胡濤 金郁 汪學(xué)龍 李群

水皰性口炎病毒(VesicularStomatitisVirus, VSV)可引起人畜共患疾病，是豬、牛、馬等口腔黏膜、皮膚、乳頭及蹄冠部皮膚出現(xiàn)水泡及糜爛為特征的一種病毒性疾病[1]，人類也可以偶爾感染VSV，引起類似急性流感樣的癥狀。一周后康復(fù)并產(chǎn)生中和抗體，是影響人類的衛(wèi)生健康病毒之一[2]。近年來，該病在我國也有自然發(fā)生的報(bào)道[3]。目前，常見VSV檢測方法主要有病毒分離培養(yǎng)鑒定、血清中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試驗(yàn)等方法[4]。本研究采用純化的抗原制備兔抗VSV多克隆抗體，通過血清中和試驗(yàn)、間接ELISA等試驗(yàn)方法檢測其抗體效價(jià)的結(jié)果分析，可作為VSV的血清學(xué)檢測提供依據(jù)和流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)分析。

材料與方法

一、病毒株與細(xì)胞株

水泡性口炎病毒(VSV)毒株、Vero細(xì)胞株均由安徽醫(yī)科大學(xué)微生物教研室提供。

二、動(dòng)物

大耳白兔由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SYXK(皖)2017-006]。

三、儀器設(shè)備

倒置生物顯微鏡(OLMPCUS-CKX41，日本產(chǎn))、酶標(biāo)儀(Biotek-EL808，美國產(chǎn))、CO2孵箱(日本產(chǎn))。

四、主要試劑

HRP標(biāo)記羊抗兔IgM為北京中杉金橋生物技木有限公司產(chǎn)品，完全佐劑和不完全佐劑由安徽蕪湖天明生物技術(shù)有限公司提供，包被液、抗體稀釋液、封閉液、顯色液、底物液、終止液均由安徽醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室自制。

五、VSV病毒的純化

將VSV接種于Vero單層細(xì)胞，細(xì)胞病變(CPE)達(dá)80%以上時(shí)收獲病毒，凍融3次后，3 000 r/min離心 30min，除去細(xì)胞碎片；再經(jīng)5 000 r/min 離心30 min，取上清以30 000 r/min 4℃離心3 h，棄上清，將沉淀用少量PBS充分懸浮，獲得純化病毒,測定其濃度及毒力并分裝保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

六、兔抗VSV多克隆抗體的制備

實(shí)驗(yàn)用體重為2～3 kg雄性清潔級(jí)大耳白兔，無感染疾患共6只，分籠飼養(yǎng)，標(biāo)明記號(hào)(a、b、c、d、e、f)，免疫前健康觀察1周，耳靜脈采血，分離血清，作為陰性對照。免疫將純化的病毒稀釋至1.5 mg/mL后與等量的弗氏完全佐劑乳化，背部皮下多點(diǎn)注射清潔級(jí)大耳白兔，每只注射2 mL；1周后用VSV加弗氏不完全佐劑皮下多點(diǎn)注射加強(qiáng)免疫1次，劑量與初次免疫相同，后三次免疫兔耳靜脈注射1 mL，免疫共35 d，兔心臟抽血離心分離血清。進(jìn)行雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、間接ELISA方法、中和試驗(yàn)檢測其抗體效價(jià)。

七、 兔抗VSV多克隆抗體的檢測方法

1. 雙向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)：用滅菌生理鹽水配制成1%瓊脂融化后，傾注于每張清潔載玻片上5 mL。正六角形打孔，孔距3～5 mm，孔徑3 mm。將瓊脂板標(biāo)明記號(hào)，分別稀釋待測血清原液、1 ∶ 2、1 ∶ 4、1 ∶ 8、1 ∶ 16、1 ∶ 32。加樣：中央加1 ∶ 2的VSV抗原。其它6孔注入上述不同稀釋度VSV免疫血清。將瓊脂板平置于盒內(nèi)，于室溫24h觀察結(jié)果。

2. 間接ELISA法：將上述VSV抗原上清液按文獻(xiàn)純化抗原，加96孔酶標(biāo)板中作方陣滴定[5]，獲合適濃度，用PH 9.6碳酸緩沖液包被抗原，設(shè)正?？乖?，每孔75 μL，4℃過夜，10%小牛血清封板1 h后，洗滌甩干備用。待測免疫血清(a、b、c、d、e、f)分別按1 ∶ 10不同濃度倍比稀釋、每孔75 μL，放置37℃ 1 h，洗滌3次后，二抗為HRP標(biāo)記羊抗兔IgM，用封板液稀釋1 ∶ 5000，每孔75 μL，37℃ 1 h后洗滌3次，顯色：TMB A液及B液每孔各25 μL，與正常抗原孔比較，正?？乖撞伙@色，其他顯藍(lán)色為陽性。以未免疫兔血清做陰性對照，以待測血清OD值/陰性對照OD值(P/N)2.1作為陽性標(biāo)準(zhǔn)，以出現(xiàn)陽性反應(yīng)最高稀釋度作為該血清的抗體效價(jià)(滴度)。

3. 中和試驗(yàn)測定效價(jià)：預(yù)先將被檢血清(a、b、c、d、e、f)58℃30 min滅活。在平底微量細(xì)胞培養(yǎng)板中從1 ∶ 4開始，每份血清用兩排孔，第一孔加入100 μL，稀釋至第9孔吸出100 μL棄去。第10孔細(xì)胞對照，第11孔病毒對照，均不加血清。用反復(fù)凍融3次后收集培養(yǎng)液VSV病毒懸液，按Reed—Muench法測定該TCID50[6]，每孔100 μL加入，血清S對照及C細(xì)胞對照(即第1、10孔)不加病毒，V病毒對照加100 TCID50100 μL。每孔總量200 μL，C對照及S對照補(bǔ)充稀釋液100 μL/孔。37℃1 h，分別將1×106/mL Vero細(xì)胞懸液100 μL加入每孔，置于5%二氧化碳環(huán)境中，37℃培養(yǎng)48 h觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。

