朱作藝 ，張玉 ，王君虹 ，李雪 ，王偉 ，2，3*，孫彬

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江杭州310021；2.農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全國家重點(diǎn)實驗室省部共建培育基地，浙江杭州310021；3.農(nóng)業(yè)部創(chuàng)意農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實驗室，浙江杭州310021；4.武義中正食品檢測有限公司，浙江金華321200）

0 引 言

近年來,植物生長調(diào)節(jié)劑廣泛用于棉花、小麥、水果、蔬菜等農(nóng)作物,在增強(qiáng)作物抗逆性、提高作物產(chǎn)量、改善產(chǎn)品品質(zhì)、提高種植效益等方面發(fā)揮了巨大作用[1-2]。氯化膽堿和甲哌鎓作為常見的植物生長調(diào)節(jié)劑,可單獨(dú)或作為混合劑應(yīng)用于作物[3]。氯化膽堿和甲哌鎓均為季銨類化合物(見圖1),在水和酸性溶液中具有良好的穩(wěn)定性和溶解性[4],廣泛用于改善作物品質(zhì)和提高作物產(chǎn)量。

圖1 3種目標(biāo)分析物結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of three target analytes

標(biāo)明農(nóng)藥劑型中活性成分的質(zhì)量濃度對于消費(fèi)者購買和使用該產(chǎn)品具有重要意義[5]。除此之外,監(jiān)測農(nóng)藥劑型中雜質(zhì)的含量同樣重要。N-甲基哌啶是合成甲哌鎓的重要中間體,與甲哌鎓具有相似的結(jié)構(gòu)(見圖1)。N-甲基哌啶普遍存在于甲哌鎓原料以及商品化甲哌鎓劑型中。鑒于此,建立一種能同時測定植物生長調(diào)節(jié)劑混合劑型中的主要活性成分氯化膽堿、甲哌鎓及雜質(zhì)N-甲基哌啶的快速簡便方法,具有重要的意義。

分析水溶液中的季銨型農(nóng)藥相對較困難[6-7]。氯化膽堿是膽堿的鹽酸鹽形式,目前,對氯化膽堿的主要分析方法有LC-MS/MS[8-9]、生物傳感器法[10]以及非抑制離子色譜法[11-12]。對甲哌鎓的主要分析方 法 有 HPLC[13]、 LC-MS[14-15]、 HILIC-MS/MS[16]、LC-MS/MS[17-19]、毛細(xì)管電泳[20]及拉曼光譜法[21]。以上用于季銨型農(nóng)藥化合物的定量檢測方法大多涉及較昂貴或不常見的儀器,普通實驗室難于實現(xiàn)。目前尚未見關(guān)于同時測定氯化膽堿、甲哌鎓及雜質(zhì)N-甲基哌啶的文獻(xiàn)報道,也未見關(guān)于N-甲基哌啶的測定方法的相關(guān)報道。

自1975年離子色譜問世以來,已在靈敏度、選擇性、分析對象等方面取得了重大進(jìn)展,尤其是抑制電導(dǎo)系統(tǒng)的發(fā)展[22]。 FEGERT等[23]于1991年建立了一種測定動植物基質(zhì)中甲哌鎓的離子對方法,該方法采用柱切換技術(shù),較為煩瑣費(fèi)時。本文建立了一種陽離子色譜交換分離-抑制電導(dǎo)同時直接檢測氯化膽堿、甲哌鎓及N-甲基哌啶質(zhì)量濃度的方法,該方法無須復(fù)雜的樣品前處理過程,可在10 min內(nèi)完成對以上3種目標(biāo)化合物的檢測,且常規(guī)陽離子不會干擾測定結(jié)果。該方法可應(yīng)用于相關(guān)農(nóng)藥劑型的檢測和質(zhì)量控制。

