王淵博,田 競,朱鎔湃

(北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院綜合內(nèi)科,沈陽 110000;*通訊作者,E-mail:709639557@qq.com)

2018年中國心血管病報告,大陸地區(qū)心血管病患者約2.9億人,其中冠心病患者高達(dá)1 100萬人,統(tǒng)計結(jié)果顯示,冠心病的發(fā)病率呈上升態(tài)勢發(fā)展。對冠心病進(jìn)行對癥治療后,大部分患者暫時地脫離了生命危險,但并發(fā)癥心肌I/R損傷的發(fā)病率不斷增加。心肌I/R損傷會誘發(fā)心肌頓抑、心律失常和微循環(huán)障礙等癥狀[1],其發(fā)病機(jī)制可能與Ca2+超載、氧自由基增多、炎性因子釋放及能量代謝等因素相關(guān)。線粒體是心肌細(xì)胞的產(chǎn)能細(xì)胞器,與心肌細(xì)胞的分化和凋亡等因素直接相關(guān),還可以調(diào)控細(xì)胞的周期[2]。當(dāng)心肌發(fā)生I/R損傷后,線粒體的結(jié)構(gòu)和形態(tài)會發(fā)生改變,膜通透孔(mPTP)開放并釋放細(xì)胞色素C,誘發(fā)I/R心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡[3]。當(dāng)心肌發(fā)生I/R時,通過增加線粒體乙醛脫氫酶(ALDH2)的表達(dá)可維持線粒體膜電位,進(jìn)而減低心肌損傷[4],保護(hù)線粒體的功能及形態(tài)可能成為減輕心肌I/R損傷的一個新治療靶點。κ-OR是心肌細(xì)胞最重要的表面受體之一,激活κ-OR對I/R損傷的心肌具有一定的保護(hù)作用[5],報道指出,這種保護(hù)作用可能與缺血預(yù)處理的機(jī)制相類似[6]。研究還發(fā)現(xiàn),當(dāng)心肌發(fā)生I/R時,激活κ-OR的同時,可以活化細(xì)胞內(nèi)眾多保護(hù)心肌細(xì)胞的分子或蛋白[7],其中包括影響mPTP開放的縫隙鏈接蛋白Cx43[8],但目前激活κ-OR保護(hù)損傷心肌的全部作用機(jī)制還沒有完全被闡明,本實驗?zāi)康氖翘接懠せ瞀?OR保護(hù)I/R損傷心肌的作用是否與影響線粒體的形態(tài)及功能變化相關(guān)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物、主要試劑及儀器

20只雄性SD大鼠(8周齡、SPF級、體質(zhì)量220 g、許可證號SCXK遼2015-0001),由沈陽軍區(qū)總醫(yī)院動物實驗中心提供,κ阿片受體激動劑U50488H和κ阿片受體阻斷劑nor-BNI(美國Tocris公司),CK和LDH試劑盒(南京建成生物技術(shù)有限公司),細(xì)胞色素C抗體(美國Abcam公司),β-actin抗體(美國Cell Signaling Technology公司),VDAC1抗體(美國Cell Signaling Technology公司)山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG(中國康為世紀(jì)公司),線粒體胞質(zhì)提取試劑盒(上海碧云天公司)Western blotting配膠試劑盒(中國博士德公司),多功能酶標(biāo)儀(美國Molecular Devises公司spectra MAX-190),透射電鏡(日本電子公司JEM-1230)。

1.2 大鼠實驗分組及模型的建立

20只8周齡雄性SD大鼠隨機(jī)分成四組,每組5只,分別為對照組(sham)、缺血/再灌注組(I/R)、缺血/再灌注+κ阿片受體激動劑組(I/R+U50488H)、缺血/再灌注+κ阿片受體阻斷劑+κ阿片受體激動劑組(I/R+N+U50488H)。用3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠,連接呼吸機(jī),分別在大鼠右頸外靜脈和右頸內(nèi)動脈建立取血和給藥通道,開胸后明確冠狀動脈位置后待處理。sham組用6-0縫合線在冠脈后方穿線,但不結(jié)扎,同時以1.25 ml/kg的劑量通過頸靜脈給予生理鹽水處理,手術(shù)進(jìn)行至150 min時取材;I/R組用6-0縫合線結(jié)扎冠狀動脈30 min,隨后立即進(jìn)行心肌再灌注120 min;I/R+U50488H組在再灌注同時給予U50488H(1.25 mg/kg);I/R+N+U50488H組在給予U50488H前15 min給予nor-BNI(2 mg/kg),各組分別在實驗結(jié)束時通過頸內(nèi)動脈取血液3-5 ml,而后取心臟結(jié)扎點以下2 mm處心肌組織待實驗處理。

