王雪，肖亞玲，孫正怡，甄璟然，郁琦，鄧成艷，周遠(yuǎn)征，王含必

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院婦科內(nèi)分泌與生殖中心，北京 100730)

在輔助生殖技術(shù)中，患者的妊娠結(jié)局取決于胚胎的質(zhì)量好壞，而胚胎發(fā)育潛能與卵母細(xì)胞質(zhì)量息息相關(guān)，因此對(duì)卵母細(xì)胞形態(tài)和發(fā)育潛能進(jìn)行正確評(píng)估非常重要。通常卵母細(xì)胞的評(píng)估方法是基于胞漿外和胞漿內(nèi)的一些特征進(jìn)行的，包括極體形態(tài)、卵周間隙、折射體、胞內(nèi)顆粒、空泡和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等[1]。在正常卵母細(xì)胞中滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈多個(gè)、分散的球形聚集模式，周圍由線粒體包繞[2]。而卵母細(xì)胞內(nèi)滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集(Smooth endoplasmic reticulum clusters，sERC)是卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)的一種異常滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集體，以單個(gè)大聚集體模式聚集[3]，表現(xiàn)為圓形、 扁平且清晰的盤狀物，直徑約為10～18 mm[4]。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者已對(duì)sERC做了很多相關(guān)研究，但在輔助生殖過(guò)程中是否可以移植含sERC的卵母細(xì)胞發(fā)育而來(lái)的胚胎還無(wú)明確結(jié)論。

盡管2011年的歐洲人類生殖與胚胎學(xué)學(xué)會(huì)(Alpha/ESHRE)專家共識(shí)建議丟棄含sERC的卵母細(xì)胞[1]，但是各個(gè)中心對(duì)含有sERC的卵母細(xì)胞的處理仍然缺乏統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)。最近歐洲一項(xiàng)多中心的調(diào)查顯示，48%(56/118)的中心受Alpha/ESHRE共識(shí)的影響，改變了對(duì)含sERC卵母細(xì)胞的態(tài)度，但是僅僅有14%的中心在ICSI之前丟棄含sERC的卵母細(xì)胞，43%的中心并沒(méi)有丟棄含SERC的卵母細(xì)胞，但是也沒(méi)有登記和隨訪新生兒數(shù)據(jù)[5]。因此，當(dāng)受sERC影響的卵母細(xì)胞沒(méi)有丟棄時(shí)，記錄胚胎的發(fā)育情況和對(duì)新生兒隨訪，并將這些數(shù)據(jù)進(jìn)行發(fā)表是非常重要的。只有通過(guò)分析這些數(shù)據(jù)才能更好地明確卵母細(xì)胞的這些形態(tài)學(xué)異常是否與文獻(xiàn)中記錄的先天異常有關(guān)。因此，本中心進(jìn)行了此前瞻性的觀察性研究，對(duì)近2年出現(xiàn)含sERC卵母細(xì)胞的胚胎發(fā)育情況及臨床和新生兒結(jié)局進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，追蹤含sERC卵母細(xì)胞的移植預(yù)后，試圖為含sERC卵母細(xì)胞的可用性問(wèn)題增添新的證據(jù)。

資料與方法

一、研究對(duì)象與分組

收集2016年12月至2018年8月在我院生殖中心進(jìn)行ICSI助孕治療的患者納入研究。按照本中心的常規(guī)操作，無(wú)額外操作，所有患者均簽署知情同意書(shū)。本研究納入標(biāo)準(zhǔn)為：(1)進(jìn)行ICSI操作的患者；(2)新鮮取卵周期。排除標(biāo)準(zhǔn)為：(1)進(jìn)行常規(guī)IVF的患者；(2)男方為睪丸穿刺取精或副睪穿刺取精的患者；(3)進(jìn)行植入前遺傳學(xué)診斷或篩查的患者。