1 實 驗

1.1 儀器與試劑

Thermo Scientific ICS-3000離子色譜儀(Sunnyvale,CA,USA),配雙重活塞系列泵,DS6電導(dǎo)檢測器,柱溫箱,Rheodyne六通閥,Chromeleon 6.80色譜工作站,Thermo Scientific IonPac CG17(50 mm×4 mm)保護(hù)柱+Thermo Scientific IonPac CS17(250 mm×4 mm)分離柱,Thermo Scientific CSRS300-4 mm電化學(xué)自再生抑制器；0.22 μm尼龍濾膜過濾頭。

分析標(biāo)準(zhǔn)品(氯化膽堿,純度99%;甲哌鎓,純度99%;N-甲基哌啶,純度97%)以及甲烷磺酸(methane sulfonic acid,MSA,純度99.5%)均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司,甲哌鎓單獨(dú)及混合可溶性水劑：市購,其他化學(xué)試劑均為分析純,實驗室所用均為18.2 MΩ·cm去離子水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及樣品制備

用去離子水分別配制氯化膽堿、甲哌鎓及N-甲基哌啶的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液(質(zhì)量濃度為2 000 mg·L-1),于4℃冰箱中保存,用去離子水將標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液稀釋成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

樣品直接用去離子水稀釋,經(jīng)0.22 μm尼龍濾膜過濾后,供離子色譜測定。

1.3 色譜條件

色譜柱為Thermo Scientific IonPac CG17(50 mm×4 mm)保護(hù)柱+Thermo Scientific IonPac CS17(250 mm×4 mm)分離柱;柱溫為30℃;采用10 mmol·L-1MSA溶液等度淋洗;流速為1.0 mL·min-1;自再生電化學(xué)抑制模式,抑制電流為35 mA;電導(dǎo)池溫度為 35 ℃;進(jìn)樣體積為 25 μL;外標(biāo)法峰面積定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

從圖1中可以看出,氯化膽堿和甲哌鎓為季銨類化合物,N-甲基哌啶為叔胺類化合物,與甲哌鎓有相似的結(jié)構(gòu)。因此,這3種化合物在酸性條件下可解離成陽離子,采用陽離子交換色譜對其進(jìn)行分離。為研究此3種化合物的保留行為,進(jìn)行了一系列固定相和流動相的選擇和優(yōu)化實驗。首先,選用3種不同類型的陽離子交換色譜柱(Thermo Scientific IonPac SCS,IonPac CS12A和IonPac CS17)對上述3種化合物進(jìn)行分離,實驗結(jié)果表明,具有中等交換容量(1.45 meq/column)的IonPac CS17色譜柱在保留時間、分離度以及檢測靈敏度上均優(yōu)于其余2種。因此,本實驗選用對水合質(zhì)子具有高選擇性的IonPac CS17色譜柱分離氯化膽堿、甲哌鎓及N-甲基哌啶。由于MSA具有較低的背景電導(dǎo)[24],因此選用MSA溶液作為淋洗液。對MSA淋洗液的條件進(jìn)行了優(yōu)化(見圖2),當(dāng)采用15 mmol·L-1MSA溶液淋洗時,3種化合物在6.0 min內(nèi)全部出峰,但甲哌鎓和N-甲基哌啶重疊在一起(見圖2中的4號峰),不能完全分開;當(dāng)采用12 mmol·L-1MSA溶液淋洗時,3種化合物在8.0 min內(nèi)全部出峰,但Ca2+與N-甲基哌啶無法實現(xiàn)完全分離,實樣Ca2+在測定N-甲基哌啶時存在干擾;當(dāng)采用10 mmol·L-1MSA溶液淋洗時,3種化合物在10.0 min內(nèi)完全分離,峰形對稱;為驗證在該淋洗液濃度條件下常規(guī)陽離子是否對目標(biāo)分析物存在干擾,特配制了同時含Li+,Na+,NH4+,K+,Mg2+和Ca2+的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,并于上述淋洗液濃度條件下進(jìn)行測定,從圖3中可以看出,6種常規(guī)陽離子對以上3種化合物的測定均不存在干擾。因此,本實驗采用10 mmol·L-1MSA作為最佳淋洗液條件。

