李光建，張雙雙，李 巖，梁 坤，林浩然，汪萌芽

(皖南醫(yī)學(xué)院 1.細(xì)胞電生理研究室；2.啟明星小組，安徽 蕪湖 241002)

帕金森病(Parkinson disease，PD)是一種常見(jiàn)的中老年中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1-3]，臨床表現(xiàn)除運(yùn)動(dòng)遲緩、靜止性震顫、姿勢(shì)平衡障礙、肌強(qiáng)直等運(yùn)動(dòng)癥狀外[3-4]，還有認(rèn)知功能障礙、精神障礙、睡眠障礙、自主神經(jīng)功能障礙、疼痛等非運(yùn)動(dòng)癥狀[4-5]。在眾多的非運(yùn)動(dòng)癥狀中，疼痛[6]作為一種高發(fā)生率，低就診率的癥狀，臨床表現(xiàn)形式多樣，按患病率由高到低依次為肌肉骨骼性疼痛、肌張力障礙性疼痛等[6-7]。其發(fā)病機(jī)制考慮與PD相關(guān)病變侵犯痛覺(jué)傳導(dǎo)通道有關(guān)，PD 相關(guān)性疼痛一直未受到足夠的重視,目前尚無(wú)規(guī)范的治療方案，以臨床經(jīng)驗(yàn)用藥為主。PD患者存在正中神經(jīng)感覺(jué)受損及痛覺(jué)耐受閾值下降[8-9]。PD 疼痛的發(fā)生是否與疼痛閾值降低有關(guān)，目前還在爭(zhēng)論中[10]。時(shí)反應(yīng)量-效關(guān)系(timed dose-response relationship，TDRR) 概念的提出及其相關(guān)數(shù)學(xué)模型的設(shè)計(jì)，原旨在用于藥物的藥理或毒理作用分析[11-13]。在對(duì)時(shí)反應(yīng)量-效關(guān)系的概念、特點(diǎn)、數(shù)學(xué)模型方面進(jìn)行探討后，我們實(shí)驗(yàn)室先后進(jìn)行過(guò)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試的時(shí)反應(yīng)量-效關(guān)系[14-15]和大鼠痛覺(jué)時(shí)反應(yīng)量-效關(guān)系[16]的探究。在此基礎(chǔ)上，本研究旨在觀察PD模型大鼠的痛覺(jué)特征，并探討和分析帕金森病模型大鼠的痛覺(jué)敏化與痛覺(jué)時(shí)反應(yīng)量-效關(guān)系，以期為帕金森病的痛覺(jué)發(fā)生與疼痛閾值的關(guān)系等方面提供新的研究思路和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)別(250±10)g成年雄性SD大鼠55只，由南京青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供，許可證號(hào)SCXK(蘇)2017-0001。

1.2 儀器和藥品 腦立體定位儀(瑞沃德，68000系列)、光輻射熱測(cè)痛儀(ZH-YLS-12A，安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)、Von Frey纖維絲刺激針(Von Frey hairs測(cè)痛儀，North Coast Medical,Inc.,CA,USA)、微量注射泵(ALC-LP660，上海奧爾科特生物科技有限公司)、6-hydroxydopamine(美國(guó) Sigma 公司，批號(hào)：MKCB5847)、鹽酸阿撲嗎啡(美國(guó) Sigma 公司，批號(hào)：SLBP2431V)、20% 烏拉坦(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20161208)、青霉素鈉(華北制藥股份有限公司，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20144727)、3% 過(guò)氧化氫(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20160120)、其他常規(guī)哺乳動(dòng)物手術(shù)器械等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組 取55只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常組(n=13)、假手術(shù)組(n=8)和模型組(n=34)。