根據(jù)患者獲卵時(shí)卵母細(xì)胞中是否出現(xiàn)sERC，分為sERC+周期組(A組)和sERC-周期組(B組)，A組即該周期每個(gè)人所獲得的卵母細(xì)胞中至少出現(xiàn)1個(gè)sERC卵母細(xì)胞，共80個(gè)周期，B組即所獲得的卵母細(xì)胞中均未出現(xiàn)sERC，共1 492個(gè)周期。A組中再根據(jù)卵母細(xì)胞是否出現(xiàn)sERC，進(jìn)一步分為sERC+卵母細(xì)胞組(A1組，共140個(gè))和sERC-卵母細(xì)胞組(A2組，共416個(gè))。再根據(jù)所移植的胚胎是否來(lái)源于sERC卵母細(xì)胞，分為Ⅰ組：所移植胚胎全部來(lái)源于sERC+卵母細(xì)胞；Ⅱ組：所移植胚胎中的1枚胚胎來(lái)源于sERC+卵母細(xì)胞，1枚來(lái)源于sERC-卵母細(xì)胞；Ⅲ組：所移植胚胎均來(lái)源于sERC-卵母細(xì)胞。

二、研究方法

1.控制性促排卵和取卵：所有患者的促排方案按照本中心的常規(guī)進(jìn)行，主要是GnRH激動(dòng)劑長(zhǎng)方案和GnRH拮抗劑方案，使用卵泡刺激素(FSH，果納芬，默克雪蘭諾，瑞士)進(jìn)行卵巢刺激。當(dāng)主導(dǎo)卵泡直徑達(dá)到18～20 mm時(shí)，注射人絨毛膜促性腺激素(HCG，艾澤，默克雪蘭諾，瑞士)，38 h后進(jìn)行陰道超聲引導(dǎo)的卵泡穿刺來(lái)獲取卵母細(xì)胞。

2.卵母細(xì)胞sERC的評(píng)估及ICSI操作：獲取卵母細(xì)胞后2 h左右用透明質(zhì)酸酶消化顆粒細(xì)胞，拆除卵母細(xì)胞周圍顆粒細(xì)胞，放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h左右進(jìn)行ICSI操作。ICSI時(shí)，在倒置顯微鏡下評(píng)估每一個(gè)卵母細(xì)胞的形態(tài)，并記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。在高倍鏡下，胞漿內(nèi)大的sERC表現(xiàn)為圓形、扁平且清晰的盤狀物，與空泡相似，但sERC內(nèi)無(wú)液體，折光性相對(duì)較弱，兩者易于鑒別[6-7]。在ICSI操作時(shí)應(yīng)盡量避免將精子注射到sERC內(nèi)。

3.胚胎培養(yǎng)、評(píng)估和臨床判斷：ICSI后18～20 h觀察原核情況，若出現(xiàn)2個(gè)原核(2PN)判斷為正常受精。取卵后第3日進(jìn)行胚胎的形態(tài)學(xué)評(píng)估，根據(jù)卵裂球的數(shù)目、大小、形態(tài)及碎片的狀態(tài)進(jìn)行評(píng)分，挑選質(zhì)量最好的兩枚胚胎進(jìn)行移植，如不能移植則將兩枚胚胎進(jìn)行冷凍保存，其余所有胚胎均進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，在取卵后第5日或6日觀察囊胚形成情況，并根據(jù)Gardner評(píng)分法[8]進(jìn)行評(píng)分，挑選內(nèi)細(xì)胞團(tuán)質(zhì)量達(dá)到A或B級(jí)的囊胚進(jìn)行冷凍，C級(jí)的囊胚放棄，滋養(yǎng)細(xì)胞層的質(zhì)量不限。冷凍操作方法按照本中心的常規(guī)進(jìn)行。移植后25～30 d超聲檢查，可見(jiàn)胎囊并有胎心搏動(dòng)者判斷為臨床妊娠.

