張 明,吳 媛,趙永林,趙君杰,黃廷欽,馬旭東,宋錦寧*

(1西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科,西安 710004;2西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科;3西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤病院;4西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科;*通訊作者,E-mail:jinnings@126.com)

腦卒中是導(dǎo)致老齡人群致殘和死亡的重要原因,其中約80%患者為缺血性卒中。缺血性腦損傷是影響患者遠(yuǎn)期預(yù)后的主要原因[1],一旦缺血開(kāi)始形成,在數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)內(nèi)就會(huì)發(fā)生序貫性加重的腦損傷,缺血導(dǎo)致相關(guān)區(qū)域神經(jīng)血管單元功能受到嚴(yán)重影響,尤其是神經(jīng)元處于高代謝狀態(tài),在缺血影響下導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外能量代謝失衡,在此過(guò)程中神經(jīng)元細(xì)胞更易受到損害,引起細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)異常,除引起興奮性毒性外[1],還有可能產(chǎn)生因Ca2+超載導(dǎo)致的非興奮性毒性機(jī)制。近年來(lái),有研究認(rèn)為Ca2+可通透性瞬時(shí)受體電位通道1(transient receptor potential channel 1,TRPC1)是非興奮性毒性機(jī)制相關(guān)蛋白[2]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明,敲除小鼠海馬神經(jīng)元的TRPC1,可明顯減少動(dòng)作電位誘發(fā)的興奮性突觸后電流,對(duì)突觸傳遞產(chǎn)生影響[2]。進(jìn)一步的研究證實(shí)[3],TRPC1缺失可能通過(guò)擾亂多種生物過(guò)程引起紋狀體神經(jīng)細(xì)胞凋亡,包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能、氧化應(yīng)激和凋亡相關(guān)信號(hào)通路,TRPC1可能是調(diào)節(jié)小鼠紋狀體細(xì)胞存活和死亡的關(guān)鍵參與者。但TRPC1在腦缺血后神經(jīng)元中的表達(dá)變化如何,是否與腦缺血后鈣超載導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡相關(guān),抑制TRPC1引起的鈣內(nèi)流是否對(duì)腦缺血后神經(jīng)元起到保護(hù)作用,目前具體的作用機(jī)制尚不明確。因此,本研究采用四血管阻塞法建立大鼠腦缺血模型,探討TRPC1離子通道在缺血后神經(jīng)元鈣超載中的作用,以揭示TRPC1通道參與腦缺血后神經(jīng)元凋亡及突觸損傷的機(jī)制,尋找臨床治療新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑、儀器

6周齡雄性SD大鼠120只,SPF級(jí),體質(zhì)量220-260 g,由西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(許可證號(hào):SCXK(陜)08-018)。SKF96365(S7809,Sigma-Aldrich,美國(guó));二甲基亞砜溶液(DMSO,D8418,Sigma-Aldrich,美國(guó));細(xì)胞膜蛋白提取試劑盒(Thermo Scientific,美國(guó));NeuN(Chemicon,MAB377B,美國(guó))TRPC1兔單克隆抗體(Abcam,美國(guó));β-actin鼠單克隆抗體(Santa Cruz,美國(guó));辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗(Santa Cruz,美國(guó));PVDF膜(Millipore,美國(guó));TUNEL凋亡試劑盒(Promega,美國(guó));凝膠成像系統(tǒng)(JS-380A,中國(guó));圖像采集與分析系統(tǒng)(Leica-Q550CW,德國(guó));透射式電子顯微鏡(H-600型,日本);腦立體定向儀(Stoelting Ultra Precise 51600,美國(guó))。

1.2 大鼠分組處理及全腦缺血模型的建立

120只SD大鼠被隨機(jī)分為腦缺血模型組(n=50),SKF96365干預(yù)模型組(n=50),DMSO干預(yù)對(duì)照模型組(n=10),正常對(duì)照組(n=10)。腦缺血模型組及SKF96365干預(yù)模型組各分為5個(gè)亞組,分別為缺血后1 d,3 d,5 d,7 d,10 d組,每組10只。

