許存庚,駱玉霜

(1青海大學附屬醫(yī)院藥劑科,青海 810000;2青海大學附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科)

胃癌發(fā)病率在我國居于第二,胃癌早期患者臨床癥狀不明顯,診斷率較低,大多數(shù)患者中晚期確診,且經(jīng)手術切除治療后,仍有一部分患者死于復發(fā)、轉移,病死率較高,嚴重威脅人類的健康[1]。順鉑是胃癌晚期患者化療的基本藥物,抗癌作用較強,但存在耐藥性,單獨使用有效率僅為20%[2]。藏紅花為臨床常用跌打損傷藥物,研究顯示其粗提取物藏紅花素有較強的抗腫瘤活性,對血液腫瘤、軟組織腫瘤以及其他惡性腫瘤均具有較強的抑制作用,且毒副作用較弱,與化療藥物聯(lián)合后可提高療效[3,4]。本研究通過體外培養(yǎng)胃癌細胞BGC-823并給予藏紅花素聯(lián)合順鉑處理,以探究藏紅花素聯(lián)合順鉑對胃癌細胞增殖、凋亡的影響以及可能的作用機制,為胃癌的治療提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞

胃癌細胞BGC-823購于中國科學院細胞生物研究所,凍存于本院-80 ℃冰箱中。

1.2 試劑與儀器

藏紅花素(批號:20170513)、順鉑(批號:20170427)均購于美國Sigma公司;胰蛋白酶、胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基均購于美國Gibco BRL公司;青霉素、鏈霉素購于杭州碧云天公司;Annexin Ⅴ、碘化丙啶(propidium iodide,PI)、四甲基偶氮畔藍(MTT)均購于BD Pharmingen公司;超敏ECL發(fā)光蛋白購自于美國Thermo Fisher公司;BCA檢測試劑盒、PVDF膜購于美國Millipore公司;Anti-p-細胞外調節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase 1/2,ERK1/2)、Anti-Bcl-2、Anti-Bax、Anti-Bcl-2、Anti-cleaved-caspase3、Anti-β-Actin購自美國Cell Signaling公司;HRP標記IgG購自于Santa Cruz公司;RNA提取試劑盒購于Invitrogene公司;RNA反轉錄試劑盒購于日本Takara公司;ERK抑制劑PD098059購于MedChemExpress公司;酶標儀購于美國Thermo公司;流式細胞儀購于美國BD公司;凝膠圖像分析儀英國Alpha公司;垂直電泳儀美國Bio-RAD公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) 從-80 ℃中取出冰凍BGC-823細胞,37 ℃解凍后加入胰蛋白酶液消化,制備單細胞懸浮液,細胞數(shù)目調整為1×106/ml接種于含10%FBS、雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)液,置于37 ℃、5% CO2的潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細胞鋪滿瓶底80%時,添加2%胰酶消化,行傳代培養(yǎng)。

1.3.2 細胞處理及分組 實驗一:取對數(shù)期生長細胞,分為空白組、藏紅花素組、順鉑組、藏紅花素+順鉑組。空白組細胞不進行任何處理,藏紅花素組細胞中添加含8 mg/ml藏紅花素培養(yǎng)液處理,順鉑組細胞中添加0.8 μg/ml順鉑處理;藏紅花素+順鉑組細胞中同時添加0.8 μg/ml順鉑與8 mg/ml藏紅花素培養(yǎng)液,以上四組細胞處理后均培養(yǎng)48 h。

