曹宗富，喻浴飛，陳翠霞，蔡瑞琨，李乾，羅敏娜，高華方，馬旭*

(1.國(guó)家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所，北京 100081；2.國(guó)家人類遺傳資源中心，北京 102206)

醫(yī)學(xué)正邁入精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時(shí)代。近十幾年來(lái)，隨著基因組技術(shù)尤其是高通量DNA測(cè)序的迅猛發(fā)展，為基因組學(xué)的發(fā)展提供了強(qiáng)有力的工具，使人類對(duì)基因組的了解越來(lái)越便利，人類對(duì)疾病基因組的認(rèn)識(shí)也越來(lái)越全面，認(rèn)識(shí)到越來(lái)越多的疾病都有其相應(yīng)的遺傳學(xué)基礎(chǔ)或病因。通過(guò)這些遺傳學(xué)改變能夠?qū)膊∵M(jìn)行診斷、預(yù)測(cè)疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)、藥物應(yīng)答及不良反應(yīng)的發(fā)生[1-3]。人類基因組學(xué)、疾病基因組學(xué)、以及藥物基因組學(xué)的發(fā)展正在引來(lái)醫(yī)學(xué)史的一場(chǎng)巨大變革，帶來(lái)全新的預(yù)防、診斷和治療模式，并過(guò)渡到個(gè)性化醫(yī)療(personalized medicine)或精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)(precision medicine)時(shí)代。個(gè)性化醫(yī)療時(shí)代擁有個(gè)性化的健康管理模式，可根據(jù)不同個(gè)體的遺傳背景，預(yù)測(cè)不同疾病在個(gè)體中的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，從而實(shí)施個(gè)性化的健康管理[4]；通過(guò)產(chǎn)前無(wú)創(chuàng)篩查來(lái)避免大部分染色體異常的胎兒出生，通過(guò)新生兒篩查和產(chǎn)前診斷來(lái)對(duì)嚴(yán)重的遺傳性疾病進(jìn)行干預(yù)，并對(duì)可能攜帶的人群進(jìn)行再生育指導(dǎo)[5]；個(gè)性化診斷則將根據(jù)患者某種疾病相關(guān)基因上的變異而進(jìn)行疾病診斷[6]。

單基因遺傳病是精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的重大方向之一。單基因遺傳病(Monogenic disease)是指由于身體所有細(xì)胞中單個(gè)基因改變而引起的遺傳病，又稱孟德?tīng)栠z傳病(Mendel disease)。它的遺傳方式遵循孟德?tīng)柖?，突變既可?lái)自父母，也可源于自身，都有遺傳給下一代的可能。單基因病種類繁多，據(jù)估計(jì)，有超過(guò)10 000種人類疾病是單基因病引起。根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，在全球出生人口中所有單基因遺傳病的總發(fā)病率高達(dá)1%。單基因遺傳病危害嚴(yán)重，可致畸、致殘甚至致死，嚴(yán)重影響生存時(shí)間和生存質(zhì)量。單基因病精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)首先要實(shí)現(xiàn)疾病的精確診斷，鑒定出先證者攜帶的致病性突變，從而對(duì)單基因病患者進(jìn)行針對(duì)性的治療和干預(yù)，對(duì)單基因病家庭進(jìn)行再生育指導(dǎo)。在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時(shí)代，如果能夠在孕期檢出胎兒是否攜帶引起單基因病的致病基因和突變，則可以進(jìn)行出生缺陷干預(yù)。對(duì)部分單基因病，如先天性白內(nèi)障等，如果在嬰幼兒期通過(guò)基因檢測(cè)早期檢出，則可以進(jìn)行早期治療干預(yù)，最大可能降低致殘致畸程度。精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)是基于遺傳檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展而發(fā)展起來(lái)的，遺傳檢測(cè)在單基因病精確診斷的價(jià)值也越來(lái)越重要，使得基于不同技術(shù)平臺(tái)的遺傳檢測(cè)產(chǎn)品正在被開(kāi)發(fā)并應(yīng)用。

