輕重的地位，可以抵抗紫外線和病原體對葡萄的損傷，具有抗氧化性，可預防冠心病等[2-3]。類黃酮物質主要包括花色苷、黃酮醇、黃烷-3-醇[4-5]。其中花色苷是主要的呈色物質，以花色素（花青素、甲基花青素、花翠素、甲基花翠素和二甲花翠素）與葡萄糖結合生成的3-O-葡萄糖苷形式存在[4]?；ㄉ盏孽；梢栽黾踊ㄉ盏姆€(wěn)定性，因此?；潭雀叩奶幚碛欣谄咸丫祁伾姆€(wěn)定性。黃酮醇可以通過與花色苷的輔色作用對紅葡萄酒的顏色產(chǎn)生影響[6-7]。黃烷-3-醇是葡萄酒中的苦澀味主要來源，這些物質會對葡萄酒的結構和口感產(chǎn)生很大影響，縮合單寧是黃烷-3-醇二聚體或多聚體聚合物，在口腔中單寧與蛋白質或其他聚合體（如多糖）結合引起收斂性，使人產(chǎn)生苦澀的感覺[8]。葡萄果實中類黃酮物質含量主要受氣候條件[9-11]、品種特性[12-14]、栽培條件[15-18]和成熟度[13,17-19]等因素的影響。

葡萄的成熟度非常重要，它影響著葡萄的組分，決定了品種的特性。在葡萄成熟過程各品質指標發(fā)生相應的變化且不同步[20]。Kennedy等[17]研究表明，可溶性固形物及花色素在轉色期開始積累，而單寧的積累發(fā)生在轉色期前幾周，并且從轉色期開始逐漸下降，直到成熟后期進入穩(wěn)定階段。釀酒葡萄主要以工業(yè)成熟度（即糖成熟）為采收標準[21]，但是除了糖酸，其他主要的成分，如酚類物質與香氣達到適當水平也很重要[19,22]。葡萄是呼吸非躍變型水果，無法在采后進一步成熟，因此在合適的成熟度采收對于釀酒葡萄果實品質與葡萄酒的質量至關重要[19]。釀酒經(jīng)驗表明，用更成熟的葡萄能夠釀制出顏色更穩(wěn)定、紫色色調更高或更強烈的葡萄酒，這與類黃酮物質密切相關。因此，研究果實成熟度與類黃酮物質之間的關系是非常必要的。本實驗通過研究延遲采收對釀酒葡萄梅鹿輒和赤霞珠類中黃酮物質的影響，為確定梅鹿輒和赤霞珠的最佳采收期提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試釀酒葡萄品種梅鹿輒（Vitis vinifera L.cv. Merlot）和赤霞珠（Vitis vinifera L. cv. Cabernet Sauvignon）均于2016年采摘于山西省襄汾縣堯京酒莊（35.7°～36.1°N，111.1°～111.7°E），該地年平均氣溫11.5 ℃，年降雨量550 mm左右，無霜期185 d。梅鹿輒和赤霞珠均定植于2012年，株行距為1 m×3 m，傾斜式獨龍蔓樹形。

根據(jù)果實成熟度監(jiān)控結果，于果實生理成熟期（可溶性固形物和可滴定酸含量趨于平穩(wěn)）采第1次樣品，之后每隔7 d采1 次樣，共采4 次。梅鹿輒分別于9月11日（ML-對照）、9月18日（ML-H1）、9月25日（ML-H2）和10月2日（ML-H3）采樣，赤霞珠分別于9月25日（CS-對照）、10月2日（CS-H1）、10月9日（CS-H2）和10月16日（CS-H3）采樣，試驗地區(qū)9～11月的降水與氣溫如圖1所示。每次隨機選取10 棵植株，每棵植株分別在陰面與陽面隨機采一穗葡萄，共20 穗，每個時期采取3 個重復。樣品裝在泡沫盒后立即運回實驗室，并置于-40 ℃超低溫冰箱備用。

圖1 2016年9—11月的氣溫與降水Fig. 1 Precipitation and temperature during September to November of 2016

