張麗萍，林雪萍，宋輝，雷萍，朱巧英

610045成都，四川省婦幼保健院 檢驗科

子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma，EC)是女性生殖系統(tǒng)3大惡性腫瘤之一，發(fā)病率居世界女性惡性腫瘤的第6位[1]。近年來，我國女性EC發(fā)病率呈逐年上升趨勢[2- 3]。早期EC主要以手術(shù)治療為主，預(yù)后良好，5年生存率可達74%～91%[4]。而對于轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)性患者，化療、放療等治療方法療效有限，5年生存率僅20%～26%[4]，迫切需要探索新的有效的治療方法。2013年，Science雜志將腫瘤免疫治療列為重要的科學(xué)突破，提示免疫療法將在癌癥治療領(lǐng)域發(fā)揮里程碑式的作用[5]。其中，免疫檢查點抑制劑(抗PD-1/PD-L1)已經(jīng)用于治療多種實體腫瘤，且療效顯著。然而，目前免疫檢查點抑制劑療法應(yīng)用于EC仍處于試驗階段。

免疫檢查點分子異常表達是腫瘤免疫逃逸的機制之一。由癌細胞、DC細胞、巨噬細胞或骨髓來源的抑制細胞表達的抑制性配體，與T細胞表面受體分子結(jié)合后激活負性通路，抑制T細胞增殖或抗腫瘤活性[6]。目前已發(fā)現(xiàn)多條免疫檢查點通路與腫瘤免疫逃逸相關(guān)，如PD-1/PD-L1,CTLA-4/CD80，TIM-3/Gal-9和LAG-3/FGL1[7- 9]。在EC中，免疫檢查點的研究目前主要集中在PD-1/PD-L1通路。2013年，美國癌癥基因組圖譜( The Cancer Genome Atlas, TCGA )項目將373例EC分為4種分子亞型：POLE突變型(7%)；微衛(wèi)星不穩(wěn)定型(microsatellite instability，MSI)(28%)；拷貝數(shù)低型(39%)和拷貝數(shù)高型 (26%)[10]。之后，Stelloo等[11]通過免疫組化、一代測序等技術(shù)將EC分為POLE突變型，MSI型，無特異性分子變異(no specific molecular profile, NSMP)和TP53突變型，分別對應(yīng)于上述TCGA的四種分子亞型。研究發(fā)現(xiàn)，POLE突變型和MSI亞型的腫瘤突變負荷(tumor mutation burden, TMB)明顯升高[10]，而高TMB的腫瘤更容易從PD-1/PD-L1抑制劑中治療獲益[12- 13]。此外，POLE突變的EC組織中浸潤T細胞、CD8+ T細胞以及PD-1表達顯著升高[14]。近期的幾個案例報道也顯示，PD- 1單抗治療POLE突變型EC療效顯著[15- 16]。這些結(jié)果提示POLE突變與MSI亞型的EC可能更適合PD-1/PD-L1阻斷治療[17- 18]。然而，其他各種免疫檢查點分子在EC組織中的表達及意義目前并不清楚，限制了其他免疫療法的應(yīng)用及患者篩選。

本研究采用TCGA數(shù)據(jù)庫中最新的EC病例及其基因數(shù)據(jù)(n=521)，驗證了4種分子亞型與患者臨床特征以及腫瘤免疫表型的關(guān)系。同時分析了多種免疫檢查點分子在EC中的表達情況，及其與腫瘤微環(huán)境、患者預(yù)后的關(guān)系。這些結(jié)果揭示了不同EC亞型中各種免疫抑制分子的表達特征，為免疫治療在EC中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 TCGA數(shù)據(jù)庫中EC病例信息

截止2018年11月，TCGA數(shù)據(jù)庫共收集EC患者560例。下載患者臨床信息、腫瘤組織全外顯子測序數(shù)據(jù)(maf文件)、RNA-seq數(shù)據(jù)(counts文件)。經(jīng)整理，三類數(shù)據(jù)齊備的病例數(shù)為521例，可用于后續(xù)分析。