1.3.2 PD大鼠模型制備 采用單側(cè)紋狀體兩點(diǎn)法雙靶點(diǎn)注射神經(jīng)毒素6-羥多巴胺(6-OHDA) 制備PD大鼠模型[17]。34只SD大鼠用 20%烏拉坦麻醉( 1.5 g/kg，ip)，直至夾捏刺激無(wú)明顯反應(yīng)。麻醉穩(wěn)定后，將大鼠俯臥位固定于腦立體定位儀上，參照 Paxinos G 等大鼠腦立體定位圖譜[18]，確定右側(cè)紋狀體兩點(diǎn)坐標(biāo)，第1點(diǎn)(尾殼核內(nèi)):前囟前0.72 mm，中線右側(cè)2.6 mm，硬膜下5.0和6.0 mm；第2點(diǎn)(蒼白球內(nèi)):前囟后0.36 mm，中線右側(cè)3.6 mm，硬膜下5.0和6.0 mm。以前囟為坐標(biāo)原點(diǎn)，確定好顱骨表面尾殼核注藥點(diǎn)坐標(biāo)，用顱骨鉆鉆一直徑為2 mm小孔，將一次性吸入5 μL 終濃度為 2.5 g/L 的 6-OHDA 溶液的微量注射器連接于立體定位儀上，垂直入顱，緩慢進(jìn)針，在硬膜下6 mm處注入 2.5 μL 6-OHDA溶液，注藥速度為 1 μL/ min，留針 5 min 后緩慢退針至硬膜下5 mm 處，注入剩余的(2.5 μL)6-OHDA 溶液，留針5 min 后以1 mm/min 的速度緩慢退針。蒼白球注藥點(diǎn)的注藥方式同上。注射完成后進(jìn)行縫合，在縫合處墊上明膠海綿并在術(shù)后連續(xù)3 d給予20萬(wàn)U青霉素(腹腔注射)，預(yù)防感染。模型組大鼠在術(shù)后意外死亡2只，納入模型鑒定的大鼠數(shù)為32只。假手術(shù)組用生理鹽水代替 6-OHDA 溶液，其余步驟與實(shí)驗(yàn)組相同，因在術(shù)后意外死亡2只，納入統(tǒng)計(jì)的假手術(shù)組大鼠數(shù)為6只。

1.3.3 帕金森病大鼠模型鑒定 所有受試大鼠分別于造模第2、4 周后腹腔注射阿樸嗎啡(0.25 mg/kg) 檢測(cè)行為學(xué)變化[17]。注射后 3～5 min 觀察大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)，如出現(xiàn)肢體僵直，并以健側(cè)(左側(cè))后肢為支點(diǎn)，向健側(cè)旋轉(zhuǎn)，且旋轉(zhuǎn)圈數(shù)≥210 圈/30 min 的大鼠鑒定為成功模型。

1.3.4 痛覺(jué)檢測(cè)

1.3.4.1 機(jī)械痛閾值檢測(cè) 帕金森病模型檢驗(yàn)成功后，將3組大鼠放置在纖維絲透明紗網(wǎng)的測(cè)量裝置上進(jìn)行連續(xù)3 d，每天30 min的適應(yīng)性訓(xùn)練，適應(yīng)結(jié)束后用Von Frey纖維絲刺激針(Von Frey hairs測(cè)痛儀)[19]在質(zhì)量分別為2、4、6、8、10、15和20 g進(jìn)行大鼠的機(jī)械刺激縮足反應(yīng)閾值(paw withdrawal mechanical threshold，PWMT)檢測(cè)。

1.3.4.2 光輻射熱痛甩尾潛伏期檢測(cè) 機(jī)械痛閾值檢測(cè)完成后，用光輻射熱測(cè)痛儀，對(duì)3組大鼠進(jìn)行不同光照強(qiáng)度下甩尾反應(yīng)潛伏期(tail-flick latency，TFL)的移位法測(cè)定[16]，即首次在距鼠尾根部1 cm處,隨后每隔0.5 cm依次后移光照位點(diǎn)，進(jìn)行5個(gè)光照強(qiáng)度的檢測(cè)，設(shè)定光輻射熱測(cè)痛儀的光照強(qiáng)度(Focus值)為15、23、34、51、76，隨后依次測(cè)定各組大鼠在不同光強(qiáng)下的TFL，即為甩尾反應(yīng)的TDRR數(shù)據(jù)。室溫控制在(25±1)℃。

2 結(jié)果

2.1 造模后第2周和第4周的模型鑒定 采用χ2檢驗(yàn)的方法，對(duì)第2周和第4周帕金森病模型的鑒定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，在納入模型檢測(cè)的模型組大鼠32只中，第2周成功模型為20只，第4周成功模型為27只，造模成功率顯示第4周的成功率高于第2周，最終造模成功率為84%(χ2=3.925,P=0.048)。

2.2 PWMT 對(duì)3組大鼠進(jìn)行了機(jī)械痛檢測(cè)，結(jié)果如圖1顯示，模型組(n=27)較另兩組大鼠的PWMT降低(P<0.01)，且假手術(shù)組(n=6)與正常組(n=13)大鼠相似(P>0.05)。

