楊 光,魯衛(wèi)華,曹迎亞,祁羽鵬

(皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科,安徽 蕪湖 241001)

膿毒癥相關(guān)性腦病(sepsis associated encephalopathy，SAE)是由膿毒癥或全身炎癥反應(yīng)綜合征所導(dǎo)致的彌漫性腦功能障礙，一般缺乏中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的臨床或?qū)嶒?yàn)室證據(jù)，同時(shí)需要排除肝性腦病、腎性腦病和肺性腦病等代謝性腦?。煌ǔＲ宰d妄、認(rèn)知及行為功能障礙等為表現(xiàn)，SAE是 ICU常見的神經(jīng)功能障礙性疾病。SAE發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明，目前認(rèn)為血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)損傷、氨基酸的改變和神經(jīng)遞質(zhì)的改變、線粒體功能障礙和神經(jīng)細(xì)胞凋亡等可能與SAE發(fā)病有關(guān)[1]?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一種鋅依賴的蛋白水解酶，MMPs受多層次調(diào)控，以酶原形式存在，激活過程中受絲氨酸蛋白酶或纖維蛋白酶的介導(dǎo)，也可自主催化激活。生理狀態(tài)下MMPs參與組織發(fā)育、轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、傷口愈合、酶原的激活及血管生成等；病理情況下MMPs 作為腦組織重要的蛋白水解酶，可降解緊密連接蛋白和血管基底膜，導(dǎo)致血腦屏障結(jié)構(gòu)破壞，增加血腦屏障通透性。在腦創(chuàng)傷、腦缺血和腦出血?jiǎng)游锬Ｐ蜕习l(fā)現(xiàn)MMPs表達(dá)升高和緊密連接蛋白降低，但關(guān)于膿毒癥大鼠MMPs的研究報(bào)道甚少[2-3]。本研究通過盲腸結(jié)扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP)制作膿毒癥大鼠模型，探討MMP-9在膿毒癥大鼠皮質(zhì)區(qū)域血腦屏障通透性改變的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 TNF-α ELISA試劑盒(批號(hào)：02/2018)購(gòu)于上海酶聯(lián)生物公司，MMP-9、Occludin和β-actin 抗體(批號(hào)：10375-2,13409-1,10904-1)均購(gòu)于武漢三鷹生物技術(shù)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 SPF級(jí)健康雄性SD大鼠72只，體質(zhì)量200～260 g(南京市青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng))。按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為4組：對(duì)照組(C)、CLP 24 h 模型組(CLP24 h)、CLP 48 h模型組(CLP48 h)、CLP 72 h模型組(CLP72 h)，每組18只。每組隨機(jī)取6只用于檢測(cè)血腦屏障通透性，6只用于ELISA和Western blot檢測(cè)，6只用于免疫組化檢測(cè)。

1.3 模型制備 本研究通過CLP制作膿毒癥大鼠模型，各組大鼠術(shù)前禁食12 h，用10%水合氯醛，按0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉。腹中線做長(zhǎng)約1.5 cm切口，暴露盲腸后，在盲腸末端1/3處結(jié)扎，使用22號(hào)針頭貫穿末端盲腸兩次，并輕輕擠壓少許腸內(nèi)容物，后逐層縫合關(guān)閉腹腔，術(shù)后大鼠予以皮下注射30 mL/kg生理鹽水并自由進(jìn)水進(jìn)食，空白對(duì)照組不進(jìn)行任何處理。

1.4 炎癥因子測(cè)定 C組大鼠腹主動(dòng)脈取血后處死大鼠，CLP 24 h組、48 h組和72 h組分別在CLP術(shù)后24 h、48 h和72 h腹主動(dòng)脈取血后處死大鼠，分離血清后據(jù)ELISA檢測(cè)試劑盒說明書，測(cè)定血清TNF-α含量。

1.5 免疫組化檢測(cè) 各組大鼠腹主動(dòng)脈取血后迅速斷頭取腦，切除小腦，4%多聚甲醛固定液4℃固定2 d，石蠟包埋，蠟塊做連續(xù)切片，貼片于防脫載玻片上，烤片5 h后，將組織切片脫蠟，用中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察MMP-9在皮質(zhì)區(qū)域的表達(dá)。

1.6 Western blot 檢測(cè) 各組大鼠腹主動(dòng)脈取血后迅速斷頭取腦，切除小腦，冰上分離皮質(zhì)海馬。無(wú)菌小剪刀將皮質(zhì)剪碎，加入適量RIPA裂解液，冰上裂解30 min后,4℃ 12 000 r/min 離心 30 min，取上清，采用 BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行蛋白濃度的測(cè)定。然后進(jìn)行 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h,一抗孵育4℃過夜，洗膜，室溫下與相應(yīng)二抗孵育1 h，加入ECL顯影劑曝光。使用Image J軟件對(duì)曝光條帶進(jìn)行灰度值分析。

1.7 BBB通透性的測(cè)定 伊文思藍(lán)(Evans blue，EB)滲透法分析 BBB 通透性變化[4]，大鼠處死1.5 h前，2% EB按3 mL/kg股靜脈注射，1.5 h后打開胸腔,心內(nèi)灌注生理鹽水至右心耳流出無(wú)色液體時(shí)停止，立即斷頭取腦,每100 mg腦皮質(zhì)加入1 mL甲酰胺溶液,60℃避光水浴24 h,離心后取上清在酶標(biāo)儀上(620 nm)進(jìn)行比色,同時(shí)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清TNF-α含量及血腦屏障通透性變化的比較 膿毒癥可導(dǎo)致炎癥因子增高和血腦屏障通透性增加，與C組比較，TNF-α、血腦屏障通透性在造模后24 h升高(P<0.05)，72 h達(dá)到最高。見表1。