1.2 生物信息學(xué)分析

根據(jù)TCGA下載的全外顯子測序結(jié)果(maf文件)，采用MSIseq軟件[19]對腫瘤的MSI狀態(tài)進行預(yù)測。POLE、TP53基因的突變信息直接從maf文件中提取。對于POLE基因，選取其核酸外切酶結(jié)構(gòu)域的突變，這些突變導(dǎo)致DNA聚合酶ξ失去錯配修復(fù)功能，從而廣泛引起基因突變[17]。按照Stelloo提出的基因分型規(guī)則，將EC組織分為POLE突變型、MSI型、NSMP型以及TP53突變型[11]。

對于RNA-seq的原始reads數(shù)據(jù)，采用TPM(transcripts per million)的方法進行標準化處理[20]。各種免疫細胞、腫瘤間質(zhì)細胞在腫瘤組織中的豐度由這些細胞的基因標志物進行計算?；驑酥疚锊捎肞rat等[21]整理的不同免疫細胞、間質(zhì)細胞的標志基因。具體某種細胞豐度的計算采用文獻報道的方法[22]，即以該細胞所有標志基因的平均表達值作為細胞豐度指標。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

四種EC分子亞型與病例組織學(xué)類型、分期、分級、年齡的相關(guān)性采用卡方檢驗或Fisher精確法檢驗。各種免疫細胞成分、免疫檢查點分子在不同分子亞型、不同組織學(xué)類型中的表達差異采用t檢驗或秩和檢驗。TMB在不同患者組別中的差異分析采用秩和檢驗。采用Kaplan-Meier曲線比較患者總生存期(overall survival, OS)和無復(fù)發(fā)生存期(relapse-free survival, RFS)，log-rank檢驗計算統(tǒng)計學(xué)顯著性。對于不同的免疫檢查點基因，通過基因表達值的中位值將患者分為高、低表達兩組。FGL1基因表達值與各種細胞成分的相關(guān)性分析采用Pearson方法。所有統(tǒng)計計算采用R軟件(版本3.5.1)進行，雙側(cè)P<0.05作為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 基于全外顯子測序和RNA測序數(shù)據(jù)對EC進行分子分型

521例EC患者的中位年齡64歲(區(qū)間31 ～ 90歲)。按照病理類型，子宮內(nèi)膜樣腺癌389例(74.7%)，漿液性腺癌110例(21.1%)，混合型癌22例(4.2%)。病理學(xué)分級為G1、G2、G3的患者分別為96例(18.4%)、115例(22.1%)、310例(59.5%)。按照Stelloo的分型規(guī)則[11]，全部患者被分為POLE突變型(41例)、MSI型(154例)、NSMP型(171例)和TP53突變型(155例)。四種分子亞型與組織病理學(xué)類型、腫瘤分期、腫瘤分級、患者年齡均具有顯著關(guān)聯(lián)(圖1A)。其中TP53突變型主要與漿液性癌、腫瘤高分級、患者高年齡相關(guān)。與TP53突變型/NSMP型相比，POLE突變型和MSI型EC中總白細胞(CD45)、T淋巴細胞及CD8+T細胞成分顯著升高(P<0.001，圖1B)。然而，這些細胞在POLE突變型和MSI型之間并沒有顯著差異。生存分析表明，四種分子亞型中，POLE突變型預(yù)后較好，TP53突變型預(yù)后最差(OS和RFS均為P<0.001，圖1C)。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫中EC的分子分型

Figure 1. Molecular Subtypes of EC from TCGA

A.Correlationbetweenfourmolecularsubtypesandclinicalandpathologicalparameters.PvaluewascalculatedbyChi-squaretestorFisherexacttest.B.Analysisofinfiltratinglymphocyteabundanceinfourmolecularsubtypes.Pvaluewascalculatedbyt-test.C.Kaplan-MeiermethodwasusedtoplotOSandRFSoffourmolecularsubtypes.Pvaluewascalculatedbylog-ranktest.