圖2 不同濃度淋洗液條件下的分離效果色譜圖Fig.2 Chromatograms of standard mixture solution obtained by eluent of different concentrations

圖3 最佳色譜條件下混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.3 Chromatogram of standard mixture solution under the optimized conditions

2.2 線性關(guān)系、重現(xiàn)性及方法的檢出限

用上述優(yōu)化后的色譜條件,分別對氯化膽堿、甲哌鎓及N-甲基哌啶的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測定,以相應(yīng)的色譜峰面積(y)對其質(zhì)量濃度(x,mg·L-1)進(jìn)行線性回歸。氯化膽堿質(zhì)量濃度在0.1～500 mg·L-1內(nèi)線性關(guān)系良好,甲哌鎓質(zhì)量濃度在0.5～500 mg·L-1內(nèi)線性關(guān)系良好,N-甲基哌啶質(zhì)量濃度在0.4～200 mg·L-1內(nèi)線性關(guān)系良好,線性相關(guān)系數(shù)r均大于0.999 4。將質(zhì)量濃度為20 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,按優(yōu)化后的色譜條件進(jìn)樣,連續(xù)進(jìn)樣6次,其保留時間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.04%～0.05%,色譜峰高RSD為0.25%～0.47%,色譜峰面積RSD為0.30%～0.43%,表明該方法具有較好的重現(xiàn)性。信噪比(S/N)為3時,3種化合物的檢出限(LOD)為28.0～112.5 μg·L-1;信 噪 比(S/N)為 10 時,3 種 化 合 物定量限(LOQ)為 93.5～375.0 μg·L-1(見表 1)。

2.3 樣品測定及加標(biāo)回收試驗

根據(jù)上述樣品前處理方法和優(yōu)化后的色譜條件,分別對3個市購的植物生長調(diào)節(jié)劑樣品進(jìn)行測定,圖4為氯化膽堿和甲哌鎓混合劑型樣品色譜圖,圖5為其中1個只含甲哌鎓的水劑樣品色譜圖。從圖4和圖5中可以看出,商品化的甲哌鎓植物生長調(diào)節(jié)劑中均含有雜質(zhì)N-甲基哌啶。通過外標(biāo)法定量測定的3個市購樣品,其主要成分(氯化膽堿和甲哌鎓)的質(zhì)量濃度與商品標(biāo)注的質(zhì)量濃度不存在顯著差異(p＞0.05),雜質(zhì)N-

圖4 氯化膽堿和甲哌鎓混合劑型樣品色譜圖Fig.4 Chromatogram of a mixed choline chloride and mepiquat chloride formulation

表1 方法的線性關(guān)系、檢出限及精密度Table 1 Linear relationship，limit of detection and precision of the method

表2 實際樣品分析結(jié)果Table 2 Analytical results of real samples

圖5 甲哌鎓水劑樣品色譜圖Fig.5 Chromatogram of an individual mepiquat chloride formulation

3 結(jié) 論

建立了一種簡單快速的離子色譜-抑制電導(dǎo)同時測定2種植物生長調(diào)節(jié)劑活性成分以及雜質(zhì)的方法。樣品用去離子水稀釋后直接進(jìn)樣分析,采用Thermo Scientific CS17陽離子交換色譜柱以及10 mmol·L-1MSA溶液等度淋洗,可在10 min內(nèi)完成3種目標(biāo)分析物的測定。通過線性、選擇性、靈敏度、重現(xiàn)性以及準(zhǔn)確性等一系列方法學(xué)驗證,結(jié)果表明,該方法操作簡單、高效快速、線性范圍寬、線性關(guān)系良好,具有較好的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度,適用于一系列相關(guān)植物生長調(diào)節(jié)劑原料或商品化劑型主成分及雜質(zhì)的測定,為植物生長調(diào)節(jié)劑原料或成品的質(zhì)量控制提供了一種新型、簡便、高效的分析方法。

表3 實際樣品加標(biāo)回收率結(jié)果Table 3 Recovery results of real sample