新一代測(cè)序技術(shù)(Next-generation sequencing，NGS)在單基因病致病突變研究和醫(yī)療實(shí)踐中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛[7]。近年來(lái)，大量的研究證實(shí)，全外顯子組測(cè)序是開(kāi)展單基因病相關(guān)研究，對(duì)單基因病患者進(jìn)行致病突變鑒定的理想方法之一。然而，在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)應(yīng)用層面，基于新一代測(cè)序數(shù)據(jù)分析和臨床解讀還存在著很多問(wèn)題，阻礙著基于新一代測(cè)序相關(guān)產(chǎn)品和技術(shù)的推廣，不利于精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展。這些問(wèn)題包括：一是表型復(fù)雜，大部分單基因病表型復(fù)雜，同一種單基因病表型異質(zhì)性強(qiáng)，不同單基因病之間臨床特征相互重疊，給單基因病的診斷帶來(lái)了很大的挑戰(zhàn)，需要借助于遺傳學(xué)輔助診斷；二是遺傳變異的識(shí)別，其分析流程過(guò)于復(fù)雜，難以為醫(yī)療機(jī)構(gòu)人員和其他廣大非生物信息學(xué)人員所掌握使用；三是致病突變的鑒定，需耗費(fèi)大量時(shí)間對(duì)發(fā)現(xiàn)篩選的變異逐個(gè)人工審核和確認(rèn)，效率非常低。為此，我們開(kāi)發(fā)了一套基于云的可視化自動(dòng)化智能化的單基因病遺傳變異分析解讀系統(tǒng)，以滿足單基因病相關(guān)臨床和科研的精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)需求，通過(guò)www.pgenomics.cn提供免費(fèi)共享服務(wù)。

資料與方法

一、單基因病基因變異參考數(shù)據(jù)庫(kù)的建立

基于ClinVar[8]、OrphaNet[9]、UniProt[10]等公共數(shù)據(jù)庫(kù)、PubMed文獻(xiàn)知識(shí)庫(kù)和自有數(shù)據(jù)庫(kù)，參考人類表型標(biāo)準(zhǔn)用語(yǔ)(Human Phenotype Ontology，HPO)[11]和中文人類表型標(biāo)準(zhǔn)用語(yǔ)聯(lián)盟(China HPO，CHPO)的疾病表型用語(yǔ)、HUGO基因命名委員會(huì)(HUGO Gene Nomenclature Committee，HGNC)[12]的基因名稱、人類基因組變異協(xié)會(huì) (Human Genome Variation Society，HGVS)[13]的變異命名規(guī)則，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)整合、數(shù)據(jù)挖掘和文本挖掘技術(shù)，結(jié)合人工編譯審核，整理整合單基因病表型-基因-變異關(guān)系，建立單基因病基因變異參考數(shù)據(jù)庫(kù)。

二、遺傳變異的生物信息學(xué)分析

采用Fastqc軟件對(duì)測(cè)序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量檢查，使用BWA MEM對(duì)原始數(shù)據(jù)與人類參考基因組進(jìn)行比對(duì)，采用picard去除重復(fù)序列，參考GATK(Genome Analysis Toolkit)最佳實(shí)踐對(duì)遺傳變異進(jìn)行分析和識(shí)別[14]，采用VEP(Variant Effect Predictor)對(duì)遺傳變異進(jìn)行注釋[15]，利用Genmod對(duì)變異的遺傳模式進(jìn)行分析。