組別TNF-α/(ng/L)EB/(μg/g)C151.18±12.630.41±0.10CLP24 h173.56±7.71a0.63±0.08aCLP48 h204.88±22.08ab1.77±0.39abCLP72 h221.79±10.87ab2.33±0.65abF29.01534.137P0.0000.000

注：與C組比較，aP<0.05;與CLP24 h組比較，bP<0.05。

2.2 各組大鼠腦皮質(zhì)MMP-9表達(dá)變化 免疫組化染色結(jié)果顯示，膿毒癥可引起MMP-9陽(yáng)性染色增強(qiáng)，但在造模后24、48 h無(wú)明顯增強(qiáng)，造模后72 h增強(qiáng)明顯。如圖1所示。

圖1 各組大鼠腦皮質(zhì)MMP-9表達(dá)(×100)

2.3 各組大鼠腦皮質(zhì)Occludin表達(dá)變化 結(jié)果顯示(如圖2)，與C組比較，Occludin在造模后24 h、48 h表達(dá)降低不明顯，但在72 h表達(dá)下降(P<0.05)。如表2所示。

圖2 Western blot檢測(cè)Occludin表達(dá)

組別 Occludin/β-actinC1.33±0.09CLP24 h 1.17±0.03CLP48 h 1.13±0.11CLP72 h0.93 ±0.04aF14.308P0.001

注：與C組比較，aP<0.05。

3 討論

SAE發(fā)病機(jī)制尚未明確，BBB受損可能是SAE發(fā)病的重要機(jī)制之一[5]，BBB是由腦內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞通過各種連接蛋白彼此緊密相連，并與周細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞相互作用形成的特殊屏障系統(tǒng)，BBB 嚴(yán)格限制血液中的神經(jīng)毒性物質(zhì)、炎癥因子、免疫細(xì)胞等進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，進(jìn)而維持大腦微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，保證神經(jīng)系統(tǒng)功能的正常發(fā)揮[3]。

Michels等[4]研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥大鼠海馬區(qū)域BBB通透性增加，并且膿毒癥大鼠出現(xiàn)認(rèn)知功能改變。由于血腦屏障的通透性增加，各類炎癥因子、細(xì)胞因子和假性神經(jīng)遞質(zhì)可較易進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)，進(jìn)而影響腦組織的循環(huán)灌注，物質(zhì)代謝，信號(hào)傳遞等過程，從而加重SAE[6-7]。

膿毒癥不同時(shí)期BBB破壞的機(jī)制尚未明確，本研究通過膿毒癥大鼠模型發(fā)現(xiàn)膿毒癥大鼠腦皮質(zhì)區(qū)MMP-9表達(dá)增加，與空白對(duì)照組比較，MMP-9在造模后24 h、48 h表達(dá)增加不明顯，但在72 h表達(dá)明顯增高。同時(shí)在造模后72 h緊密連接蛋白Occludin表達(dá)降低最為明顯，BBB通透性最高，從而提示MMP-9可能與膿毒癥晚期皮質(zhì)區(qū)域BBB通透性改變有關(guān)。

Higashida T等[8]發(fā)現(xiàn)腦創(chuàng)傷大鼠模型建立24 h后即出現(xiàn)MMP-9表達(dá)增加，緊密連接蛋白Occludin及ZO-1表達(dá)降低，血腦屏障破壞及腦組織水腫，使用米諾環(huán)素治療腦創(chuàng)傷大鼠后，MMP-9表達(dá)降低，同時(shí)緊密連接蛋白Occludin及ZO-1表達(dá)增高，血腦屏障破壞及腦組織水腫減輕，從而提示MMP-9可能與早期腦創(chuàng)傷大鼠血腦屏障的破壞有關(guān)。本研究中膿毒癥大鼠造模24 h、48 h后MMP-9表達(dá)增加不明顯，但在72 h表達(dá)明顯增高，同時(shí)BBB破壞最嚴(yán)重?？赡苁怯捎赟AE繼發(fā)于膿毒癥或全身炎癥反應(yīng)綜合征，待炎癥反應(yīng)達(dá)到一定程度后引起MMP-9表達(dá)明顯增高。

本研究中隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，血清中TNF-α含量逐漸增高，與空白對(duì)照組比較，在造模后24 h差異即具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同時(shí)隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，膿毒癥大鼠少動(dòng)、動(dòng)作遲緩及團(tuán)縮等表現(xiàn)逐漸明顯。TNF-α被認(rèn)為是膿毒癥時(shí)最重要的炎癥介質(zhì)，TNF-α可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)腦組織、中性粒細(xì)胞凋亡和腦水腫的發(fā)生，同時(shí)也影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)介質(zhì)多巴胺、去甲腎上腺素及血清素的神經(jīng)傳遞功能，引起認(rèn)知功能減退[9]。此外，Tsuge M等[10]發(fā)現(xiàn)增加血清中TNF-α含量能夠激活腦組織中MMP-9，進(jìn)而增加BBB通透性。

綜上所述，膿毒癥時(shí)MMP-9表達(dá)增多，緊密連接蛋白減少，可能是SAE的發(fā)病機(jī)制之一，不同時(shí)期BBB通透性破壞的機(jī)制目前尚不十分清楚，有待進(jìn)一步的研究。