大鼠術(shù)前禁食禁飲4-6 h,10%水合氯醛腹腔注射麻醉。頸前部剃毛備皮,常規(guī)消毒,暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈,分離并完全結(jié)扎雙側(cè)鎖骨下動(dòng)脈。當(dāng)大鼠翻正反射將要恢復(fù),即有翻身動(dòng)作但尚不能翻身時(shí),迅速用微動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈,使大腦血供完全消失,可見(jiàn)大鼠掙扎數(shù)秒后于60 s內(nèi)昏迷,同時(shí)可見(jiàn)大鼠四肢上舉,痛覺(jué)反射消失,反正反射消失,雙側(cè)瞳孔散大,眼球呈灰白色,計(jì)時(shí)15 min,放開(kāi)動(dòng)脈夾迅速縫合傷口。大鼠置于恒溫箱中進(jìn)行術(shù)后恢復(fù)。SKF96365干預(yù)模型組將5 μl TRPC1阻斷劑SKF96365溶于DMSO,終濃度為10 μmol/L,于建模前30 min經(jīng)立體定向側(cè)腦室微注射(前囟后1 mm,旁開(kāi)1.5 mm,深3.5 mm);DMSO干預(yù)對(duì)照模型組使用等量DMSO行側(cè)腦室注射,其他操作與全腦缺血模型組相同。正常對(duì)照組不予任何處理。

1.3 免疫形態(tài)學(xué)及電鏡研究

各組大鼠在缺血后1,3,5,7,10 d分別進(jìn)行形態(tài)學(xué)標(biāo)本采集[4]。10%水合氯醛以0.5 ml/kg麻醉,用40 g/L的多聚甲醛灌流固定。石蠟包埋并制成5 μm切片,經(jīng)烘片、脫蠟、梯度酒精脫水及抗原修復(fù)后,滴加封閉血清,在濕盒中37 ℃封閉30 min。滴加適宜濃度的一抗置濕盒中37 ℃ 1 h,再洗去一抗,滴加熒光二抗,室溫濕盒中避光孵育1 h,洗二抗后滴加DAPI,之后用甘油封片,在熒光顯微鏡下立即觀察并采集圖像。采用SABC法進(jìn)行組織化學(xué)染色并在光鏡下進(jìn)行觀察。將海馬標(biāo)本用電鏡固定液固定,采用常規(guī)電鏡標(biāo)本制作方法,經(jīng)清洗、脫水、浸透、包埋和修塊后作超薄切片,在透射電鏡下觀察。

1.4 海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度([Ca2+]i)檢測(cè)

取新鮮海馬剪碎后置于1.5 ml冰Hank’s液中,吹打10 min,過(guò)200目濾網(wǎng)。用含100 ml/L小牛血清的DMEM培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液(106個(gè)/ml)。取細(xì)胞懸液1 ml離心,棄上清,37 ℃預(yù)溫后加入7.5 μl的Fura-2AM(終濃度為6 μmol/L);另取同一細(xì)胞懸液1 ml未負(fù)載Fura-2AM作為空白對(duì)照。單細(xì)胞懸液37 ℃復(fù)溫后在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)熒光強(qiáng)度[4,5]。激發(fā)波長(zhǎng)為380 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為510 nm,分別測(cè)定F、Fmax、Fmin。F為380 nm激發(fā)波長(zhǎng)測(cè)得的熒光強(qiáng)度值;Fmax為最大熒光強(qiáng)度值,即加入Triton X-100(終質(zhì)量濃度為1 nmol/L)后所測(cè)得的熒光強(qiáng)度值;Fmin為最小熒光強(qiáng)度值,即在Fmax基礎(chǔ)上加入EGTA(終濃度為5 nmol/L)后所測(cè)得的熒光強(qiáng)度值。胞內(nèi)Ca2+濃度計(jì)算:[Ca2+]i=Kd(F-Fmin)/(Fmax-F),其中Kd=224 nmol/L。

1.5 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

各組大鼠在缺血后1,3,5,7,10 d分別進(jìn)行蛋白印跡標(biāo)本采集[6]。灌注取腦,取雙側(cè)海馬,用提取細(xì)胞膜蛋白試劑盒,用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取50 μg蛋白樣品,SDS-PAGE分離蛋白,半干法轉(zhuǎn)移至PVDF膜,將膜放入50 g/L脫脂牛奶中37 ℃封閉后,加入一抗(TRPC1,1 ∶1 000;NeuN,1 ∶500;β-actin,1 ∶1 000),4 ℃孵育過(guò)夜。TBST緩沖液洗膜,加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h,用增強(qiáng)化學(xué)放光法觀察顯影,凝膠成像系統(tǒng)拍照,用Image J軟件測(cè)定條帶吸光度作定量分析。