乙酸乙酯、葡萄糖、氫氧化鈉、硫酸鈉、硫酸銨、五倍子酸、甲酸、甲醇、乙腈、乙酸（均為分析純）天津市博迪化工有限公司；福林-酚試劑 北京索萊寶科技有限公司；甲基纖維素、（+）-兒茶素、干沒食子酸（均為分析純），二甲花翠素、原花色素B1、槲皮素（均為色譜純） 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

PAL-1數(shù)顯手持式折糖儀 日本ATAGO公司；Mettler ET18型自動點位滴定儀 瑞士Mettler-Toledo公司；PB-10標準型pH計 德國Sartorius公司；FD5系列真空冷凍干燥機 美國Gold Sim公司；AUW220D電子天平、UV-1800型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；KQ-300DE型數(shù)控超聲器 昆山市超聲儀器有限公司；CentriVap離心濃縮儀 美國Labconco公司；5804R型低溫冷凍離心機 德國Eppendorf公司；1100、1200系列LC/MSDTrap-VL液相色譜-離子阱質譜聯(lián)用儀美國Aligent公司。

1.3 方法

1.3.1 果實基本理化指標的測定

可溶性固形物含量：采用數(shù)顯手持式折糖儀法測定；可滴定酸含量：采用NaOH滴定法測定，結果以酒石酸計；還原糖含量：采用斐林試劑滴定法測定，結果以葡萄糖計；pH值：采用pH計測量法。總酚含量采用福林肖卡比色法測定，結果以沒食子酸計（果皮干粉）[23]；單寧含量：采用甲基纖維素法測定，結果以兒茶素計（果皮干粉）[24]；總花色苷含量采用pH示差法測定，結果以二甲花翠素-3-葡萄糖苷計[25]。酚類物質的測定在避光條件下操作。

1.3.2 果實類黃酮物質的提取及測定

樣品前處理：取每處理200 粒保存于-40 ℃的果實樣品，在冷凍狀態(tài)下剝皮經(jīng)液氮速凍后用粉碎機打成末，真空冷凍干燥機-50 ℃條件下真空冷凍24 h以上，使葡萄皮粉充分干燥，之后保存在-80 ℃冰箱備用。

果皮單體花色苷的提取：稱取0.500 g葡萄皮干粉于50 mL離心管，加入10 mL提取劑（甲酸-甲醇（98∶2，V/V）），避光超聲10 min，之后在搖床中150 r/min振蕩提取30 min，取出后8 000 r/min離心5 min，轉上清液于50 mL離心管中，重復提取4 次，合并上清液在離心濃縮儀于30 ℃減壓旋轉蒸發(fā)至干，剩余物質用10 mL流動相（A-B，9∶1，V/V）定容，于-80 ℃冰箱保存待測[26]。其中，流動相A相為水-甲酸-乙腈（92∶2∶6，V/V），流動相B相為水-甲酸-乙腈（44∶2∶54，V/V）。

果皮非花色苷酚類物質的提?。悍Q取1.0 g葡萄皮干粉于離心管中，加入1 mL蒸餾水之后加9 mL乙酸乙酯，在搖床中避光振蕩提取30 min，轉上清液于50 mL離心管中，共提取4 次，合并上清液在離心濃縮儀中于30 ℃蒸干，殘渣用色譜甲醇定容至1 mL，于-80 ℃冰箱保存待測[27]。

