張穎慧，岳 華,2，湯 承,2*，黃建德

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都610041；2.青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610041；3.金瑞鴻捷(廈門)生物科技有限公司，福建廈門361000)

牛傳染性鼻氣管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)引起牛流鼻涕、咳嗽、呼吸困難、免疫抑制、結(jié)膜炎、腦炎、公牛膿皰性龜頭-包皮炎和母牛流產(chǎn)等臨床癥狀[1-3]。血清學(xué)調(diào)查顯示，國(guó)內(nèi)外IBRV感染情況普遍[4]。IBRV長(zhǎng)期潛伏于牛神經(jīng)節(jié)中，導(dǎo)致感染牛外表健康但終生帶毒，在運(yùn)輸、混群和外界刺激等應(yīng)激因素下易被激活，從而導(dǎo)致其它易感動(dòng)物IBRV的暴發(fā)[5-6]。OIE和我國(guó)均規(guī)定需對(duì)進(jìn)出口牛、凍精和牛肉制品進(jìn)行IBRV檢疫[7]。由此可見，制定科學(xué)防控和凈化IBRV的重要性，而準(zhǔn)確快速的檢測(cè)方法是實(shí)施科學(xué)防控和凈化檢疫的必要前提。

目前國(guó)內(nèi)外均有大量關(guān)于牛傳染性鼻氣管炎(Infectious bovine rhinotracheitis，IBR)的診斷方法，主要包括病原學(xué)診斷和血清學(xué)診斷[6-7]，OIE推薦采用Wang等建立的熒光定量PCR方法檢測(cè)IBRV[8]。但目前以核酸為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法，從核酸提取到報(bào)告結(jié)果仍需要3 h～4 h，且需要專業(yè)技術(shù)人員在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，難以滿足口岸現(xiàn)地檢疫的需求。國(guó)內(nèi)外已有基于恒溫隔絕式熒光PCR(Insulated isothermal PCR，iiPCR)方法現(xiàn)地檢測(cè)病原微生物的報(bào)道，且該方法所需的核酸檢測(cè)儀器已經(jīng)實(shí)現(xiàn)小型化，自帶電源，便于攜帶、操作簡(jiǎn)單[9-10]，可以對(duì)病原進(jìn)行現(xiàn)地快速檢測(cè)，已廣泛用于對(duì)蝦白斑病病毒、藍(lán)舌病毒、口蹄疫病毒等病原[11-13]的檢測(cè)，但還未見iiPCR應(yīng)用于IBRV檢測(cè)的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究建立了現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)IBRV的iiPCR方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)IBRV的現(xiàn)地快速準(zhǔn)確的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 病毒株、菌株和臨床樣本 IBRV、牛病毒性腹瀉-黏膜病病毒(BVDV)、牛副流感3型病毒(BPIV3)、牛呼吸道合胞體病毒(BRSV)、牛腺病毒3型(BAV3)、牛冠狀病毒(BCoV)、牛支原體(M.bovis)、多殺性巴氏桿菌(P.multocida)、溶血性曼氏桿菌(M.haemolytica)等的核酸均由西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存，其中BVDV、BPIV3、BRSV和BCoV的核酸均反轉(zhuǎn)錄為cDNA保存。

3份IBRV陽(yáng)性樣品為PCR方法[14]檢測(cè)為陽(yáng)性，并經(jīng)測(cè)序證實(shí)的鼻栻子樣本，由西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；15份鼻拭子樣品于2018年9月采集自四川省某牛場(chǎng)，樣品采集的牛均表現(xiàn)出流鼻涕、咳嗽、呼吸困難、發(fā)熱等呼吸道癥狀，且均于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

29份商品化凍精為2017年1月～10月購(gòu)于某畜牧站，其中7份來(lái)自黑龍江，6份來(lái)自北京，5份來(lái)自上海，5份來(lái)自新疆，2份來(lái)自河北，1份來(lái)自云南，1份來(lái)自河南，1份來(lái)自四川，1份來(lái)自天津，均于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主 要試劑 Premix ExTaq(Probe qPCR)、pMD19-T載體、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、DNA Marker均購(gòu)自TaKaRa公司；Gel Extraction Kit和質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自O(shè)MEGA BIO-TEK公司；PetNAD核酸萃取試劑盒、Uni-iiPCR Starter Kit均購(gòu)自金瑞鴻捷(廈門)生物科技有限公司。