1.6 TUNEL檢測(cè)皮層神經(jīng)元凋亡

腦缺血模型組、SKF96365干預(yù)模型組、DMSO干預(yù)對(duì)照模型組各3只大鼠在預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)深度麻醉后,經(jīng)左心室灌注固定后迅速開(kāi)顱取腦,40 g/L多聚甲醛溶液中固定24 h,石蠟包埋,連續(xù)冠狀切片,每個(gè)腦塊10張,片厚5 μm。按照TUNEL凋亡試劑盒提供步驟染色。圖像分析系統(tǒng)采集圖像,每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野(100-200倍),計(jì)數(shù)TUNEL陽(yáng)性神經(jīng)元[7]。

1.7 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)(Morris water maze,MWM)

連續(xù)4 d對(duì)大鼠進(jìn)行4次學(xué)習(xí)獲得試驗(yàn)。試驗(yàn)持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)為120 s,在此時(shí)間范圍內(nèi)未能找到平臺(tái)的大鼠被實(shí)驗(yàn)者輕輕引導(dǎo)至平臺(tái)。大鼠在連續(xù)4 d學(xué)習(xí)后,建立全腦缺血模型。干預(yù)模型組大鼠在誘導(dǎo)腦缺血前30 min接受側(cè)腦室顯微注射SKF96365。第1-10天在探索試驗(yàn)中測(cè)試腦缺血模型組和SKF96365干預(yù)模型組中的大鼠。記錄大鼠在訓(xùn)練象限中搜索平臺(tái)的時(shí)間比例,即平臺(tái)的先前位置,并用作空間記憶保持的量度,以確定每組中搜索目標(biāo)象限的差異[8]。

1.8 體視學(xué)分析

每個(gè)腦塊以100 μm厚度垂直于長(zhǎng)軸連續(xù)切割,并且沿著海馬整個(gè)范圍收集冠狀切片。隨機(jī)選擇5個(gè)系列切片用于染色,使用系統(tǒng)均勻隨機(jī)采樣[9]。單個(gè)實(shí)驗(yàn)者在不知道每只大鼠條件的情況下收集該研究的所有體視學(xué)數(shù)據(jù)。使用基于計(jì)算機(jī)的Stereologer TM(SPA,Alexandria,VA)系統(tǒng)輔助的光學(xué)技術(shù)評(píng)估海馬CA1區(qū)域中錐體神經(jīng)元的總數(shù)[10]。用以下等式[11]計(jì)算錐體神經(jīng)元的數(shù)量:N=(1/ssf)(1/asf)(1/tsf)ΣQ-,其中N是錐體神經(jīng)元總數(shù)的估計(jì)值,并且ΣQ-是整個(gè)參考空間中計(jì)數(shù)的單元格數(shù)。ssf是截面采樣分?jǐn)?shù),asf是面積采樣分?jǐn)?shù),tsf是截面厚度分?jǐn)?shù)。為了評(píng)估神經(jīng)元數(shù)量和密度的可能差異,按照公式計(jì)算海馬結(jié)構(gòu)亞區(qū)神經(jīng)元的總數(shù)目。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 海馬神經(jīng)元[Ca2+]i變化

腦缺血模型組中海馬神經(jīng)元[Ca2+]i在缺血后3 d時(shí)明顯升高,之后逐漸降低,至10 d時(shí)降至1 d水平。SKF96365干預(yù)模型組中海馬神經(jīng)元[Ca2+]i雖在1 d開(kāi)始上升,高于正常對(duì)照組,但其總體升高趨勢(shì)被明顯抑制,與腦缺血模型組相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)圖1)。

與正常對(duì)照組相比,*P<0.05;與全腦缺血模型組相比,#P<0.05圖1 不同時(shí)間段海馬神經(jīng)元[Ca2+]i變化趨勢(shì)Figure 1 Changes of [Ca2+]i in hippocampal neurons at different time points