類黃酮物質采用高效液相色譜-質譜法測定?；ㄉ瘴镔|的檢測采用1100系列LC/MSD Trap -VL液相色譜-離子阱質譜聯(lián)用儀，二極管陣列檢測器。每個樣品重復進樣2 次?；ㄉ盏亩ㄐ匝芯扛鶕?jù)中國農業(yè)大學葡萄酒中心建立的“葡萄與酒花色苷HPLC-UV-MS指紋譜庫”進行[28]?；ㄉ斩浚阂远谆ù渌?3-O-葡萄糖苷為外標物建立5～500 mg/L之間、9 個梯度、3 個重復的標準曲線，決定系數(shù)在0.999以上，以其他花色苷相當于二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的含量計。果皮中花色含量單位為mg/kg（果皮干質量）表示。非花色苷酚類物質的檢測采用1200系列LC/MSD Trap-VL高效液相色譜-離子阱質譜聯(lián)用儀，可變波長檢測器。每個樣品重復進2 次[27]。非花色苷酚類物質的定性與定量參考Liang Nana等[28]的方法進行，果皮中非花色苷含量單位用mg/kg（果皮干質量）表示。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2010統(tǒng)計，SPSS 20.0（IBM,Armonk, NY, USA）進行方差分析（analysis of variance，ANOVA），采用Tukey’s HSD法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 延遲采收對釀酒葡萄果實基本理化指標的影響

表1 延遲采收對梅鹿輒果實基本理化指標的影響Table 1 Effects of delayed harvest on general composition of Merlot

不同采收期的梅鹿輒和赤霞珠果實基本理化指標見表1、2。隨著采收期的延遲，梅鹿輒和赤霞珠的果粒質量和縱徑均顯著減小；可溶性固形物和還原糖含量均增加，可滴定酸的含量持續(xù)下降，H3與對照差異顯著。H2和H3時期梅鹿輒總花色苷含量降低，而赤霞珠總花色苷含量隨著延遲采收增加。梅鹿輒和赤霞珠單寧的變化情況一致，H2時期的單寧含量均為4 個時期中最低?？偡雍砍氏仍龊蠼档内厔荩仿馆m和赤霞珠總酚含量分別于H2和H1時期達到最高。

表2 延遲采收對赤霞珠果實基本理化指標的影響Table 2 Effects of delayed harvest on general composition of Cabernet Sauvignon

2.2 延遲采收對果皮類黃酮物質的影響

2.2.1 延遲采收對果皮花色苷組分的影響

表3 延遲采收對梅鹿輒果實花色苷的影響Table 3 Effects of delayed harvest on anthocyanin contents of Merlot mg/kg

釀酒葡萄的花色苷組分HPLC檢測結果見表3、4，延遲采收對葡萄果皮花色苷物質的種類和含量有顯著影響。梅鹿輒葡萄果皮花色苷組分的種類隨著采收期的推遲而減少，分別檢測出19、18、17和15 種花色苷物質。延遲采收的樣品中均未檢測到順式-二甲花翠素-3-O-(6-O-香豆酰)-葡萄糖苷；H3時期花翠素-3-O-(6-O-香豆酰)-葡萄糖苷、反式-甲基花翠素-3-O-(6-O-香豆酰)-葡萄糖苷和甲基花青素-3-O-(6-O-咖啡酰)-葡萄糖苷均未能檢測出。延遲采收后梅鹿輒花色苷組分含量減少，含量對照（16 267.16 mg/kg）＞H2（15 320.81 mg/kg）＞H1（14 878.61 mg/kg）＞H3（9 653.80 mg/kg）。赤霞珠果皮花色苷組分種類隨著采收期的推遲呈增加趨勢，分別檢測出14、14、15、15 種花色苷。H2和H3時期均檢測到反式-甲基花翠素-3-O-(6-O-香豆酰)-葡萄糖苷。赤霞珠花色苷組分含量隨著采收期的延遲而增加，赤霞珠含量H2（13 237.13 mg/kg）＞H3（13 234.30 mg/kg）＞H1（11 322.20 mg/kg）＞對照（10 823.77 mg/kg）。

表4 延遲采收對赤霞珠果實花色苷的影響Table 4 Effects of delayed harvest on anthocyanin contents of Cabernet Sauvignon mg/kg