1.3 比色法檢測血清CK和LDH活力

CK活力測定:各組大鼠模型制作完成時,立即從頸內(nèi)動脈取血,并將各組大鼠血液在室溫下靜止1 h,靜止結(jié)束后進(jìn)行低速離心取上層血清,按照試劑盒說明書劑量分別加入1-5號試劑,搖勻后置于37 ℃水浴鍋內(nèi)靜止20 min,再加入6號試劑及待測樣本,搖勻后離心(3 500 r/min,20 min),取上層液并加入定磷劑,混勻后在45 ℃水浴鍋內(nèi)水浴15 min,雙蒸水調(diào)零,用分光光度計檢測吸光值(660 nm處1 cm光徑比色),數(shù)值代入公式計算血清CK活力。

LDH活性測定:準(zhǔn)備好血清后,按照試劑盒說明書先后加入雙蒸水、2 mmol/L標(biāo)準(zhǔn)液、待測樣本、基質(zhì)緩沖液、輔酶Ⅰ應(yīng)用液混勻后置于37 ℃水浴鍋內(nèi)靜止15 min,而后加入2,4-二硝基苯肼0.25 ml并置于37 ℃水浴鍋內(nèi)靜止15 min,加入0.4 mol/L NaOH溶液2.5 ml,混勻后室溫靜止3 min,雙蒸水調(diào)零,用分光光度計檢測吸光值(440 nm處1 cm光徑比色),數(shù)值代入公式計算血清中LDH活性。

1.4 TUNEL染色檢測心肌細(xì)胞凋亡

取各組大鼠新鮮心肌組織用生理鹽水漂洗后置于多聚甲醛中進(jìn)行固定,將固定好的組織置于石蠟中,用保溫箱進(jìn)行熱溶處理,待蠟完全侵入組織塊后冷卻蠟塊并制作組織切片。對制作好的組織切片進(jìn)行熱熔及酒精脫蠟,脫蠟后用PBS漂洗,將蛋白酶K均勻噴涂于組織切片表面并靜止30 min,靜止結(jié)束后再次漂洗組織切片并將TUNEL1、2號混合液均勻噴涂于組織切片表面靜止并60 min,上述步驟結(jié)束后對切片進(jìn)行漂洗,隨后立即噴涂DAPI染色液孵育3 min,上述操作均需避光進(jìn)行操作,最后對組織切片漂洗后噴涂防熒光淬滅封片劑,加載蓋玻片。用熒光顯微鏡拍照并統(tǒng)計分析。

1.5 透射電鏡觀察心肌細(xì)胞線粒體

各組大鼠模型制作完成后,即刻取等量心肌組織浸泡于戊二醛內(nèi)過夜,次日用磷酸緩沖液分三次漂洗戊二醛固定好的組織,每次10 min,而后分別用50%，70%，80%，90%的丙酮分別脫水兩次,每次10 min,再用100%丙酮脫水2次,每次15 min。脫水結(jié)束后用丙酮/包埋劑浸泡處理(在4 ℃冰箱內(nèi)過夜),再用純包埋劑浸泡處理(在4 ℃冰箱內(nèi)靜置過夜);最后進(jìn)行包埋,分別用純包埋劑在37 ℃和45 ℃條件下處理24 h。固化和切片,用透射電鏡進(jìn)行觀察線粒體形態(tài)并統(tǒng)計分析。

1.6 Western blot法檢測胞質(zhì)及線粒體細(xì)胞色素C

取各組大鼠相同質(zhì)量的心肌組織標(biāo)本,參照線粒體/胞質(zhì)蛋白提取試劑盒說明書提取蛋白并進(jìn)行蛋白定量。按配膠試劑盒說明書配制SDS-聚丙烯酰胺凝膠,根據(jù)蛋白定量結(jié)果,在SDS-聚丙烯酰胺凝膠各孔洞內(nèi)按照實驗分組順序進(jìn)行上樣,上樣結(jié)束后先用90 V的電壓電泳30 min,再用120 V的電壓電泳50 min,電泳結(jié)束后取出SDS-聚丙烯酰胺凝膠,用轉(zhuǎn)膜架子將其與NC膜、厚濾紙固定好并置于轉(zhuǎn)膜槽內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,電流調(diào)節(jié)為250 mA、時間為120 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用PBST對NC膜漂洗3次后,將NC膜置于10%脫脂牛奶進(jìn)行封閉1 h。封閉結(jié)束后再用PBST對固定好NC膜漂洗3次,每次5 min,將漂洗好的NC膜根據(jù)Marker標(biāo)記的位置對目的蛋白和內(nèi)參蛋白所在位置進(jìn)行裁剪,分別置于1 ∶1 000的細(xì)胞色素C一抗稀釋液內(nèi)及1 ∶1 000的內(nèi)參一抗稀釋液內(nèi)4 ℃過夜。次日取出NC膜后漂洗3次,再置于1 ∶5 000的山羊抗兔IgG或山羊抗鼠IgG抗體稀釋液中浸潤1 h,而后再次進(jìn)行漂洗,漂洗結(jié)束后開始化學(xué)發(fā)光讀取數(shù)據(jù)并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清CK和LDH檢測結(jié)果