2.2 海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化

神經(jīng)元特異性NeuN熒光染色可見(jiàn)正常對(duì)照組大鼠海馬結(jié)構(gòu)完整,CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞熒光強(qiáng)度正常,腦缺血模型組海馬結(jié)構(gòu)基本保持完整,但CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞熒光顯示神經(jīng)元染色有丟失(見(jiàn)圖2A、B)。透射電鏡下觀察海馬超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),腦缺血模型組中神經(jīng)元腫脹,神經(jīng)元胞內(nèi)線粒體、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,嵴紊亂,周?chē)梢?jiàn)高密度電子物質(zhì)生成,細(xì)胞核變形,部分胞質(zhì)內(nèi)空泡形成,染色質(zhì)不均勻、邊集、濃縮,可見(jiàn)核內(nèi)凋亡小體形成;正常組中髓鞘結(jié)構(gòu)完整,髓鞘形態(tài)連續(xù),其內(nèi)可見(jiàn)神經(jīng)纖維斷層;而腦缺血模型組中可見(jiàn)髓鞘正常結(jié)構(gòu)受到破壞,髓鞘腫脹,局部有空泡形成,髓鞘連續(xù)性片層結(jié)構(gòu)疏松、分離或消失,片層結(jié)構(gòu)內(nèi)缺乏神經(jīng)纖維及線粒體。使用SKF96365阻斷鈣內(nèi)流后可保護(hù)神經(jīng)元髓鞘結(jié)構(gòu)完整,維持神經(jīng)纖維片層結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖2C-F)。

A.正常對(duì)照組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞熒光;B.全腦缺血模型組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞熒光;C.全腦缺血模型組大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)變化;D.全腦缺血模型組大鼠海馬神經(jīng)元核內(nèi)凋亡小體,髓鞘結(jié)構(gòu)破壞;E.SKF96365干預(yù)模型組大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)基本完整;F.SKF96365干預(yù)模型組大鼠海馬髓鞘結(jié)構(gòu)保存圖2 大鼠海馬NeuN熒光染色(×50)及神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)觀察(×10 000)Figure 2 NeuN fluorescent staining(×50) and neuronal ultrastructure observation in rat hippocampus(×10 000)

2.3 TRPC1在海馬中表達(dá)變化

Western blot結(jié)果顯示,TRPC1在腦缺血后3 d表達(dá)到達(dá)高峰,之后逐漸降低,10 d時(shí)表達(dá)與1 d時(shí)相似。SKF96365干預(yù)模型組中TRPC1在3 d時(shí)表達(dá)可被抑制,其表達(dá)趨勢(shì)未出現(xiàn)顯著增加(見(jiàn)圖3)?；叶戎捣治鲲@示腦缺血模型組3 d與其他各組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);NeuN在腦缺血后表達(dá)明顯降低,在3 d及5 d時(shí)最顯著,與其他時(shí)間段相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,之后逐漸升高(P<0.05)。SKF96365干預(yù)模型組中TRPC1蛋白的表達(dá)明顯被抑制,灰度分析結(jié)果顯示,各個(gè)時(shí)間段之間相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;NeuN在干預(yù)模型組中表達(dá)呈現(xiàn)逐漸增高趨勢(shì),在5 d時(shí)達(dá)到峰值,之后逐漸降低。SKF96365干預(yù)模型組中TRPC1蛋白的表達(dá)明顯被抑制,灰度分析顯示缺血后3 d與腦缺血模型組比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

與全腦缺血模型組相比,*P<0.05圖3 腦缺血模型組及SKF96365干預(yù)模型組TRPC1在大鼠海馬中的表達(dá)變化Figure 3 Expression of TRPC1 in rat hippocampus in cerebral ischemia model group and SKF96365 intervention model group at different time points

2.4 TUNEL陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)及計(jì)數(shù)

TUNEL染色結(jié)果顯示,全腦缺血模型組(見(jiàn)圖4F-J)在1 d時(shí)已有海馬神經(jīng)元的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞,之后逐漸增多,至5 d時(shí)最多;SKF96365干預(yù)模型組(圖4A-E)中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞雖較正常對(duì)照組(圖4K)有增高,但其顯著增高趨勢(shì)被抑制。TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)表明,腦缺血模型組中缺血后3,5,7 d與SKF96365干預(yù)模型組對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)圖5)。

A-E.分別為SKF96365干預(yù)1,3,5,7,10 d組;F-J.分別為全腦缺血后1,3,5,7,10 d組;K.正常對(duì)照組圖4 全腦缺血模型組及SKF96365干預(yù)模型組海馬CA1區(qū)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)變化Figure 4 Expression of TUNEL positive cells in hippocampal CA1 area of cerebral ischemia model group and SKF96365 intervention model group