隨著采收期的延遲，梅鹿輒葡萄果皮中花翠素類和二甲花翠素類花色苷含量越來越少，赤霞珠果皮中含量越來越多。由于花色苷β環(huán)上的羥基數(shù)目越多，其藍色色調越深；甲基化數(shù)目越多，紅色越深。因此，隨著采收期的延遲，梅鹿輒葡萄果皮顏色越來越淺，赤霞珠果皮顏色越來越深。在赤霞珠和梅鹿輒葡萄果皮花色苷中，含量最多的為非酰化花色苷，占花色苷總含量的60%左右；其次為乙酰化花色苷，占總含量的21%～32%，香豆酰化花色苷占總含量的7%～16%；只有微量咖啡酰化花色苷。非?；幕净ㄉ帐撬谢ㄉ罩泻孔罡叩慕M分，延遲采收后，梅鹿輒非?；ㄉ蘸肯陆担嘞贾榉酋；ㄉ蘸侩S著采收期的延遲呈上升趨勢，在H3時期達到最大值8 296.59 mg/kg。?；ㄉ赵诳偦ㄉ蘸恐斜壤脑黾佑欣谔岣呋ㄉ盏姆€(wěn)定性。梅鹿輒延遲采收后，?；ㄉ蘸肯陆?。而赤霞珠乙?；ㄉ蘸侩S采收期的延遲呈先增后減的趨勢，其含量H2＞H3＞H1＞對照；H2與H3時期赤霞珠香豆?；ㄉ蘸匡@著增加，H1時期咖啡?；ㄉ蘸枯^高。

從上述分析中可以看出，對于成熟期較早品種梅鹿輒，果實花色苷穩(wěn)定性隨著采收期的延遲降低；而對于晚熟品種赤霞珠，果實花色苷穩(wěn)定性隨著采收期的延遲提高。

2.2.2 延遲采收對果皮非花色苷酚類物質的影響

從表5、6可以看出，延遲采收對葡萄果皮非花色苷酚類物質的種類和含量有一定的影響。不同采收期的梅鹿輒葡萄共檢測出21 種非花色苷酚類物質，而赤霞珠葡萄中只檢測出19 種。檢測出的非花色苷酚類物質主要包括黃烷醇類和黃酮醇類，不同采收期的非花色苷酚類物質總量差異顯著。

黃烷醇類：延遲采收各時期梅鹿輒葡萄果皮中均檢測出6 種黃烷醇，分別為原花色素B1、原花色素B2、原花色素C1、兒茶素、沒食子酸兒茶素和表沒食子酸兒茶素。其中，原花色素B1含量最高，占總黃烷醇含量的80%左右。延遲采收不同時期梅鹿輒果皮中黃烷醇含量H1（69.29 mg/kg）＞CK（41.00 mg/kg）＞ H3（51.22 mg/kg）＞H2（35.33 mg/kg）。不同采收期的赤霞珠葡萄果皮中，只檢測到4 種黃烷醇，其中未檢測到原花色素B2和原花色素C1，含量最高黃烷醇類物質為原花色素B1，占總黃烷醇含量的65%左右。2 個品種的黃烷醇含量占非花色苷酚類物質總量比例均較低，其中梅鹿輒為5%～9%，赤霞珠僅為2.6%～4%。

黃酮醇類：延遲采收不同時期梅鹿輒和赤霞珠葡萄果皮中均檢測到15 種黃酮醇，且2 個品種葡萄果皮中黃酮醇含量占非花色苷酚類物質總量的比例很高，達91%以上。不同采收時期黃酮醇含量差異顯著，梅鹿輒葡萄果皮黃酮醇含量為H1（732.49 mg/kg）＞對照（720.48 mg/kg）＞H3（688.23 mg/kg）＞H2（668.08 mg/kg)。赤霞珠果皮黃酮醇含量隨著采收期的延遲呈增長的趨勢，其含量為H3（629.83 mg/kg）＞H2（390.13 mg/kg）＞對照（349.12 mg/kg）＞H1（338.28 mg/kg）。在赤霞珠和梅鹿輒葡萄果皮中，槲皮素類為含量在最高的黃酮醇物質，占黃酮醇總量的49%以上。

表5 延遲采收對梅鹿輒果實非花色苷酚類物質的影響Table 5 Effects of delayed harvest on contents of non-anthocyanins phenolic compounds in Merlot mg/kg