為明確心肌I/R損傷程度,通過比色法檢測各組大鼠血清CK和LDH的含量。與sham組相比較,I/R組血清CK和LDH明顯增加(P<0.01);與I/R組相比較,I/R+U50488H組血清CK(P<0.05)和LDH(P<0.01)降低;與I/R+U50488H組相比較,I/R+N+U50488H組血清CK和LDH升高(P<0.05,見圖1)。

與sham組比較,**P<0.01;與I/R組比較,#P<0.05，##P<0.01;與I/R+U50488H組比較,△P<0.05圖1 四組大鼠血清CK和LDH的含量比較Figure 1 Comparison of serum CK and LDH levels among four groups

2.2 大鼠心肌細(xì)胞凋亡變化

為闡明激活κ-OR對各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響,利用TUNEL法檢測凋亡細(xì)胞(綠色),并利用DAPI染核(藍(lán)色),TUNEL與DAPI同時陽性表示細(xì)胞凋亡。與sham組相比較,I/R組心肌細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.01);與I/R組相比較,I/R+U50488H組心肌細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05);與I/R+U50488H組相比較,I/R+N+U50488H組心肌細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05,見圖2,3)。

2.3 透射電鏡觀察大鼠心肌線粒體變化

為明確心肌線粒體病理學(xué)變化,通過透射電鏡觀察線粒體的空泡化率及線粒體平均面積。與sham組相比較,I/R組線粒體空泡率明顯增加(P<0.01),且線粒體排列不整齊、分布雜亂,平均面積減小(P<0.01);與I/R組相比較,I/R+U50488H組線粒體空泡率降低(P<0.01),線粒體排列較整齊,平均面積相對增加(P<0.05);與I/R+U50488H組相比較,I/R+N+U50488H組線粒體空泡率增加(P<0.01),心肌線粒體損傷嚴(yán)重,平均面積減小(P<0.05,見圖4)。

圖2 不同處理后大鼠心肌細(xì)胞凋亡變化 (標(biāo)尺=20 μm)Figure 2 Changes of rat cardiomyocyte apoptosis after different treatment (scale bar=20 μm)

與sham組比較,**P<0.01;與I/R組比較,#P<0.05;與I/R+U50488H組比較,△P<0.05圖3 κ阿片受體激動劑對缺血/再灌注大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響Figure 3 Effect of κ-opioid receptor on myocardial apoptosis in I/R rats

2.4 大鼠心肌細(xì)胞質(zhì)色素C的表達(dá)情況

為明確損傷心肌線粒體是否向細(xì)胞質(zhì)內(nèi)釋放細(xì)胞色素C,通過Western blot實驗分別檢測線粒體內(nèi)和胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞色素C含量。與sham組相比較,I/R組心肌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞色素C顯著升高(P<0.01);與I/R組相比較,I/R+U50488H組心肌細(xì)胞漿內(nèi)細(xì)胞色素C相對降低(P<0.01);與I/R+U50488H組相比較,I/R+N+U50488H組心肌細(xì)胞漿細(xì)胞色素C升高(P<0.05,見圖5)。

3 討論

冠心病(CHD)已經(jīng)成為危害人類生命安全和健康的重要疾病之一,我國CHD發(fā)病率連年不斷攀升,隨著介入手術(shù)和溶栓治療技術(shù)的不斷完善和提高,急性冠心病的病死率得到有效遏制,但并發(fā)癥心肌I/R損傷確成為了影響患者生存質(zhì)量的重要因素之一。所以,積極有效地探討心肌I/R損傷的發(fā)病機(jī)制及防治措施具有重要的研究意義。

κ-OR廣泛存在于機(jī)體之中,是目前發(fā)現(xiàn)最豐富的細(xì)胞表面受體之一,激活κ-OR在鎮(zhèn)痛、神經(jīng)內(nèi)分泌及免疫調(diào)節(jié)領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用[9],在其被發(fā)現(xiàn)以來,已經(jīng)陸續(xù)被應(yīng)用到多種藥物作用的靶點。近年來研究發(fā)現(xiàn),激活κ-OR對心肺系統(tǒng)具有一定的保護(hù)作用[10,11],研究認(rèn)為這種保護(hù)作用來源于多種分子機(jī)制,包括縫隙鏈接蛋白(Cx43)、eNOS、自噬等,但激活κ-OR對心肌的保護(hù)作用是否與心肌線粒體相關(guān)目前并不完全明確。