與正常對(duì)照組相比,*P<0.05;與腦缺血模型相比,#P<0.05圖5 三組海馬CA1區(qū)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較Figure 5 Comparison of TUNEL positive cells in hippocampal CA1 area among three groups

2.5 Morris水迷宮檢測(cè)海馬功能

空間搜索實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,正常對(duì)照組大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡以目標(biāo)象限居多;全腦缺血模型組大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡,目標(biāo)象限較少;SKF96365干預(yù)模型組大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡目標(biāo)象限較腦缺血模型組增多(見(jiàn)圖6)。全腦缺血模型組與正常對(duì)照組相比,大鼠空間搜索目標(biāo)象限的軌跡時(shí)間明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而SKF96365干預(yù)模型組與全腦缺血模型組相比,大鼠空間搜索目標(biāo)象限的軌跡雖未能恢復(fù)至正常,但空間目標(biāo)搜索時(shí)間明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)圖6)。

2.6 體視學(xué)分析結(jié)果

大鼠海馬CA1區(qū)不同視野下陽(yáng)性NeuN神經(jīng)元計(jì)數(shù)數(shù)量在腦缺血模型組中,5 d時(shí)為最少,之后逐漸升高;而SKF96365干預(yù)模型組的陽(yáng)性NeuN神經(jīng)元計(jì)數(shù)數(shù)量在5 d時(shí)與腦缺血模型組相比,數(shù)量明顯增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)圖7),說(shuō)明存活神經(jīng)元數(shù)量較全腦缺血組改善。

與正常對(duì)照相比,*P<0.05;與全腦缺血模型組相比,#P<0.05圖6 正常對(duì)照組、全腦缺血模型組和SKF96365干預(yù)模型組大鼠在水迷宮中的運(yùn)動(dòng)軌跡及目標(biāo)象限耗時(shí)Figure 6 The trace and target quadrant time consuming of rats in normal group, cerebral ischemia model group and SKF96365 intervention model group in water maze

與正常對(duì)照組相比,*P<0.05;與全腦缺血模型組相比,#P<0.05圖7 體視學(xué)分析海馬CA1區(qū)神經(jīng)元及陽(yáng)性NeuN神經(jīng)元數(shù)量Figure 7 Stereology analysis of the number of neurons in hippocampal CA1 area and the number of positive-NeuN neurons

3 討論

本研究形態(tài)學(xué)研究觀察到,腦缺血后的海馬可見(jiàn)腫脹的神經(jīng)元、線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng),神經(jīng)髓鞘正常結(jié)構(gòu)減少或消失,可見(jiàn)部分核內(nèi)凋亡小體,TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)可見(jiàn)缺血后海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡增加,MWM實(shí)驗(yàn)觀察到大鼠長(zhǎng)時(shí)程的記憶障礙,這與Pulsinelli經(jīng)典四血管阻塞法建立全腦缺血模型后的海馬神經(jīng)元的表現(xiàn)相一致,說(shuō)明本研究改良模型可較好模擬人腦缺血后的病理生理狀態(tài),利用此方法建立大鼠短暫性全腦缺血模型是可行且可靠的。

Ca2+是神經(jīng)元最普遍的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,而鈣超載是腦缺血后導(dǎo)致細(xì)胞損傷最重要的一類(lèi)離子失衡。近年有研究認(rèn)為,位于細(xì)胞膜上的六次跨膜蛋白TRPC離子通道開(kāi)放可通透Ca2+[12]。而TRPC1是其中一類(lèi)陽(yáng)離子非選擇性鈣可通透通道,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和細(xì)胞膜上均有表達(dá),可單獨(dú)參與調(diào)控鈣內(nèi)流[12],亦可參與增殖和存活、分化、分泌和細(xì)胞遷移等功能[13]。TRPC1同聚體在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面可形成有功能的離子通道,受胞內(nèi)IP3水平的調(diào)控,參與鈣池Ca2+釋放[14]。