正常組(Normal)：n=13，模型組(Model)：n=27，假手術(shù)組(Sham operation)：n=6，單因素方差分析：P<0.01，Newman-Keuls兩兩對(duì)比檢驗(yàn)：*P<0.01。

圖1 3組大鼠的機(jī)械刺激縮足反應(yīng)閾值(PWMT)比較

2.3 光輻射熱TFL 按照傳統(tǒng)痛覺(jué)的分析方法，將3組大鼠TFL分別在34、51、76光強(qiáng)度(單位為Focus值)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果3組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表1)，且在光照強(qiáng)度在34、51、76時(shí)模型組大鼠的TFL較另兩組均縮短(P<0.01)，而另兩組間均相似(P>0.05)。

分組n光照強(qiáng)度(Focus值)345176正常組1313.50±1.223.38±0.632.20±0.65模型組279.52± 2.14*#2.28±0.36*#1.36±0.20*#假手術(shù)組614.41±0.59 3.01±0.161.88±0.04F32.01622.03526.618P0.0000.0000.000

q檢驗(yàn)，與正常組比：*P<0.01，與假手術(shù)組比：#P<0.01。

2.4 光輻射熱痛覺(jué)TDRR 對(duì)光輻射熱TFL的TDRR數(shù)據(jù)(圖2)，用重復(fù)測(cè)量的雙因素方差分析，顯示因素光強(qiáng)度(F=9.537,P<0.01)、光強(qiáng)度×組間(F=54.891,P<0.01)及組間(F=39.839,P<0.01)的變異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不僅提示帕金森病模型大鼠光輻射熱TFL存在TDRR關(guān)系，還表明其在不同組間不同，其組間兩兩比較顯示模型組TFL的TDRR較另兩組明顯左移(P<0.01)，而假手術(shù)組與正常組相似(P>0.05) 。

進(jìn)一步對(duì)3組大鼠的光強(qiáng)度-TFL關(guān)系數(shù)據(jù)分別用雙曲線型TDRR模型[15-16]Y=cs+1/(x-a)s+b進(jìn)行曲線擬合，其中模型組大鼠的TDRR曲線較正常組和假手術(shù)組左移，正常組和假手術(shù)組相似，各組主要擬合參數(shù)結(jié)果見(jiàn)表2，其中模型組參數(shù)主要顯示參數(shù)a較另兩組減小的變化。

圖2 3組大鼠的光輻射熱痛覺(jué)TDRR

采用雙曲線型TDRR模型Y=cs+1/(x-a)s+b進(jìn)行非線性擬合，單獨(dú)標(biāo)出的點(diǎn)為3組大鼠在Focus值23時(shí)的TFL值，均為最大值15 s。，正常組(Normal)：n=13，模型組(Model)：n=27，假手術(shù)組(Sham operation)：n=6。雙因素方差分析(重復(fù)測(cè)量)：因素光強(qiáng)度F=9.537,P<0.01；光強(qiáng)度×組間F=54.891,P<0.01；組間F=39.839,P<0.01。在此之后兩兩對(duì)比檢驗(yàn)：#P<0.01(模型組與另外兩組對(duì)比)。

表2 3組大鼠光輻射熱痛覺(jué)TDRR的雙曲線模型擬合參數(shù)

組別cs abR2正常組26.074.8743.152.0330.9730模型組41.297.303-17.471.2610.8971假手術(shù)組7.541.35729.001.2540.9955

3 討論

PD為繼阿爾茨海默病后第2個(gè)常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病，這種疾病的特點(diǎn)是黑質(zhì)致密部的多巴胺能神經(jīng)元損毀50%～70%，即紋狀體DA嚴(yán)重缺失[20]。近年來(lái)PD動(dòng)物模型的研究較多，造模的方法多種多樣，目前神經(jīng)毒性分子在神經(jīng)生物學(xué)中被廣泛用于損毀黑質(zhì)紋狀體DA系統(tǒng)，作為PD模型復(fù)制最常用的一種工具[21]。本研究采用了單側(cè)紋狀體兩點(diǎn)法雙靶點(diǎn)注射神經(jīng)毒素6-羥多巴胺(6-OHDA)的方法制備PD大鼠模型[19]，與其他腦區(qū)相比，注射紋狀體區(qū)的造模成功率更高[22]，本次實(shí)驗(yàn)觀察到的結(jié)果也得到了驗(yàn)證，并為進(jìn)一步的痛覺(jué)及其TDRR分析奠定了基礎(chǔ)。