4.觀察指標(biāo)：胚胎相關(guān)的測(cè)量指標(biāo)包括：(1)受精率=受精數(shù)/MⅡ卵母細(xì)胞數(shù)×100%；(2)優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/卵裂數(shù)×100%；(3)囊胚形成率=囊胚數(shù)/(卵裂數(shù)-移植數(shù)-卵裂期冷凍數(shù))×100%；(4)種植率=著床胚胎數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%。臨床相關(guān)的測(cè)量指標(biāo)包括：(1)臨床妊娠率=臨床妊娠例數(shù)/移植周期數(shù)×100%；(2)流產(chǎn)率=流產(chǎn)例數(shù)/臨床妊娠例數(shù)×100%。(3)活產(chǎn)率=隨訪獲得活產(chǎn)的總例數(shù)/移植周期數(shù)×100%。新生兒的數(shù)據(jù)包括：孕周、出生體重、體長(zhǎng)、性別、出生時(shí)的畸形情況。

三、統(tǒng)計(jì)方法

結(jié) 果

本研究共納入1 435例患者，共1 572個(gè)ICSI周期，其中出現(xiàn)sERC的周期為80個(gè)周期，即sERC+周期組(A組)；sERC-周期組(B組)為1 492個(gè)周期。至少出現(xiàn)1個(gè)sERC卵母細(xì)胞的周期發(fā)生率為5.1%?？偣布{入分析的MⅡ卵母細(xì)胞為6 759個(gè)，其中存在sERC的卵母細(xì)胞為140個(gè)，發(fā)生率為2.1%。A組中，sERC卵母細(xì)胞的發(fā)生率為34.6%。

一、A、B兩組一般情況比較

兩組的年齡、不孕年限和Gn用量比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。A組HCG日E2水平略高于B組，但尚無(wú)顯著性差異(P>0.05)；兩組的促排卵方案比較亦無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表1)。

二、A、B兩組的胚胎發(fā)育指標(biāo)和臨床情況比較

A組獲卵數(shù)、成熟卵率和受精率略高于B組，但均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；A組的囊胚形成率顯著低于B組(P<0.05)；兩組的種植率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率和活產(chǎn)率比較亦無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表2)。

三、A、B兩組的新生兒結(jié)局的比較

由于2018年移植的患者尚有部分未分娩，所以分娩結(jié)局只分析至2018年5月底的數(shù)據(jù)。A組的新生兒出生體重略低于B組，且A組的早產(chǎn)率略高于B組，但兩者比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；兩組的出生缺陷率比較亦無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表3)。

組 別周期數(shù)年齡不孕年限Gn用量(支)基礎(chǔ)LH(U/L)A組8035.2±3.94.6±3.135.4±4.14.1±3.0B組1 49235.4±4.34.7±3.034.5±11.74.2±2.7組 別周期數(shù)HCG日激素水平促排卵方案E2(pmol/L)P(nmol/L)LH(U/L)GnRH激動(dòng)劑GnRH拮抗劑A組803 876.4±1 298.63.5±1.32.2±1.160(75.0)20(25.0)B組1 4923 256.5±1 356.83.8±1.62.3±0.91 089(73.0)403(27.0)

組 別周期數(shù)獲卵數(shù)成熟卵率受精率優(yōu)胚率A組807.8±3.888.1(556/631)91.0(506/556)12.3(62/505)B組1 4927.2±4.786.2(9 289/10 776)89.4(8 306/9 289)9.7(807/8 283)組 別周期數(shù)囊胚形成率種植率臨床妊娠率流產(chǎn)率活產(chǎn)率A組8028.7(104/363)*23.3(28/120)35.9(23/64)10.5(2/19)28.5(16/56)B組1 49233.7(1 968/5 838)26.1(574/2 201)39.6(468/1 181)22.0(91/414)29.9(312/1 045)