實驗二:取對數(shù)期生長細胞,分為空白組、藏紅花素+順鉑組、ERK抑制劑組,藏紅花素+順鉑+抑制劑組(聯(lián)合組)?？瞻捉M細胞不進行任何處理,藏紅花素+順鉑組細胞培養(yǎng)液中添加0.8 μg/ml順鉑與8 mg/ml藏紅花素,抑制劑組添加20 μmol/L PD098059;聯(lián)合組細胞培養(yǎng)液中依次添加20 μmol/L PD098059、0.8 μg/ml順鉑、8 mg/ml藏紅花素;四組細胞處理后均繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3.3 MTT檢測細胞增殖情況 收集1.3.2中實驗一及實驗二細胞,消化后制備細胞懸液,濃度調整為1×104個/ml接種96孔板,設定6個平行孔,重復3次,各組細胞分別培養(yǎng)24,36,48,72 h,在避光條件下加入10 μl MTT溶液,置于37 ℃,5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h,取出細胞培養(yǎng)板,棄去每孔培養(yǎng)液,每孔加入150 μl二甲基亞砜溶液,振蕩10 min,使紫色結晶物完全溶解。使用酶標儀于570 nm波長下測定每孔吸光值。細胞增殖抑制率(%)=(空白組吸光度-實驗組吸光度)/空白組吸光度×100%。每個濃度設置6個重復組,實驗重復3次。

1.3.4 免疫印跡法(Western blot,WB)檢測BGC-823細胞中ERK1/2、p-ERK1/2表達及凋亡蛋白表達情況 收集1.3.2中實驗二細胞,添加細胞裂解液裂解BGC-823細胞,參照蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白,BCA法測定蛋白濃度,統(tǒng)一上樣20 μg總蛋白,加熱煮沸、離心后行SDS-PAGE電泳,結束后將蛋白凝膠轉移至PVDF膜上,于半干轉膜儀冰上行轉膜反應,滴加Anti-ERK1/2(1 ∶1 000)、Anti-p-ERK1/2抗體(1 ∶1 000),4 ℃孵育過夜,添加二抗(1 ∶2 000)37 ℃孵育1 h。加入ECL發(fā)光劑顯影后,置于凝膠成像儀中保存圖像。采用Gel-Pro analyzer4軟件對圖片蛋白條帶進行掃描,分析p-ERK1/2、ERK1/2的表達水平,并檢測細胞中Bax、cleaved-caspase3、Bcl-2(抗體均為1 ∶5 000)蛋白表達情況。

1.3.5 Hoechst33258染色觀察細胞形態(tài)變化 收集1.3.2中實驗二細胞,接種4×104個細胞至蓋玻片的6孔板內(nèi),將細胞培養(yǎng)在培養(yǎng)皿或平板上,待80%細胞融合后,舍棄培養(yǎng)液,將蓋玻片4%多聚甲醛過夜固定預冷PBS溶液清洗3次后,添加5 μg/ml的Hoechst 33258染液,室溫下避光孵育15 min,PBS清洗3次后,置于高內(nèi)涵活細胞成像儀中觀察BGC-823細胞形態(tài)變化。

1.3.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集1.3.2中實驗二細胞,添加PBS溶液清洗2次,加入0.2%胰酶溶液消化PBS溶液洗滌2次后,3 000 r/min離心5 min后,收集細胞,添加上樣緩沖液,細胞密度調整為5×105/ml。先后添加5 μl Annexin-Ⅴ-FITC染液及PI染液,室溫下避光孵育20 min,流式細胞儀中分析細胞凋亡情況。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 藏紅花素聯(lián)合順鉑對細胞增殖抑制率的影響

與空白組相比,藏紅花素組、順鉑組、藏紅花素組+順鉑組24,36,48,72 h細胞增殖抑制率均顯著升高(P<0.05),與藏紅花素組、順鉑組相比,藏紅花素+順鉑組于24,36,48,72 h細胞增殖抑制率均顯著升高(P<0.05,見表1)。

2.2 藏紅花素聯(lián)合順鉑對胃癌細胞增殖抑制率的影響

與空白組相比,藏紅花素+順鉑組、抑制劑組24,36,48,72 h細胞增殖抑制率均顯著升高(P<0.05),與藏紅花素組+順鉑組相比,聯(lián)合組增殖抑制率顯著升高(P<0.05,見表2)。

