寧慶慶， 亐開興， 胡應武， 張繼才， 黃必志， 陳 宏， 雷初朝*

(1.西北農林科技大學動物科技學院，陜西 楊凌 712100；2.云南省草地動物科學研究院，云南 小哨 650212；3.云南省新平縣者竜鄉(xiāng)農業(yè)綜合服務中心，云南 新平 653408)

昭通牛主產于云南省昭通市，分布于全市所轄11個縣(區(qū))，屬云南省地方優(yōu)良品種[1-2]。產區(qū)分布區(qū)域從海拔267 m江邊河谷區(qū)到海拔3 090 m高寒山區(qū)，屬亞熱帶氣候類型。1962年在昭通盆地(在距今約100萬年前的更新紀地層中)發(fā)現(xiàn)原?；?，表明昭通牛馴化歷史久遠，并經過當?shù)刈匀画h(huán)境和人為的長期選育，形成現(xiàn)在的昭通牛[1]。昭通牛屬于役肉兼用型，其特點是性格溫順，行動敏捷，管理性能好；體質堅實勻稱，肉質良好，難產率低；耐粗、耐寒、耐旱、耐熱、耐濕、適應性強，役用性能好[1]。目前，昭通牛商業(yè)用途的廣泛化使其引入很多外來牛品種凍精進行雜交改良，導致純種昭通牛數(shù)量急劇減少，如果不加以保護，昭通?？赡茉诓痪玫膶硖幱跒l危狀態(tài)。

Y染色體由雄性特異區(qū)(MSY)和擬常染色體區(qū)(PAR)組成，其中MSY區(qū)作為Y染色體的非重組區(qū)，具有父系遺傳的特點，且Y染色體單倍體性完整，有較低的突變率并不易受重組和回復突變等因素的影響，故為家牛的起源進化、遺傳多樣性和群體遺傳結構等研究的重要工具[3]。近年來，Y染色體單核苷酸多態(tài)性(Y-SNPs)和微衛(wèi)星(Y-STRs)標記已作為家牛遺傳研究的重要依據。相關研究[4-7]證實，家牛有3種Y染色體單倍型組，分別為普通牛Y1和Y2單倍型組以及瘤牛Y3單倍型組。Gotherstrom等[3]對歐洲牛的MSY區(qū)多個SNPs標記發(fā)現(xiàn)2個位點(UTY-19和ZFY-5)可分離Y1和Y2單倍型組，推測Y1單倍型組起源于歐洲野牛；Ginja等[4]利用Y-SNPs(DDX3Y、UTY-19和ZFY)、1個Indel(ZFY-10)和Y-STRs(IRNA124、IRNA189、BM861、UMN0103、UMN0307和UMA0504)標記對葡萄牙本土13個牛品種、外來牛3個品種及婆羅門牛品種的遺傳多態(tài)性和父系起源進行調查，揭示了葡萄牙本地牛品種的單倍型及品種間的遺傳關系；Edwards等[5]利用Y-SNPs(UTY-19和ZFY-10)和Y-STRs(IRNA189和BM861)標記對歐洲和亞洲共138個牛品種進行分析，結果表明：歐洲牛只攜帶普通牛單倍型組(其中Y1單倍型組主要分布于歐亞大陸北部，Y2單倍型組主要分布在中歐地區(qū))；而瘤牛Y3單倍型組主要在西南亞地區(qū)占明顯優(yōu)勢。

我國作為牛品種極為豐富的國家，擁有53個地方黃牛品種[2]，根據外形特征、地域分布和氣候特點又可將黃牛分為北方黃牛、南方黃牛和中原黃牛。迄今為止，周艷等[8]利用線粒體DNA多態(tài)性對昭通牛群體遺傳多樣性及變異特征進行了研究，但有關昭通牛Y染色體的父系起源、遺傳多樣性和種群遺傳結構等方面的研究未見報道。因此，本研究利用2個Y-SNPs標記(UTY-19和ZFY-10)和2個Y-STRs標記(IRNA189和BM861)聯(lián)合分析的方法，對昭通牛的父系起源、遺傳多樣性和群體遺傳結構進行探究，以期為今后開展昭通牛的分子育種和資源保種工作提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 采樣及基因組DNA提取

在云南省昭通市威信縣三桃鄉(xiāng)昭通牛分布區(qū)，采集公牛耳組織樣，于75%酒精中保存，帶回實驗室。采取常規(guī)酚—氯仿抽提法對基因組DNA進行提取，稀釋至10～20 ng/μL保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物合成和PCR擴增

參照已發(fā)表的家牛Y染色體2個Y-SNPs標記(UTY-19和ZFY-10)和Y-STRs標記(IRNA189和BM861)的引物信息[3-5]合成4對引物(表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應體系(12.5 μL)：2×Es TaqMasterMix(Dye) 6.00 μL，Sterile ddH2O 5.00 μL，上、下游引物(10 pmol/L)各0.25 μL，模板DNA 1.00 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，Tm(表1)退火30 s，72 ℃延伸30 s，36個循環(huán)；72 ℃充分延伸10 min；4 ℃保存。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠(含Goldview核酸染料)電泳后，凝膠成像系統(tǒng)檢測，將檢測合格的產物送至上海生物工程有限技術公司進行測序分析。

1.3 產物測序和單倍型分析

將PCR純化產物送至生工生物工程股份有限公司(上海)用3730XL型DNA測序儀進行正、反向測序，測序結果通過Chromas 2.6.5軟件進行查看和校正，得到每頭昭通公牛的2個Y-SNPs標記(UTY-19和ZFY-10)測序序列。2個Y-STRs標記的PCR產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行熒光分型，獲得INRA189和BM861等位基因大小。結合Y-SNPs和Y-STRs標記的數(shù)據，獲得昭通牛公牛的單倍型(Y-SNPs-INRA189-BM861)，再用Arlequin 3.11軟件進行單倍型多樣度計算。