注：與B組比較，*P<0.05；獲卵數(shù)、成熟卵率、受精率、優(yōu)胚率、囊胚形成率、種植率和臨床妊娠率按照總移植人數(shù)計(jì)算(2016～2018年)；由于2018年移植的患者目前尚有部分未分娩，故流產(chǎn)率和出生率按照截至2018年5月底前移植的人數(shù)計(jì)算

組 別分娩周期數(shù)性別比(男/女)出生體重(g)雙胎率出生缺陷率早產(chǎn)率A組160.67(8/12)2 706.0±551.525.0(4/16)025.0(4/16)B組3131.05(192/183)2 942.0±628.519.8(62/313)0.6(2/313)16.9(53/313)

四、A組中A1組和A2組的胚胎發(fā)育情況比較

A組80個(gè)sERC+周期中共獲得140個(gè)sERC+卵母細(xì)胞(A1組)，416個(gè)sERC-卵母細(xì)胞(A2組)。其中A1組的受精率、囊胚形成率顯著低于A2組(P<0.05)，A1組的優(yōu)質(zhì)胚胎率有低于A2組的趨勢(shì)，但尚無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表4)。

表4 A1組和A2組的胚胎發(fā)育情況比較 (%)

注：與A2組比較，*P<0.05

五、新鮮移植sERC+卵母細(xì)胞的臨床結(jié)局比較

在A組中，只有2個(gè)周期全部進(jìn)行兩枚sERC+卵母細(xì)胞來(lái)源的胚胎移植，有2個(gè)周期只有1枚胚胎可移植，且都是sERC+卵母細(xì)胞來(lái)源，在這4個(gè)周期(Ⅰ組)中只有1枚胚胎著床，且成功分娩。10個(gè)周期(Ⅱ組)進(jìn)行sERC+/sERC-卵母細(xì)胞來(lái)源的胚胎移植，其中4例獲得臨床妊娠，已經(jīng)隨訪的2例患者均已分娩。50個(gè)周期(Ⅲ組)進(jìn)行sERC-卵母細(xì)胞來(lái)源的胚胎移植，其中18例獲得臨床妊娠。3組的種植率和臨床妊娠率比較無(wú)顯著性差異(P均>0.05)，3組均未出生畸形兒(表5)。

表5 不同sERC+、sERC-卵母細(xì)胞來(lái)源胚胎的臨床結(jié)局(%)

注：移植周期數(shù)、種植率、臨床妊娠率按照總移植人數(shù)計(jì)算(2016～2018年)；由于2018年移植的患者目前尚有部分未分娩，故出生率和畸形率按照截至2018年5月底前移植的人數(shù)計(jì)算

討 論

既往文獻(xiàn)報(bào)道在促排卵周期中，sERC的發(fā)生率為5.4%～23.1%不等[9-10]。在本研究中，至少出現(xiàn)一個(gè)sERC卵母細(xì)胞的周期發(fā)生率為5.1%。sERC的觀察取決于觀察者的經(jīng)驗(yàn)水平和所應(yīng)用顯微鏡，可以在光學(xué)顯微鏡下觀察到一些直徑較大的sERC，而一些較小的sERC卻不容易被發(fā)現(xiàn)。迄今為止sERC的形成原因尚不清楚，有研究顯示sERC的形成可能是由于卵巢過(guò)度刺激造成的，認(rèn)為HCG日E2水平與sERC的形成有顯著相關(guān)性[6]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)盡管A組獲得的卵母細(xì)胞數(shù)略高于B組，HCG日E2水平略高于B組，但組間比較均無(wú)顯著性差異。另有研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)過(guò)程中sERC體積會(huì)增大，認(rèn)為所有sERC之間或小sERC之間存在連接，其可以在卵母細(xì)胞中形成較大的sERC；以及提前出現(xiàn)的LH峰會(huì)引起MⅡ卵母細(xì)胞出現(xiàn)sERC，認(rèn)為sERC是卵巢促排卵過(guò)程中激發(fā)LH之前胞漿過(guò)度成熟的標(biāo)志，其可能是胞漿過(guò)熟的一個(gè)表現(xiàn)[10]。