與sham組比較,**P<0.01;與I/R組比較,##P<0.01,#P<0.05;與I/R+U50488H組比較,△P<0.05,△△P<0.01圖4 大鼠心肌線粒體變化透射電鏡結(jié)果 (標(biāo)尺=1 μm)Figure 4 Changes of myocardial mitochondria in rats by transmission electron microscopy (scale bar=1 μm)

與sham組比較,**P<0.01;與I/R組比較,##P<0.01;與I/R+U50488H組比較,△P<0.05圖5 κ阿片受體激動劑對大鼠心肌細(xì)胞色素C表達(dá)的影響Figure 5 Effect of κ-opioid receptor on expression of cytochrome C in rat myocardium

線粒體是心肌細(xì)胞的重要細(xì)胞器之一,主要起到為心肌細(xì)胞提供能量的作用,其形態(tài)的完整性是線粒體生存的基礎(chǔ),當(dāng)線粒體受到外界損傷刺激時,線粒體形態(tài)及功能會發(fā)生相應(yīng)的改變,包括線粒體內(nèi)部會出現(xiàn)空泡、線粒體脊結(jié)構(gòu)改變等,還可導(dǎo)致線粒體分裂[12],進(jìn)而誘發(fā)線粒體功能紊亂、凋亡及自噬的增加。線粒體受到外界刺激發(fā)生損傷后,會發(fā)生膜電位降低、線粒體膜通透孔(mPTP)開放[4]等現(xiàn)象,隨后線粒體會通過mPTP向胞質(zhì)釋放caspase家族蛋白及凋亡因子細(xì)胞色素C等[13],誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡。同時線粒體還會發(fā)生氧化磷酸化解耦連,ATP合成減弱,誘發(fā)心肌細(xì)胞壞死增加,可進(jìn)一步地加重心肌I/R損傷,影響心肌功能[14]。

本實驗針對I/R損傷后的心肌細(xì)胞及心肌線粒體進(jìn)行了相關(guān)實驗研究,結(jié)果顯示,與sham組相比較,當(dāng)心肌發(fā)生I/R損傷后,通過分析大鼠血清發(fā)現(xiàn),心肌損傷標(biāo)志物CK和LDH均發(fā)生了顯著的增加(P<0.01);通過心肌TUNEL染色實驗發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞凋亡率也明顯增加(P<0.01);利用透射電鏡觀察各組大鼠心肌線粒體形態(tài)發(fā)現(xiàn),I/R損傷后的心肌線粒體發(fā)生了明顯的形態(tài)學(xué)變化,大部分線粒體內(nèi)部出現(xiàn)了空泡化現(xiàn)象(P<0.01),且線粒體內(nèi)部結(jié)構(gòu)紊亂,線粒體之間排列不整齊,散在分布于肌纖維之間,且平均面積減小(P<0.01),可以推測大部分線粒體發(fā)生了分裂;通過Western blot實驗觀察到,I/R損傷發(fā)生后,胞質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞色素C含量明顯增加,而線粒體內(nèi)部分細(xì)胞色素C表達(dá)降低(P<0.01),結(jié)果表明心肌發(fā)生I/R損傷后,線粒體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,同時線粒體會向細(xì)胞質(zhì)內(nèi)釋放大量的細(xì)胞色素C,線粒體結(jié)構(gòu)功能的紊亂可能是進(jìn)一步增加心肌損傷的直接因素。在使用κ-OR激動劑U50488H激活細(xì)胞表面κ-OR后,與I/R組相比較,I/R+U組上述現(xiàn)象均得到了一定的改善,檢測結(jié)果顯示血清CK降低(P<0.05)、LDH亦降低(P<0.01)、心肌細(xì)胞凋亡率下降(P<0.05)。結(jié)果表明I/R+U組心肌損傷程度相對I/R組降低。利用透射電鏡觀察到I/R+U組線粒體空泡現(xiàn)象減少(P<0.01)，同時線粒體平均面積相對增加(P<0.05)；Western blot實驗觀察到線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C含量相對增加,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞色素C含量相對降低,結(jié)果表明激活κ-OR后,線粒體結(jié)構(gòu)和功能相對得到了改善,減少了誘發(fā)心肌細(xì)胞損傷的相關(guān)因素。結(jié)果還顯示,U50488H對心肌及線粒體的上述作用可以被κ-OR阻斷劑nor-BNI所阻斷。

綜上所述,本研究表明當(dāng)心肌發(fā)生I/R損傷后,通過U50488H激活κ-OR可以保護(hù)心肌線粒體,同時降低心肌的損傷程度,所以激活κ-OR對心肌的這種保護(hù)作用可能與保護(hù)線粒體相關(guān),其相關(guān)作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實,該實驗觀點可能成為臨床治療心肌I/R損傷的新方法。