三、遺傳變異的推薦

根據(jù)單基因病基因變異參考數(shù)據(jù)庫(kù)獲取單基因病相關(guān)的基因，參考ACMG單基因病變異臨床致病性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)遺傳變異進(jìn)行分級(jí)[16]，根據(jù)遺傳變異的變異類型、人群發(fā)生頻率、預(yù)測(cè)的變異功能、臨床顯著性分級(jí)、數(shù)據(jù)庫(kù)證據(jù)等信息對(duì)遺傳變異進(jìn)行綜合評(píng)分，根據(jù)評(píng)分實(shí)現(xiàn)對(duì)單基因病檢測(cè)樣品或家系中致病性變異的推薦。遺傳變異的評(píng)分定義為遺傳變異多種注釋結(jié)果的加權(quán)評(píng)分之和，具體方法為

其中，wi為不同證據(jù)的評(píng)分權(quán)重，si為每個(gè)證據(jù)的評(píng)分。wi默認(rèn)值為1，可根據(jù)情況進(jìn)行調(diào)整。

在突變?cè)u(píng)分基礎(chǔ)上，對(duì)突變所在的基因進(jìn)行累計(jì)評(píng)分。對(duì)每個(gè)基因，以在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行累計(jì)評(píng)分?；蛟u(píng)分Scoreg的方法如下：

Scoreg=max(Scorev)+weSe+wtSt

其中，Scorev為該基因上所有遺傳變異評(píng)分的最大值，作為該基因的基線分值。Se為疾病已知致病基因的評(píng)分，we為該項(xiàng)評(píng)分的權(quán)重。St為該基因突變是否符合單基因病遺傳模式評(píng)分，wt為該項(xiàng)評(píng)分的權(quán)重。we和wt默認(rèn)值為1，可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整。

四、致病變異的再確認(rèn)

致病變異的人工審核和再確認(rèn)包括：一是，通過(guò)基因組瀏覽器查看致病變異兩側(cè)區(qū)域的序列比對(duì)質(zhì)量；二是，對(duì)致病變異在dbSNP[17]、OMIM[18]、MedGen[19]、OrphaNet、1000基因組、gnomAD、PubMed等公共數(shù)據(jù)庫(kù)和自有數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行循證溯源和確認(rèn)；三是，通過(guò)患者病歷與系統(tǒng)自動(dòng)化推薦的疾病典型臨床特征進(jìn)行表型比對(duì)。經(jīng)人工檢查和確認(rèn)后的致病變異位點(diǎn)可生成打印解讀報(bào)告。

結(jié) 果

一、單基因病基因變異參考數(shù)據(jù)庫(kù)

在基因水平，參考HPO對(duì)疾病表型的標(biāo)準(zhǔn)化命名和HGNC對(duì)基因符號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)化名稱，整合ClinVar、OrphaNet、UniProtKB和PubMed來(lái)源的疾病基因關(guān)系信息，共包括5 654種單基因病和26 109個(gè)基因(圖1)。其中，在兩個(gè)及兩個(gè)以上數(shù)據(jù)庫(kù)中出現(xiàn)的基因共9 601個(gè)，占總基因數(shù)目的34.70%。

在變異水平，參考HGVS命名規(guī)則，整合了來(lái)自ClinVar、UniProtKB和PubMed來(lái)源的變異共648 814個(gè)(圖2)。其中，在兩個(gè)及兩個(gè)以上數(shù)據(jù)庫(kù)中出現(xiàn)的變異共67 797個(gè)，僅占變異總數(shù)目的10.45%。

圖1 參考數(shù)據(jù)庫(kù)整合的26 109個(gè)基因在各個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的分布

圖2 參考數(shù)據(jù)庫(kù)整合的682 349個(gè)遺傳變異在各個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的分布

二、基于NGS數(shù)據(jù)的自動(dòng)化分析和解讀

我們基于云開(kāi)發(fā)了可視化自動(dòng)化智能化的單基因病遺傳變異分析解讀系統(tǒng)，通過(guò)www.pgenomics.cn提供免費(fèi)共享服務(wù)，用戶注冊(cè)申請(qǐng)后即可登錄使用。