關(guān)于sERC對(duì)胚胎發(fā)育影響的爭(zhēng)議較大。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)A組與B組的受精率和優(yōu)胚率相似，組間比較無(wú)顯著性差異，這與之前一些研究結(jié)論[9，11-13]相似。但也與一些研究結(jié)論相反，有學(xué)者認(rèn)為在正常生理情況下，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)會(huì)釋放鈣離子，其在卵母細(xì)胞成熟、受精和早期胚胎發(fā)育階段發(fā)揮關(guān)鍵作用，而sERC的異常分布類型可能會(huì)參與鈣離子信號(hào)的異常調(diào)節(jié)，導(dǎo)致sERC+周期組的受精率顯著下降[14-16]。在本研究中我們還發(fā)現(xiàn)A組的囊胚形成率顯著降低，這與Ebner等[17]的研究結(jié)論一致。我們根據(jù)A組內(nèi)卵母細(xì)胞是否存在sERC進(jìn)行分組，并對(duì)兩亞組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)A1組的受精率顯著低于A2組，將胚胎培養(yǎng)至Day5～6時(shí)，A1組的囊胚形成率顯著低于A2組，這與之前一些研究結(jié)論[6，11]相似。盡管在受精后第3天胚胎的發(fā)育速率與正常卵母細(xì)胞相比并無(wú)顯著性差異，但sERC+卵母細(xì)胞的囊胚發(fā)育更慢一些，而且有研究顯示囊胚的擴(kuò)張程度和孵化狀態(tài)都受sERC的影響，sERC+卵母細(xì)胞來(lái)源的囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(Inner cell mass，ICM)質(zhì)量更差一些，sERC能夠使ICM質(zhì)量下降35%[18]。最近Otsuki等[10]進(jìn)行了一項(xiàng)Time-lapse的研究，記錄并比較了sERC+卵母細(xì)胞的分裂過(guò)程，他們發(fā)現(xiàn)sERC+組卵母細(xì)胞的有絲分裂或減數(shù)分裂錯(cuò)誤率顯著高于非sERC卵母細(xì)胞。如果在有絲分裂或減數(shù)分裂期間發(fā)生卵裂失敗就會(huì)導(dǎo)致胚胎染色體異常。一旦卵裂失敗的細(xì)胞發(fā)育為滋養(yǎng)細(xì)胞，就會(huì)出現(xiàn)胎盤異常；如果這些細(xì)胞發(fā)育為ICM，會(huì)導(dǎo)致進(jìn)一步的卵裂失敗，反過(guò)來(lái)會(huì)引起非整倍體。總之，從這些結(jié)論中我們很難總結(jié)sERC是否會(huì)影響Day3的胚胎質(zhì)量，而且囊胚形成率低的原因還不是很清楚，還有待于進(jìn)一步研究。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)A組與B組的種植率、臨床妊娠率相似，組間比較無(wú)顯著性差異，這與Hattori 等[12]的研究結(jié)論相似。由于2018年移植的患者中還有部分沒(méi)有分娩，因此在統(tǒng)計(jì)妊娠結(jié)局時(shí)我們只統(tǒng)計(jì)至2018年5月底，在有分娩結(jié)局的患者中，我們發(fā)現(xiàn)A組的出生體重略低和早產(chǎn)率略高，分析原因可能是因?yàn)锳組雙胎較多造成的，與sERC本身的關(guān)系可能不大。我們還分析了A組內(nèi)，單純移植sERC+卵母細(xì)胞、移植sERC+/sERC-和完全sERC-卵母細(xì)胞的出生結(jié)局。