2.2 免疫檢查點分子在4種EC分子亞型中的表達情況

PD-1及其配體分子PD-L1和PD-L2在POLE/MSI亞型中表達顯著高于TP53/NSMP亞型(P<0.01，圖2)。PD-1/PD-L1/PD-L2表達在POLE與MSI兩種亞型之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。類似地，CTLA-4(P<0.001)及配體CD80的表達(P=0.006)在POLE/MSI兩種亞型中的表達高于另外兩種亞型。不過，CTLA- 4的另一個配體CD86(P=0.062)在四種亞型中無明顯變化。雖然TIM- 3在POLE/MSI亞型中表達高于NSMP/TP53亞型(P=0.006)，但其配體Gal- 9在四種亞型中的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.096)。POLE/MSI亞型中LAG- 3表達較NSMP/TP53亞型升高，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。作為LAG- 3的配體，F(xiàn)GL1分子則主要在MSI及NSMP兩種亞型中高表達(圖2)。

圖2 四種分子亞型中不同免疫檢查點分子的表達分析

Figure 2. Expression of Diverse Immune Checkpoint Molecules in Four Molecular Subtypes of EC

Expressionofreceptors/ligands(PD-1/PD-L1/PD-L2,CTLA-4/CD80/CD86,TIM-3/Gal-9,LAG-3/FGL1)infourmolecularsubtypeswasanalyzed,anddifferenceingeneexpressionamonggroupswascomparedbyt-test.

2.3 免疫檢查點分子與EC患者預(yù)后的關(guān)系

在各種免疫檢查點受體分子中，CTLA-4和PD-1高表達的患者OS顯著延長(P<0.05，圖3A)。TIM-3和LAG-3高表達組OS也有延長趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在相應(yīng)配體分子中，CD80、PD-L1、Gal-9表達均與OS無顯著相關(guān)。但是，F(xiàn)GL1高表達組的OS較低表達組更好，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.007，圖3A)。多數(shù)免疫檢查點分子(包括CTLA-4/CD80、PD-1/PD-L1、TIM-3/Gal-9和LAG-3)與RFS并無顯著相關(guān)(P>0.05，圖3B)。然而，F(xiàn)GL1高表達與RFS延長顯著相關(guān)(P<0.001，圖3B)。

2.4 LAG- 3/FGL1通路是EC潛在的免疫治療靶點

進一步分析LAG-3/FGL1基因表達與病理類型的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)LAG-3在子宮內(nèi)膜樣癌(endometrioid)、混合型癌(mixed)、漿液性癌(serous)中的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖4A)。FGL1在子宮內(nèi)膜樣癌中的表達顯著高于另外兩種病理學(xué)類型(P<0.001，圖4A)。生存分析表明，在子宮內(nèi)膜樣癌中，F(xiàn)GL1高表達與RFS延長顯著相關(guān)(P=0.012，圖4B)。FGL1高表達組與低表達組相比OS有延長趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.140，圖4B)。在漿液性/混合型癌中，F(xiàn)GL1表達與OS或RFS的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖4B)。

圖3 各種免疫檢查點分子與EC患者預(yù)后的相關(guān)性分析。根據(jù)每個基因的表達值，按中位值作為閾值將患者分為高(High)、低(Low)表達兩組。采用Kaplan- Meier法繪制兩組患者的生存曲線，用log- rank檢驗計算統(tǒng)計顯著性。

Figure 3. Correlation between Expression of Immune Checkpoint Molecules and Prognosis of EC Patients

Accordingtotheexpressionvalueofeachgene,patientsweredividedintohigh-andlow-expressiongroupsusingmedianasthethreshold.Kaplan-Meiercurvesoftwogroupswerecomparedbylog-ranktest.(A)AnalysisforOS.(B)AnalysisforRFS.

通過分析LAG-3/FGL1表達與腫瘤微環(huán)境中浸潤淋巴細胞的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)LAG-3與CD8+T淋巴細胞成分顯著相關(guān)(r>0.75，圖4C)，而FGL1與CD8+T淋巴細胞無明顯相關(guān)性(r<0.1，圖4C)。同樣，F(xiàn)GL1與Treg細胞、巨噬細胞等免疫負調(diào)控細胞也無明顯相關(guān)性(r<0.1，圖4C)。我們推測FGL1主要表達于癌細胞，因此比較了癌組織與23例正常對照組織中FGL1的表達。與正常組織相比，子宮內(nèi)膜樣癌組織中FGL1表達顯著升高(P<0.001，圖4D)。而漿液性/混合型癌組織與正常組織相比，F(xiàn)GL1表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.300，圖4D)。此外，F(xiàn)GL1高表達的腫瘤組織中，腫瘤突變負荷顯著升高(P=0.020，圖4E)。