組別抑制率(%) 24 h36 h48 h72 h空白組0.08±0.020.05±0.01△0.06±0.020.07±0.02藏紅花素組6.85±0.53?7.38±0.19?△8.16±0.34?△★9.35±0.17?△★▲順鉑組7.24±0.75?7.42±0.25?8.59±0.16?△★9.67±0.21?△★▲藏紅花素+順鉑組13.39±1.58#15.66±2.15#17.42±2.23#△19.48±1.76#△★

與空白組比較,*P<0.05;與藏紅花素+順鉑組比較,#P<0.05;與24 h比較,△P<0.05;與36 h比較,★P<0.05;與48 h比較,▲P<0.05

組別抑制率(%) 24 h36 h48 h72 h空白組0.07±0.010.04±0.010.05±0.010.06±0.02藏紅花素+順鉑組10.34±0.49?13.14±0.72?15.43±1.24?17.26±1.18?抑制劑組9.47±0.83?12.63±0.93?14.32±1.82?16.78±1.23?聯(lián)合組17.42±2.19#20.36±2.43#23.29±2.16#25.48±1.64#

與空白組比較,*P<0.05;與藏紅花素+順鉑組、抑制劑組比較，#P<0.05;抑制劑組為ERK抑制劑(20 μmol/L PD098059),聯(lián)合組為藏紅花素+順鉑+抑制劑

2.3 各組ERK蛋白表達情況

與空白組相比,藏紅花素+順鉑組、抑制劑組p-ERK1/2蛋白相對表達均顯著降低(P<0.05),與藏紅花素組+順鉑組相比,聯(lián)合組p-ERK1/2蛋白相對表達顯著降低(P<0.05)。各組ERK1/2蛋白表達無顯著變化(P>0.05,見圖1,表3)。

1.空白組;2.藏紅花素+順鉑組;3.抑制劑組;4.聯(lián)合組圖1 藏紅花素+順鉑對ERK蛋白表達的影響Figure 1 Effect of crocin combined with cisplatin on expression of ERK protein in gastric cancer cells

組別ERK1/2p-ERK1/2 空白組0.85±0.091.09±0.13 藏紅花素+順鉑組0.84±0.080.67±0.08? 抑制劑組0.86±0.090.41±0.06? 聯(lián)合組0.85±0.060.25±0.04?#

與空白組比較,*P<0.05;與藏紅花素+順鉑組、抑制劑組比較,#P<0.05

2.4 各組細胞形態(tài)變化情況

空白組細胞形態(tài)無明顯變化,藏紅花素+順鉑組、抑制劑組細胞漿、細胞核濃縮,且細胞核破碎,聯(lián)合組破碎程度最明顯,較正常細胞熒光強度高,死亡細胞數(shù)量增多(見圖2)。

圖2 Hoechst33258染色觀察藏紅花素+順鉑組、抑制劑組和聯(lián)合組細胞形態(tài)變化 (×200)Figure 2 Morphological changes in crocin+cisplatin group, inhibitor group and combination group by Hoechst 33258 staining (×200)

2.5 藏紅花素聯(lián)合順鉑對胃癌細胞凋亡率的影響

與空白組相比,藏紅花素+順鉑組、抑制劑組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05),與藏紅花素+順鉑組、抑制劑組相比,聯(lián)合組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05,見圖3,表4)。

圖3 流式細胞儀檢測空白組、藏紅花素+順鉑組、抑制劑組和聯(lián)合組細胞凋亡情況Figure 3 Apoptosis in blank group, crocin+cisplatin group, inhibitor group and combination group by flow cytometry

組別凋亡率(%)空白組5.69±0.51藏紅花素+順鉑組41.41±2.68?抑制劑組43.47±3.06?聯(lián)合組73.12±5.17#

與空白組比較,*P<0.05;與藏紅花素+順鉑組、抑制劑組比較,#P<0.05

2.6 各組凋亡蛋白表達情況

與空白組相比,藏紅花素+順鉑組、抑制劑組Bax、cleaved-caspase3蛋白表達顯著升高,Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.05),與藏紅花素組+順鉑組相比,聯(lián)合組Bax、cleaved-caspase3蛋白表達顯著升高,Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.05,見圖4,表5)。