1.3 引物的合成 鑒于OIE推薦的檢測(cè)IBRV的熒光定量PCR方法的引物和探針能滿足iiPCR方法對(duì)引物和探針的要求，所以本研究采用該方法的引物和探針[8]，上下游引物分別為gB F：5'-TGTGGACC TAAACCTCACGGT-3'/gB R：5'-GTAGTCGAGCAGA CCCGTGTC-3'；探針為TaqMan Probe：FAM-AGGA CCGCGAGTTCTTGCCGC-TAMRA；擴(kuò)增片段位于IBRV全基因的57 499 bp～57 575 bp，長(zhǎng)度為97 bp，引物和探針由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 以IBRV陽(yáng)性DNA為模板，采用上述引物，PCR擴(kuò)增預(yù)期大小為97 bp的IBRV基因片段，將目的片段回收純化后克隆至pMD19-T載體，將測(cè)序鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒作為IBRV陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，用核酸蛋白質(zhì)檢測(cè)儀測(cè)定陽(yáng)性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，換算成拷貝數(shù)。

1.5 反應(yīng)體系的優(yōu)化 按照Uni-iiPCR Starter Kit說(shuō)明書，利用方陣法，采用50 μL體系對(duì)引物的濃度10 μmol/μL(0.5 μL～5 μL)、探針濃度 10 μmol/μL(0.05 μL～0.5 μL)、Taq酶 5 U/μL(1 μL～5 μL)和模板(0.5 μL～5 μL)分別進(jìn)行優(yōu)化，以 PCR反應(yīng)前后的讀取到熒光值的增長(zhǎng)值最高的用量為最佳，采用優(yōu)化后的最佳體系作為本研究建立的iiPCR方法的體系。

1.6 特異性試驗(yàn) 采用建立的iiPCR方法對(duì)IBRV、BVDV、BPIV3、BRSV、BAV3、BCoV、M.bovis、P.multocida、M.haemolytica核酸進(jìn)行檢測(cè)，以ddH2O為模板設(shè)立陰性對(duì)照，并將iiPCR產(chǎn)物經(jīng)3.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，以評(píng)價(jià)該方法的特異性。

1.7 敏感性試驗(yàn) 將重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品做10倍倍比稀釋(10-1～10-12)后作為模板，采用建立的iiPCR方法和OIE推薦的熒光定量PCR方法[8]分別對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，以確定本研究建立的iiPCR方法的檢測(cè)下限，同時(shí)比較兩種方法的敏感性。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 采用建立的iiPCR方法對(duì)5個(gè)稀釋度的IBRV重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品(10-4～10-8倍稀釋)進(jìn)行檢測(cè)，每種濃度的模板重復(fù)檢測(cè)3次，檢測(cè)其批內(nèi)重復(fù)性；同時(shí)以這些陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品為模板在不同時(shí)間進(jìn)行3次獨(dú)立檢測(cè)，檢測(cè)其批間重復(fù)性。

1.9 臨床樣本檢出情況的比較 采用PetNAD核酸萃取試劑盒提取15份牛鼻拭子的核酸，分別采用建立的iiPCR方法和OIE推薦的熒光定量PCR方法[8]對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種方法的檢測(cè)結(jié)果。

1.10 商品化凍精樣品檢測(cè) 采用PetNAD核酸萃取試劑盒分別提取29份商品化凍精的核酸，并采用建立的iiPCR方法重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的鑒定對(duì)其進(jìn)行IBRV檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 iiPCR方法反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果 經(jīng)優(yōu)化后的iiPCR方法反應(yīng)體系為：上下游引物各3.5 μL(10 μmol/μL)、探針 0.35 μL(10 μmol/μL)、Taq酶1.25 μL(5 U/μL)、預(yù)混 Buffer 25 μL、模板 3 μL、ddH2O 補(bǔ)足至 50 μL。

2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果 采用已建立的iiPCR方法檢測(cè)各病原核酸，結(jié)果顯示其僅對(duì)IBRV核酸可以擴(kuò)增出目的片段，而對(duì) BVDV、BPIV3、BRSV、BAV3、BCoV、M.bovis、P.multocida、M.haemolytica等均不能擴(kuò)增出目的片段(圖1)，表明該方法特異性較強(qiáng)。