表6 延遲采收對赤霞珠果實非花色苷酚類物質的影響Table 6 Effects of delayed harvest on contents of non-anthocyanins phenolic compounds in Cabernet Sauvignon mg/kg

2.3 主成分分析

對不同采收期的葡萄果實基本理化指標與類黃酮物質進行主成分分析（principal component analysis，PCA），結果見圖2。可以看出梅鹿輒PC1解釋了總變量的46.86%，PC2解釋了總變量的23.97%；赤霞珠PC1解釋了總變量的62.10%，PC2解釋了總變量的22.35%。

梅鹿輒基本理化指標與酚類物質的主成分結果見圖2A、B，可以看出花色苷與黃酮醇類物質主要集中在PC1正端，黃烷醇類物質主要集中在PC2正端。在得分圖中，CK位于PC1正端，CK與H3在PC1上差異較大，與H1在PC1上差異較小，PC2能將H2與其他時期很好的區(qū)分開。說明隨著采收期的延遲，與正常成熟期相比在與PC1相關的花色苷和黃酮醇類物質間差異越大。

對照赤霞珠載荷圖（圖2C），可以看出在赤霞珠中PC1主要與除二甲花翠素-3-O-(6-O-咖啡酰)-葡萄糖苷、花青素-3-O-(6-O-乙酰)-葡萄糖苷和楊梅酮之外的其他單體酚類物質呈良好的正相關。在得分圖中可以看出（圖2 CS-b），PC1能將CK與H3很好的區(qū)分開，H2與其他時期在PC2上差異較大，說明CK與H3在與PC1相關的物質上差異較大，隨著采收期的延遲，與正常采收期果實花色苷的差異越大。

此外，從載荷圖中可以看出不同物質間的相互關系，圖中距離較近的物質間有較強的正相關關系，而距離較遠的物質間則呈較強的負相關。圖中可溶性固形物與可滴定酸分別位于PC1兩端，可以看出可溶性固形物與可滴定酸呈較強的負相關關系。

圖2 不同采收期與果實品質相關物質的PCAFig. 2 PCA of substances related to grape quality at different harvest stages

3 結論與討論

國內外研究結果表明，葡萄果實延遲采收后的外觀特性和生理指標變化顯著。例如，葡萄果實失水皺縮，質量減少、有機酸含量明顯下降和含糖量增加[29-31]，造成這些變化的原因可能與蒸騰作用和韌皮部的變化有關[32-33]。本實驗結果表明，隨著采收期的延遲，葡萄果實的粒質量、粒徑均降低，葡萄果實中的可滴定酸含量顯著降低、還原糖含量顯著提升，這些結果與前人研究一致。

本研究中，釀酒葡萄延遲采收后，由于品種差異性和氣候條件等因素，類黃酮物質的變化趨勢與他人的研究結果略有不同。梅鹿輒延遲采收后花色苷含量變化呈下降趨勢，與王宇等[34]研究結果相反，結合氣象數(shù)據(jù)分析，可能與周期內降雨量較大有關；赤霞珠延遲采收后花色苷含量變化呈上升趨勢，與溫鵬飛等[35]研究結果一致。延遲采收后，梅鹿輒酰化花色苷含量持續(xù)降低，赤霞珠?；ㄉ蘸吭谘舆t1～2周時，呈上升趨勢，而在3 周后呈下降趨勢。梅鹿輒延遲1 周黃烷醇與黃酮醇增加，2～3 周后均降低；赤霞珠延遲采收后黃烷醇含量持續(xù)增加，而黃酮醇含量先降低后增加。研究結果表明，采收期氣溫變化對類黃酮物質含量的影響較大，葡萄果實成熟階段的低溫環(huán)境會增加花色苷的積累，而高溫會降低葡萄表皮中類黃酮物質合成相關基因的表達，增加花色苷的降解[36-39]。結合PCA，延遲采收可以提高赤霞珠類黃酮物質含量，而對于梅鹿輒，延遲采收不利于類黃酮物質的積累。