用戶根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇對(duì)應(yīng)的NGS分析流程進(jìn)行分析?？晒┻x擇的NGS分析流程包括：?jiǎn)螛颖就怙@子組測(cè)序胚系突變分析、基于家系設(shè)計(jì)的外顯子組測(cè)序胚系突變分析、單樣本全基因組測(cè)序胚系突變分析、基于家系設(shè)計(jì)的全基因組測(cè)序胚系突變分析。然后導(dǎo)入對(duì)應(yīng)的測(cè)序原始數(shù)據(jù)(fastq文件)，提交分析后即可等待分析結(jié)果。待分析完成后，即可查看單基因病測(cè)序分析報(bào)告，該單基因病家系或患者可能的致病基因和變異將被推薦出來(lái)(圖3)。示例為一個(gè)常染色體隱性遺傳的Joubert綜合征患者的高通量測(cè)序分析結(jié)果，根據(jù)基因評(píng)分和變異評(píng)分，自動(dòng)推薦出CSPP1基因上的兩個(gè)不同位置的復(fù)合雜合突變，c.1132C>T(p.Arg378Ter)和c.2244_2245del(p.Glu750GlyfsTer30)。

對(duì)于推薦的致病變異位點(diǎn)，可進(jìn)一步使用在線基因組瀏覽器對(duì)致病變異的質(zhì)量進(jìn)行可視化評(píng)估，包括致病變異位點(diǎn)兩側(cè)的參考基因組序列復(fù)雜度、測(cè)序序列比對(duì)質(zhì)量、測(cè)序覆蓋度、等位基因頻率、變異在測(cè)序序列的位置分布等(圖4)。

圖3 單基因病測(cè)序分析致病基因和變異的自動(dòng)化推薦

圖4 通過(guò)基因組瀏覽器查看致病變異質(zhì)量

對(duì)推薦的致病變異，還可以以在線形式進(jìn)行變異的循證溯源(圖5)。不同數(shù)據(jù)源提供的證據(jù)包括：(1)變異所在基因在OMIM、MedGen、OrphaNet數(shù)據(jù)庫(kù)中的單基因病名稱、臨床特征描述；(2)變異在1000基因組、gnomAD、dbSNP中的頻率，尤其是在東亞人群中的頻率；(3)變異在PubMed中的報(bào)道。對(duì)以上兩個(gè)位點(diǎn)，在東亞人群中的頻率分布為0.000 24和0.000 38，屬于罕見(jiàn)變異位點(diǎn)。其中CSPP1：c.1132C>T在PubMed已經(jīng)報(bào)道[20]，該突變引入終止密碼子，造成CSPP1蛋白的提前終止，為致病性位點(diǎn)；而CSPP1：c.2244_2245del尚無(wú)報(bào)道。

同時(shí)，原始數(shù)據(jù)文件的質(zhì)量評(píng)估報(bào)告、序列比對(duì)報(bào)告、致病突變列表都自動(dòng)生成，可逐個(gè)查看并下載。突變列表共有三個(gè)供下載，分別是：(1)最可能致病的突變；(2)疾病相關(guān)致病基因上的所有變異，包括質(zhì)量不合格的變異位點(diǎn)；(3)全基因組水平的所有變異位點(diǎn)，包括質(zhì)量不合格的變異位點(diǎn)。最后，用戶可以預(yù)覽報(bào)告，通過(guò)患者病歷與系統(tǒng)自動(dòng)化推薦的疾病典型臨床特征進(jìn)行表型比對(duì)。在確認(rèn)致病變異后，用戶可以在線打印檢測(cè)報(bào)告。