表1 家牛2個Y-SNPs標記和2個Y-STRs標記的相關信息

2 結果與分析

通過對24頭昭通牛2個Y-SNPs多態(tài)性標記測定序列比對分析，結果表明：UTY-19標記僅有一種C>A顛換突變，頻率為100%；ZFY-10標記存在C>T轉換突變，頻率為70.83%。根據Gotherstrom和Ginja[3-4]等對Y染色體單倍型的判定標準，昭通牛公牛存在Y2和Y3兩種單倍型組(表2)。其中7頭昭通牛屬于普通牛Y2單倍型組，所占頻率為29.17%；19頭昭通牛屬于瘤牛血統(tǒng)Y3單倍型組，所占頻率為70.83%。表明昭通牛的父系起源以瘤牛為主，且其地域分布屬于南方黃牛類型，與中國南方黃牛的起源進化相一致。

表2 昭通牛Y染色體單倍型與單倍型頻率

利用2個Y-STRs標記熒光分型，結果表明：昭通牛在INRA189標記中只有2個等位基因，大小分別為88 bp和90 bp；昭通牛在BM861標記中存在156 bp和158 bp 2個等位基因(表2)。結合2個Y-SNPs和2個Y-STRs標記聯(lián)合分析，確定昭通牛群體存在兩種單倍型：Y2-90-158和Y3-88-156(表2)，頻率分別為29.17%(7/24)和70.83%(17/24)，表明昭通牛有普通牛和瘤牛2個父系起源。昭通牛群體的Y染色體單倍型多樣度為0.4312±0.0812，表明其遺傳多樣性較高。

3 討 論

近年來，隨著測序技術的發(fā)展，對Y-SNPs和Y-STRs標記多態(tài)性的研究極大地推動了家牛父系遺傳多樣性及群體遺傳結構的研究進程。常振華等[9]利用4個Y-SNPs(DDX3Y-7、UTY-19、ZFY-9和ZFY-10)標記分析了中國黃牛16個品種以及4頭緬甸牛的Y染色體遺傳多樣性，結果顯示中國黃牛存在Y2和Y3兩種單倍型組，且自北到南Y2單倍型組頻率逐漸降低，而Y3單倍型組頻率逐漸增加；緬甸牛均為Y3單倍型組。Cai等[6]通過2個Y-STRs(UMN2404和UMN0103)分子標記對25個中國黃牛品種進行多態(tài)性分析，結果發(fā)現(xiàn)南方地區(qū)的瘤牛等位基因頻率占92.4%，而北方地區(qū)的普通牛等位基因頻率占95.5%；并推測海南島可能是瘤牛的起源地，而西藏?？赡苁橇硪粋€支系馴化而來。Li等[7]利用4個Y-SNPs和2個Y-STRs對中國16個黃牛品種的Y染色體多態(tài)性進行分析，統(tǒng)計各種單倍型組的頻率得出的結果與Cai等[6]研究結果基本一致。諸多研究結果證實，中國黃牛的單倍型組分布具有明顯的地理結構特征，這與mtDNA相關研究[10-11]、歷史及地理信息結果一致。

Xia等[12]分析了我國34個中國黃牛品種Y-SNPs(UTY19和ZFY10)和Y-STRs(INRA189和BM861)的多態(tài)性，結果表明：中國黃牛存在14種單倍型，其中Y2-104-158和Y2-102-158是中國北部和中部最常見的普通牛單倍型，而瘤牛單倍型Y3-88-156在中國南方占優(yōu)勢；單倍型Y2-108-158、Y2-110-158、Y2-112-158和Y3-92-156是中國牛所特有的。本研究同樣采用Y-SNPs(UTY-19和ZFY-10)和Y-STRs標記(INRA189和BM861)結合的方法[4-7]，確定昭通牛有Y2-90-158和Y3-88-156兩種單倍型，其中Y3-88-156單倍型占主導地位(70.83%)，說明昭通牛主要是瘤牛父系起源，這與昭通牛在中國的地理分布相一致?；趍tDNA D-loop區(qū)多態(tài)性分析，周艷等[8]首先報道了昭通牛是以普通牛為主的母系起源。隨后，Xia等[11]對中國黃牛mtDNA D-loop區(qū)遺傳多態(tài)性進行評估，發(fā)現(xiàn)昭通牛主要存在普通牛單倍型組T3(52.4%)和瘤牛單倍組I1(33.3%)兩種母系起源，結合本研究結論證實昭通牛為普通牛與瘤牛起源，與其品種的形成歷史相一致[1-2]。本研究中，24頭昭通牛的單倍型多樣度為0.4312±0.0812，稍高于Edwards等[5]報道的138個國外牛品種的平均單倍型多樣度0.422±0.3，低于Li等人[7]揭示的中國16個黃牛品種的單倍型多樣度0.6831±0.0134，說明昭通牛群體遺傳多樣性相對較高。目前，昭通牛品種逐漸受到國外引入肉牛品種西門塔爾牛和我國自主培育的肉牛品種云嶺牛的雜交，雜交公牛多實行育肥出售，導致昭通牛原有的遺傳資源正在逐漸減少。因此，建議建立昭通牛保種區(qū)或保種場，加強純種選育、提高和保護，避免其遺傳資源的流失，為我國肉牛新品種培育提供育種素材。