圖4LAG-3/FGL1免疫檢查點通路分析

Figure4.Analysis ofLAG-3/FGL1Immune Checkpoint Pathway

A.ExpressionofLAG-3andFGL1inendometrioid,mixedandserouscarcinomas.Comparisonbetweengroupswasconductedbyt-test;ns=notsignificant;***=P<0.001.B.SubgroupanalysisofrelationshipbetweenFGL1andprognosis.CorrelationbetweenFGL1expressionandOSinendometrioidcarcinoma,thatbetweenFGL1expressionandRFSinendometrioidcarcinoma,thatbetweenFGL1expressionandOSinserous/mixedcarcinoma,andthatbetweenFGL1expressionandRFSinserous/mixedcarcinomawereanalyzed,respectively.Pvaluewascalculatedbylog-ranktest.C.Pearsoncorrelation(riscorrelationcoefficient)betweenLAG-3/FGL1andtheinfiltrationabundanceofvariousimmunecells.D.ExpressionofFGL1innormaltissue,endometrioidcarcinomasandserous/mixedcarcinomasweredifferent.t-testwasusedtocomparethedifferencebetweengroups.E.RelationshipbetweenFGL1expressionandTMB.PatientsweredividedintotwogroupsaccordingtothemedianvalueofFGL1expression.DifferenceofTMBbetweengroupswascalculatedbyMann-Whitneytest.

3 討 論

近年來，免疫治療在抗腫瘤領(lǐng)域取得巨大進展。其中，免疫檢查點抑制劑如Ipilimumab(靶向CTLA-4)、Nivolumab和Pembrolizumab(靶向PD-1)已經(jīng)獲批用于臨床治療，靶向LAG-3的抑制劑也已開展臨床試驗。針對晚期/復(fù)發(fā)性EC，雖然目前尚無大規(guī)模隨機對照臨床試驗結(jié)果，但多項小樣本試驗、個案報道提示免疫治療有巨大潛力。比如，PD- 1抗體Pembrolizumab治療MMR基因缺陷型復(fù)發(fā)性EC，總反應(yīng)率和疾病控制率分別為55%和89%[23]。另一項研究報道了2例多次復(fù)發(fā)、難治性EC患者，應(yīng)用PD- 1抑制劑Nivolumab進行治療，治療反應(yīng)良好[16]。然而，臨床試驗KEY- Note 028納入了24例PD- L1表達評分大于1的、MSI- H型EC患者，經(jīng)Pembrolizumab治療后，總有效率僅為12.5%[24]。這些結(jié)果表明，雖然免疫治療能讓部分EC患者獲益，如何篩選獲益患者、以及藥物選擇仍有待進一步研究。

EC的四種分子亞型與免疫檢查點抑制劑治療反應(yīng)有潛在關(guān)聯(lián)。POLE突變型和MSI型腫瘤具有廣泛的基因突變，TMB更高。研究表明，在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中高TMB與PD- 1/PD- L1抑制劑獲益顯著相關(guān)[12- 13]。可能是因為高TMB的腫瘤有機會產(chǎn)生更多腫瘤新抗原，由此刺激抗腫瘤免疫應(yīng)答反應(yīng)。文獻還報道，POLE突變型EC組織中浸潤T細胞和CD8+T細胞數(shù)目，以及PD-1表達顯著升高[14]。本研究對TCGA數(shù)據(jù)庫中更新后的521例EC患者進行再分析，同樣證實POLE突變型和MSI型的腫瘤中總白細胞、T細胞以及CD8+T細胞浸潤程度顯著升高。這與TCGA樣本的HE染色一致，其結(jié)果顯示POLE突變型腫瘤中淋巴細胞浸潤最豐富，而MSI型的浸潤程度介于POLE突變型和微衛(wèi)星穩(wěn)定型之間[15]。本研究也再次證實POLE突變型和MSI型EC中PD-1和PD-L1的表達明顯高于另外兩種亞型。Eggink等[25]通過免疫組化的方法也同樣證明該現(xiàn)象。TIM-3作為免疫檢查點分子，在腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮作用，可作為潛在的腫瘤免疫治療靶點[26]。本研究雖然發(fā)現(xiàn)TIM-3在POLE/MSI型EC中高表達，但其配體Gal-9在四種分子亞型中表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與預(yù)后的相關(guān)性也無統(tǒng)計學(xué)意義。因此，靶向TIM-3/Gal-9通路在EC中的意義尚需進一步研究。此外，我們發(fā)現(xiàn)免疫抑制分子CTLA-4/CD80在POLE突變型和MSI型中的表達顯著高于TP53突變型及NSMP亞型。因此，抗PD-1/PD-L1和抗CTLA-4治療在POLE突變型和MSI型中的應(yīng)用均值得進一步深入研究。