2.3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果 測(cè)定IBRV重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的濃度后換算成拷貝數(shù)為2.4×1010拷貝/μL。iiPCR方法敏感性檢測(cè)結(jié)果顯示，該方法對(duì)IBRV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品最低檢測(cè)限為2.4拷貝/μL(圖2A)。與OIE推薦的熒光定量PCR方法檢測(cè)下限一致(圖2B)，表明兩種檢測(cè)方法均具有較高的敏感性。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 采用建立的iiPCR方法對(duì)5個(gè)稀釋度的IBRV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，批內(nèi)3個(gè)平行和批間3次重復(fù)的檢測(cè)結(jié)果均一致，證明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.5 臨床樣本檢出情況的比較 采用建立的iiPCR和OIE推薦的熒光定量PCR方法同時(shí)對(duì)15份鼻拭子樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示兩種方法對(duì)IBRV的檢測(cè)結(jié)果和陽(yáng)性率完全一致，均為53%(8/15)，表明建立的iiPCR方法能夠滿足對(duì)IBRV臨床樣本的現(xiàn)地檢測(cè)。

2.6 商品化凍精檢測(cè)結(jié)果 采用iiPCR方法對(duì)9個(gè)省29份商品化凍精的檢測(cè)結(jié)果顯示，IBRV的總陽(yáng)性率為24%(7/29)(表1)。表明我國(guó)流通的商品化凍精攜帶IBRV的情況較普遍。

表1 商品化凍精中IBRV的檢測(cè)結(jié)果

3 討論

臨床IBRV抗體檢測(cè)為陰性的牛仍可能是IBRV潛伏攜帶者[15]，因此針對(duì)IBRV抗原的檢測(cè)方法可能對(duì)潛伏期的病原更有效。OIE推薦使用熒光定量PCR方法對(duì)調(diào)運(yùn)活牛和商品化凍精進(jìn)行IBRV檢測(cè)[8,16]，但需要在專業(yè)的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，且從核酸提取到報(bào)告檢測(cè)結(jié)果通常需要3 h～4 h，難以滿足運(yùn)輸口岸現(xiàn)地檢疫的需求。

iiPCR是一種基于熱對(duì)流原理的熒光PCR擴(kuò)增技術(shù)[17]，基于該原理研發(fā)的手持式POCKIT小型熒光PCR儀僅重380 g，自帶電源，無(wú)需設(shè)置反應(yīng)條件，一鍵操作，僅需42 min即可完成PCR反應(yīng)，且結(jié)果直接顯示在液晶屏上，容易判讀[9-10]，適用于現(xiàn)地快速檢測(cè)，目前已經(jīng)在病原快速檢測(cè)中廣泛應(yīng)用[11-13]。本研究建立的檢測(cè)IBRV的iiPCR方法特異性和敏感性好，為IBRV的檢測(cè)提供了一種新的可靠的方法。核酸提取的時(shí)間是影響PCR檢測(cè)結(jié)果報(bào)告時(shí)間的重要因素[10]，傳統(tǒng)的酚-氯仿法和DNA提取試劑盒需要高速冷凍離心、水浴和冰浴等環(huán)節(jié)，只能在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，且通常需要40 min～120 min。為配合現(xiàn)地PCR檢測(cè)的需要，本研究采用了Pet-NAD核酸萃取試劑盒，其提取過(guò)程僅需常溫低速離心，可以在15 min內(nèi)完成。并且，本研究建立的iiPCR方法配合核酸提取試劑盒，對(duì)臨床樣本的檢測(cè)結(jié)果與OIE推薦的熒光定量PCR方法是一致的，但從核酸提取到報(bào)告檢測(cè)結(jié)果可在1 h內(nèi)完成，大大節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間，且操作簡(jiǎn)單，能夠滿足對(duì)IBRV口岸檢疫和現(xiàn)地檢測(cè)的需要。

種公牛感染IBRV后，存在雖然外表健康但終生帶毒的情況，其精液中可以攜帶IBRV，經(jīng)自然交配或人工授精使母牛感染，從而導(dǎo)致母牛流產(chǎn)和產(chǎn)奶量下降等[16]。季新成等對(duì)新疆某牛場(chǎng)120份新鮮牛精液和40份凍存牛精液進(jìn)行IBRV檢測(cè)結(jié)果顯示，IBRV陽(yáng)性率為16%[18]；本研究對(duì)來(lái)自9個(gè)省的29份商品化凍精檢測(cè)結(jié)果顯示，IBRV陽(yáng)性率為24%。表明我國(guó)流通的商品化凍精攜帶IBRV較為普遍，有必要加強(qiáng)對(duì)我國(guó)流通的商品化凍精的監(jiān)測(cè)，同時(shí)建議加強(qiáng)對(duì)種公牛的檢疫凈化。