本次實(shí)驗(yàn)在造模成功之后，進(jìn)行了機(jī)械痛閾值檢測(cè)和光輻射熱痛甩尾潛伏期檢測(cè)兩種痛覺(jué)的檢測(cè)方法，結(jié)果顯示機(jī)械痛閾值檢測(cè)中與正常組和假手術(shù)組相比，模型組的機(jī)械痛閾值較小，顯示帕金森病模型大鼠的機(jī)械痛覺(jué)出現(xiàn)了敏化；對(duì)光輻射熱痛甩尾潛伏期數(shù)據(jù)進(jìn)行常規(guī)的單因素方差分析，將3組分別在34、51、76強(qiáng)度進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果顯示光照強(qiáng)度在34、51、76時(shí)模型組大鼠的TFL均較另兩組縮短，顯示在各個(gè)強(qiáng)度上PD模型大鼠的痛覺(jué)都出現(xiàn)了敏化，這與機(jī)械痛檢測(cè)的結(jié)果一致。進(jìn)一步對(duì)光輻射熱痛實(shí)驗(yàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)的TDRR進(jìn)行重復(fù)測(cè)量的雙因素方差分析，結(jié)果表明了隨著光照強(qiáng)度的增加各組大鼠甩尾潛伏期逐漸縮短，在光強(qiáng)度和組間因素間存在交互影響，而且TDRR關(guān)系在3組之間存在差異。經(jīng)過(guò)雙曲線型TDRR模型Y=cs+1/(x-a)s+b的非線性擬合，結(jié)果呈現(xiàn)出隨光照強(qiáng)度增加甩尾反應(yīng)潛伏期逐漸縮短的負(fù)相關(guān) TDRR關(guān)系曲線[11-13](光照強(qiáng)度增加時(shí)潛伏期不是無(wú)限縮短)，這與藥物劑量與其藥物作用潛伏期的關(guān)系相類(lèi)似，理論上該TDRR屬于T型雙曲線關(guān)系，但是該潛伏期有上限性數(shù)據(jù)，即有一個(gè)固定的最長(zhǎng)潛伏期 15 s，應(yīng)歸于T型雙曲線關(guān)系的特殊形式 P型雙曲線關(guān)系[11-12]，假手術(shù)和正常組同模型組一樣有TDRR的存在，在對(duì)3組進(jìn)行雙曲線型TDRR模型Y=cs+1/(x-a)s+b非線性擬合得到的作圖結(jié)果更清楚地顯示模型組左移的特點(diǎn)。由此可見(jiàn)，機(jī)械痛閾值檢測(cè)和光輻射熱痛甩尾潛伏期檢測(cè)結(jié)果都顯示PD模型大鼠的痛覺(jué)敏化，而光輻射熱痛覺(jué)TDRR的分析則進(jìn)一步表明，PD模型大鼠同樣存在痛覺(jué)TDRR，但出現(xiàn)痛覺(jué)TDRR曲線的左移，更全面地顯示了PD模型大鼠的痛覺(jué)敏化特征。

臨床研究表明，PD患者存在正中神經(jīng)感覺(jué)受損的癥狀，因此就會(huì)導(dǎo)致疼痛耐受閾值下降[8]，但PD疼痛的發(fā)生與疼痛閾值降低的相關(guān)性還缺乏充分的依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用了類(lèi)似于藥理學(xué)的TDRR,通過(guò)恒定空間效應(yīng)觀察光照強(qiáng)度與時(shí)間效應(yīng)的關(guān)系[12]。本實(shí)驗(yàn)是通過(guò)這種時(shí)反應(yīng)量-效關(guān)系觀察和分析了PD模型大鼠、正常組大鼠的TDRR特點(diǎn)，結(jié)果顯示PD模型大鼠的TDRR曲線較正常組大鼠左移的情況，這證明了PD模型大鼠存在痛覺(jué)敏化的特點(diǎn)，表明了PD 疼痛的發(fā)生可能與閾值降低有關(guān)，給目前爭(zhēng)論的PD 疼痛的發(fā)生是否與疼痛閾值降低有關(guān)[10]提供了參考，也為臨床治療和預(yù)防PD的疼痛癥狀提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，對(duì)PD非運(yùn)動(dòng)性癥狀的相關(guān)研究也提供了新思路。至于PD模型大鼠痛覺(jué)敏化的機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究來(lái)闡明。