LAG-3是活化T細胞表面的另一個免疫抑制性受體。LAG-3在腫瘤浸潤淋巴細胞表面中表達上調(diào)，而阻斷LAG-3可以提高抗腫瘤T細胞反應(yīng)[27- 28]。此外，同時阻斷LAG-3和PD-1兩條通路比單獨阻斷任何一條通路具有更好的抗腫瘤效應(yīng)，提示LAG-3與PD-1在腫瘤免疫逃逸機制中起協(xié)同作用[9, 27- 28]。因此LAG-3是一個重要的免疫治療靶點，目前已經(jīng)在血液腫瘤(NCT02061761)和實體腫瘤(NCT01968109)中開展相關(guān)臨床試驗。本研究發(fā)現(xiàn)LAG-3在EC的四種分子亞型中的表達趨勢與PD-1、CTLA-4相似，提示抗LAG-3可能作為EC治療靶點。FGL1最近剛被鑒定為LAG-3的配體，在腫瘤免疫抑制中發(fā)揮重要作用[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GL1在EC中的表達趨勢與其他免疫抑制分子有一定差別。比如FGL1在POLE突變亞型中表達并不高，而在MSI中表達升高。此外，F(xiàn)GL1在NSMP中表達也異常升高。進一步分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GL1的表達與T細胞、Treg細胞、巨噬細胞等間質(zhì)細胞成分均無相關(guān)性，而在子宮內(nèi)膜樣癌中顯著高于正常對照組織。這與文獻報道一致，F(xiàn)GL1在NSCLC中主要表達于癌細胞，而腫瘤間質(zhì)表達較低[9]。在NSCLC組織中，F(xiàn)GL1高表達與患者不良預(yù)后顯著相關(guān)[9]。本研究發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜樣癌中，F(xiàn)GL1高表達的患者RFS較好，而在漿液性或混合型癌中FGL1表達與患者預(yù)后的關(guān)系無統(tǒng)計學(xué)意義。這表明，LAG-3/FGL1通路調(diào)控較為復(fù)雜，在不同癌種、不同病理學(xué)類型中可能有不同機制。總之，LAG-3/FGL1通路在EC中異常表達，提示該通路可作為EC免疫治療的另一個候選靶點，為后續(xù)基礎(chǔ)研究和臨床研究提供了思路。

綜上所述，抗PD-1/PD-L1治療EC在小樣本試驗中已經(jīng)顯示出較好的治療反應(yīng)和臨床獲益。本研究通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫中較大樣本的EC基因數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)PD-1、CTLA-4和LAG-3分子在POLE突變型和MSI型EC中表達升高。特別是LAG-3/FGL1通路的表達特征具有重要臨床意義。因此，單獨靶向其中任意一條通路或聯(lián)合阻斷多條通路，均可作為EC免疫治療的候選策略。

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利益沖突：本文全部作者均認同文章無相關(guān)利益沖突；

學(xué)術(shù)不端：本文在初審、返修及出版前均通過中國知網(wǎng)(CNKI)科技期刊學(xué)術(shù)不端文獻檢測系統(tǒng)學(xué)術(shù)不端檢測；

同行評議：經(jīng)同行專家雙盲外審，達到刊發(fā)要求。