圖5 變異位點(diǎn)的循證溯源

討 論

該研究采用信息學(xué)技術(shù)，提供了一種自動(dòng)化的單基因病遺傳變異分析解讀系統(tǒng)，能夠?qū)π乱淮鷾y(cè)序的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，識(shí)別檢測(cè)樣品中遺傳變異，并根據(jù)變異的類型、功能預(yù)測(cè)結(jié)果、人群頻率、人群致病性證據(jù)、是否符合遺傳傳遞模式等對(duì)變異進(jìn)行綜合評(píng)分和致病性分級(jí)，最終鑒定和報(bào)告檢測(cè)個(gè)體中的致病突變。我們研究并開(kāi)發(fā)的系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)從新一代測(cè)序原始數(shù)據(jù)到致病變異報(bào)告的全程自動(dòng)化，并可通過(guò)基因組瀏覽器在線查看致病變異的測(cè)序質(zhì)量，可通過(guò)PubMed ID實(shí)現(xiàn)對(duì)變異相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的查證，或?qū)?lái)源于數(shù)據(jù)庫(kù)的證據(jù)進(jìn)行溯源，極大降低了遺傳變異人工解讀的工作量，大大提高了單基因病新一代測(cè)序中遺傳變異分析和臨床解讀的效率。

該研究獲得的整合數(shù)據(jù)庫(kù)為單基因病遺傳變異分析及解讀提供了參考數(shù)據(jù)，其來(lái)源包括ClinVar、OrphaNet、UniProtKB和PubMed。這四個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的變異各有不同，互為補(bǔ)充。ClinVar是一個(gè)描述人類遺傳變異和表型關(guān)系的整合型綜合性數(shù)據(jù)庫(kù)，是一個(gè)由用戶驅(qū)動(dòng)的開(kāi)放型數(shù)據(jù)庫(kù)，允許多個(gè)用戶提交數(shù)據(jù)，相同的變異-表型關(guān)系可得到相互驗(yàn)證。這也使得ClinVar能夠收錄沒(méi)有報(bào)道過(guò)的變異。OrphaNet是專注于罕見(jiàn)病和孤兒藥的參考性數(shù)據(jù)庫(kù)，其目標(biāo)旨在幫助罕見(jiàn)病患者來(lái)改善診斷、照護(hù)和治療。OrphaNet僅對(duì)基因水平的數(shù)據(jù)進(jìn)行公開(kāi)，而變異水平的數(shù)據(jù)不能免費(fèi)獲取。UniProtKB關(guān)注于導(dǎo)致氨基酸改變的變異，其數(shù)據(jù)來(lái)源主要是Swiss-Prot、 TrEMBL 和 PIR-PSD 三大數(shù)據(jù)庫(kù)，與其它數(shù)據(jù)庫(kù)的來(lái)源不同，可作為ClinVar、OrphaNet等的補(bǔ)充。PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的大多是首次發(fā)現(xiàn)的遺傳性疾病相關(guān)的基因和變異，并沒(méi)有全部被其他公共數(shù)據(jù)庫(kù)收錄。我們沒(méi)有整合OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)，主要是由于需要每個(gè)月獲取序列號(hào)，而且限制使用；另一方面，OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)也會(huì)定期向ClinVar提交數(shù)據(jù)。

單基因病遺傳變異分析解讀系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)單基因遺傳病患者和受累家系致病基因突變的鑒定，輔助單基因病領(lǐng)域相關(guān)的臨床醫(yī)生進(jìn)行遺傳學(xué)病因診斷，加快單基因病相關(guān)科研人員的研究發(fā)現(xiàn)，為單基因病患者的治療、康復(fù)和預(yù)后提供參考，以及單基因病家庭的再生育指導(dǎo)提供幫助。該系統(tǒng)通過(guò)國(guó)家人類遺傳資源共享服務(wù)平臺(tái)，可為我國(guó)單基因病領(lǐng)域臨床醫(yī)生和科研人員提供免費(fèi)共享服務(wù)。目前，該系統(tǒng)正在面向我國(guó)17個(gè)省、直轄市或自治區(qū)的45家臨床醫(yī)療機(jī)構(gòu)和科研院所，為單基因病領(lǐng)域的臨床醫(yī)生和研究人員提供單基因病智能化遺傳咨詢共享服務(wù)[21-22]。