4. 三種試驗(yàn)方法的結(jié)果分析比較：將6份VSV免疫血清的雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和間接ELISA效價(jià)與中和試驗(yàn)效價(jià)結(jié)果相比較，探索其相關(guān)性。

結(jié) 果

一、VSV病毒的純化

將細(xì)胞培養(yǎng)的VSV用差速離心及超速離心純化后，紫外分光光度計(jì)測其蛋白濃度為3.08 mg/mL。VSV接種Vero細(xì)胞的感染滴度為10～5/0.1mL。

二、VSV抗原免疫接種后兔臨床癥狀

觀察兔發(fā)病出現(xiàn)消瘦、腹瀉、食欲減退或不食。局部的皮膚發(fā)生炎癥和脫毛、唇、口腔黏膜等處出現(xiàn)水皰，水皰破潰，形成爛斑等癥狀。

三、兔抗VSV多克隆抗體的雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)

觀察中間孔為VSV抗原，周圍孔為不同稀釋的免疫血清抗體，以出現(xiàn)沉淀線的最高稀釋為抗體效價(jià)，出現(xiàn)沉淀帶完全融合證明同種抗原，二者有部分相連表明二者有共同抗原決定簇，二條沉淀線相互交叉說明二者抗原完全不同。結(jié)果見圖1(a、b)，免疫血清檢測抗體效價(jià)結(jié)果分別為a 1 ∶ 16、b 1 ∶ 16、c 1 ∶ 8、d 1 ∶ 16、e 1 ∶ 16、f 1 ∶ 32。

圖1 a, b兔抗VSV多克隆抗體的雙向瓊脂擴(kuò)散結(jié)果圖

四、兔抗VSV多克隆抗體的ELISA法

抗原和血清工作濃度，確定兔抗VSV作方陣滴定的抗原最佳包被濃度為1 ∶ 800(5.16wg/mL)；酶標(biāo)二抗的最佳稀釋度為1 ∶ 5 000，在37℃ 1 h后4℃包被過夜、血清最佳工作濃度為1 ∶ 40時(shí)效果最好。檢測結(jié)果顯示，VSV的純化病毒與6組VSV免疫血清發(fā)生特異性反應(yīng)，與其他陰性血清不存在特異性反應(yīng)。

五、兔抗VSV多克隆抗體的中和試驗(yàn)測定效價(jià)

用倒置生物顯微鏡觀察結(jié)果，以病變CPE作為指標(biāo)，首先觀察細(xì)胞對照(-)，病毒對照(++++)、血清對照(-/+-)，見圖2。a，b組VSV免疫血清中和試驗(yàn)測定效價(jià)結(jié)果見圖3。能抑制病毒CPE的血清最高稀釋度為中和抗體效價(jià)(滴度)見表1。

A. 細(xì)胞對照 B. VSV滴度 C. 血清對照 D. 病毒對照

C. 細(xì)胞對照 A. 病毒對照 S. 血清對照 1-9VSV滴度

六、兔抗VSV多克隆抗體試驗(yàn)方法結(jié)果的分析

6份VSV免疫血清，三種方法測血清效價(jià)及分析中和試驗(yàn)結(jié)果比較顯示，雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)出現(xiàn)沉淀帶完全融合證明同種VSV抗原；中和試驗(yàn)結(jié)果顯示病毒回歸成立，正常對照細(xì)胞生長良好。VSV免疫血清間接ELISA和中和試驗(yàn)，檢測血清的陰性對照、陽性對照相同。

表1 VSV-雙向瓊脂擴(kuò)散和ELISA及中和抗體試驗(yàn)的結(jié)果比較

討 論

VSV的天然宿主為豬、馬、牛等家畜，可引起嚴(yán)重水泡性病變甚至死亡[7]。本實(shí)驗(yàn)采用純化的全病毒免疫，實(shí)驗(yàn)證明兔可被VSV感染并出現(xiàn)臨床癥狀，可用來分析VSV致病性與實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間的關(guān)系。純化的全病毒抗原免疫動(dòng)物，可獲得抗病毒所有結(jié)構(gòu)蛋白的特異性抗體，而抗體的效價(jià)和純度是影響ELISA敏感性的因素[8]，因此，在實(shí)驗(yàn)中用純化的全病毒，以獲得抗VSV結(jié)構(gòu)蛋白的特異性抗體，并進(jìn)行了雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和間接ELISA與中和抗體之間的試驗(yàn)，結(jié)果表明：雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)出現(xiàn)沉淀帶完全融合，證明是同種VSV抗原。中和試驗(yàn)正常對照細(xì)胞生長良好，VSV回歸成立。間接ELISA以最大可能降低非特異性反應(yīng)，從而提高敏感性，結(jié)果背景值低。通過間接ELISA和中和試驗(yàn)方法結(jié)果觀察分析比較，兩者檢測血清陰性對照和陽性對照結(jié)果一致，中和試驗(yàn)特異性好、敏感性更高，中和試驗(yàn)為檢測VSV感染的診斷基本方法。建立研究兔抗VSV多克隆抗體試驗(yàn)方法和結(jié)果，可作為VSV血清學(xué)的檢測提供依據(jù)和流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)保障。