在日常工作中，由于考慮到sERC對(duì)胚胎及出生結(jié)局的影響尚不確切，我們會(huì)優(yōu)先移植非sERC卵母細(xì)胞來(lái)源的胚胎，因此移植sERC卵母細(xì)胞來(lái)源胚胎的周期數(shù)較少，僅有4個(gè)周期完全移植sERC來(lái)源的胚胎，有1例活產(chǎn)，胎兒未見(jiàn)異常。10個(gè)周期移植了至少1枚sERC+卵母細(xì)胞來(lái)源的胚胎，在隨訪的4個(gè)妊娠周期中有2例分娩，胎兒未見(jiàn)異常，這與Mateizel等[9]的研究結(jié)論相一致，他們發(fā)現(xiàn)移植來(lái)源于顯著sERC卵母細(xì)胞的胚胎后可以生育正常無(wú)畸形的孩子；該研究納入了394個(gè)sERC+周期，81例活產(chǎn)，sERC+卵組與sERC-組的新生兒畸形率無(wú)顯著差異。同樣Itoi等[13]也未發(fā)現(xiàn)移植sERC+卵母細(xì)胞來(lái)源的囊胚后，新生兒的結(jié)局與sERC-組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。盡管本研究的數(shù)據(jù)有限，但也支持這樣的結(jié)論，因?yàn)樵谶@些來(lái)源于sERC+卵母細(xì)胞出生的孩子中，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)異常。既往有一些研究提示sERC可能與較差的臨床結(jié)局和新生兒結(jié)局相關(guān)：Otsuki等[6]的研究顯示sERC+周期組的臨床妊娠率降低，而生化妊娠率升高；Ebner等[17]認(rèn)為移植sERC卵母細(xì)胞來(lái)源的胚胎更容易發(fā)生早產(chǎn)和低出生體重；還有研究發(fā)現(xiàn)移植sERC卵母細(xì)胞來(lái)源的胚胎后發(fā)生新生兒先天異常的比例增加，如Beckwith-Wiedmann綜合征、心血管畸形和多發(fā)畸形的發(fā)生率大大增加[6，16，19]；最近還有文獻(xiàn)報(bào)道了1個(gè)來(lái)源于sERC+卵母細(xì)胞的復(fù)雜的染色體異常[20]。但是復(fù)習(xí)文獻(xiàn)，我們知道與自然周期相比，ART操作后出生的孩子更容易發(fā)生印記缺陷[21]，所以很難判斷印記缺陷是否是由sERC造成。而且不同研究間的差異也可能是由于設(shè)計(jì)方案、樣本量大小、卵巢刺激方案、人群變異或其他因素的不同而造成。就本研究而言，移植sERC卵母細(xì)胞來(lái)源的胚胎后可以出生正常孩子，但也存在一些疑慮，即出生時(shí)正常能否代表將來(lái)的發(fā)育正常。因此，對(duì)sERC卵母細(xì)胞來(lái)源的孩子還需要進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪，關(guān)注發(fā)育過(guò)程是否有異常。

總之，在輔助生殖過(guò)程中，sERC+卵母細(xì)胞的安全性問(wèn)題還有待于進(jìn)一步商榷，對(duì)于獲卵數(shù)少的患者，如果采納Alpha共識(shí)，完全丟棄sERC+卵母細(xì)胞，那么患者的周期取消率會(huì)顯著增加。因此，對(duì)于胚胎數(shù)量少和僅有sERC+卵母細(xì)胞來(lái)源胚胎的患者來(lái)講，在充分知情同意的前提下，可以考慮移植sERC+卵母細(xì)胞來(lái)源的胚胎。在將來(lái)，sERC形成的分子機(jī)制以及sERC對(duì)卵母細(xì)胞和胚胎的影響還有待于進(jìn)一步研究，對(duì)sERC卵母細(xì)胞來(lái)源的新生兒的安全性還需要進(jìn)行多中心的長(zhǎng)期隨訪研究。