本研究觀察到,TRPC1可在大鼠海馬組織中廣泛表達(dá),主要表達(dá)在海馬CA1區(qū)、CA2區(qū)及CA3區(qū),腦缺血后早期海馬神經(jīng)元中TRPC1的表達(dá)有一過(guò)性升高,在3 d時(shí)達(dá)到峰值,之后逐漸下降,而神經(jīng)元中[Ca2+]i亦在3 d時(shí)到達(dá)高峰,神經(jīng)功能評(píng)分及MWM實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),腦缺血模型建立后,大鼠海馬功能受損隨時(shí)間逐漸加重,到3-5 d時(shí)學(xué)習(xí)記憶障礙明顯加重,說(shuō)明TRPC1不僅參與了腦缺血后神經(jīng)元中的鈣超載,而且可能是神經(jīng)突觸功能損傷的原因之一。本研究通過(guò)體視學(xué)分析觀察到,海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的數(shù)量隨著腦缺血的時(shí)間推移而逐漸減少,在第5天時(shí)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量達(dá)到最低,神經(jīng)元特異性表達(dá)的NeuN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)亦到最低,之后緩慢恢復(fù),進(jìn)一步通過(guò)TUNEL檢測(cè)到神經(jīng)元細(xì)胞損傷在3 d時(shí)開(kāi)始形成,凋亡神經(jīng)元數(shù)量逐漸升高,在7 d時(shí)最多,提示TRPC1引起的鈣超載可能觸發(fā)了神經(jīng)元的凋亡機(jī)制,引起細(xì)胞遲發(fā)性序貫凋亡。

SKF96365是TRPC1離子通道的阻斷劑之一[15],可抑制TRPC1離子通道的活性,減少Ca2+內(nèi)流,在體外研究中被廣泛應(yīng)用[16],本研究中通過(guò)立體定向微注射的方式將SKF96365注入側(cè)腦室,大鼠海馬CA1區(qū)TUNEL陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量在第3,5,7天顯著降低,這表明在缺血后抑制Ca2+內(nèi)流會(huì)有更多神經(jīng)元可得到存活。MWM實(shí)驗(yàn)表明,Ca2+內(nèi)流減少可部分改善大鼠空間搜索的能力。進(jìn)一步通過(guò)體視學(xué)分析發(fā)現(xiàn),SKF96365干預(yù)模型組神經(jīng)元數(shù)量在第5天時(shí)明顯較腦缺血組升高,這說(shuō)明,海馬神經(jīng)元可通過(guò)減少Ca2+內(nèi)流而得到存活,突觸功能可通過(guò)抑制TRPC1介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流而得到改善。這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相類(lèi)似[17]。因此,缺血后TRPC1介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流可能是導(dǎo)致大鼠海馬CA1區(qū)突觸功能受損的重要原因,而腦缺血后表達(dá)升高的TRPC1可能在大鼠遲發(fā)性神經(jīng)元死亡中扮演關(guān)鍵角色。

本研究功能學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在缺血后阻斷過(guò)度Ca2+內(nèi)流可改善海馬學(xué)習(xí)記憶功能,這與TRPC1依賴(lài)性的鈣庫(kù)操控性鈣內(nèi)流在亨廷頓病小鼠模型中可影響突觸穩(wěn)定性及運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)[18]相一致。文獻(xiàn)報(bào)道,TRPC1負(fù)性調(diào)控和通道的激活還可能通過(guò)阻斷小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥通路的啟動(dòng)而發(fā)揮免疫抑制活性[19],而TRPC1的缺乏還可能通過(guò)增強(qiáng)Nox4衍生的活性氧生成來(lái)加劇腦缺血/再灌注誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷[20],同時(shí)亦可通過(guò)NF-κB介導(dǎo)的TRPC1表達(dá)調(diào)控自噬來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[21]。但有文獻(xiàn)指出TRPC1蛋白缺失可導(dǎo)致小鼠紋狀體神經(jīng)元細(xì)胞凋亡以及相關(guān)蛋白質(zhì)組學(xué)改變[3],因此,TRPC1在神經(jīng)元細(xì)胞中的作用仍需深入研究。

綜上所述,本研究表明,腦缺血后大鼠海馬高表達(dá)的TRPC1在鈣超載中扮演重要角色,在此過(guò)程中,過(guò)度Ca2+內(nèi)流可被高表達(dá)的TRPC1所誘導(dǎo),從而觸發(fā)神經(jīng)元死亡的許多下游機(jī)制,TRPC1可作為腦缺血后的非興奮性中毒機(jī)制而在突觸損傷中起關(guān)鍵作用。