1.空白組;2.藏紅花素+順鉑組;3.抑制劑組;4.聯(lián)合組圖4 Western blot檢測Bax、cleaved-caspase3、Bcl-2蛋白表達Figure 4 Expression of Bax, cleaved-caspase 3, Bcl-2 protein expression by Western blot

組別BaxBcl-2cleaved-caspase3空白組0.32±0.040.88±0.050.17±0.04藏紅花素+順鉑組0.64±0.07?0.71±0.06?0.45±0.03?抑制劑組0.66±0.15?0.68±0.04?0.49±0.06?聯(lián)合組1.13±0.12#0.25±0.03#0.85±0.07#

與空白組比較,*P<0.05;與藏紅花素+順鉑組、抑制劑組比較,#P<0.05

3 討論

胃癌是臨床常見惡性腫瘤,臨床主要采用手術結合放化療治療,順鉑為常用化療藥物,但耐藥性較高,因此臨床療效有限,需結合其他藥物以提高治療效果[5]。以往臨床采用藥物逆轉腫瘤耐藥性,如免疫抑制劑、鈣通道阻斷劑、類固醇等,但由于以上藥物并非特異性藥物,用藥劑量較大,毒副作用較大,因此臨床應用受限[6,7]。藏紅花素為藏紅花主要活性單體成分,具有較強抗腫瘤活性,對結腸癌、胃癌、卵巢癌等具有一定的抑制作用[8],然而藏紅花素聯(lián)合順鉑后是否可增強胃癌細胞的抑制作用,目前研究不多,因此探究兩者聯(lián)合應用對胃癌的影響,對于胃癌的藥物治療十分重要。

大量研究[9]顯示藏紅花素能夠抑制腫瘤細胞增殖,動物研究顯示前列腺癌小鼠給予藏紅花素治療后,體內(nèi)腫瘤生長速度明顯降低,生存期得到延長。胰腺癌中研究[10]發(fā)現(xiàn)藏紅花素對人HPAC細胞具有一定的抑制作用,且可誘導細胞凋亡。本研究結果顯示與空白組相比,藏紅花素處理組胃癌細胞BGC-823增殖抑制率明顯升高,流式細胞術檢測顯示細胞凋亡率升高,提示藏紅花素處理可抑胃癌細胞增殖誘導其凋亡。

藏紅花素聯(lián)合其他抗癌藥物治療后能夠改善臨床療效[11]。張珞等[12]研究顯示藏紅花素可提高肺腺癌細胞對順鉑、培美曲塞化療敏感性。此外還有研究顯示藏紅花素聯(lián)合順鉑后能夠提高對胃癌細胞的抑制作用,增強對胃癌細胞的誘導作用[13]。本研究結果顯示與藏紅花素組、順鉑組相比,藏紅花素+順鉑組細胞抑制率明顯升高,且凋亡率也明顯升高,推測與單獨采用藏紅花素組、順鉑組相比,藏紅花素+順鉑組可增強胃癌細胞的抑制、促凋亡作用。

目前對于藏紅花素抗腫瘤機制研究較多,如通過抑制腫瘤細胞增殖、促進其凋亡以及其他信號轉導途徑等發(fā)揮抗增殖、促凋亡作用[14],但目前其具體作用機制尚未得到證實。MAPK信號通路是將細胞外刺激傳遞至細胞內(nèi)反應的重要信號轉導途徑,主要參與腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡,尤其在惡性腫瘤細胞的增殖、凋亡中發(fā)揮重要的作用。MAPK信號通路主要包括ERK、JNK/SAPK、P38、BMK1/ERK5四條通路,其中ERK目前研究最多,與癌癥發(fā)生、發(fā)展密切相關,較多研究顯示ERK信號通路參與胃癌細胞的凋亡、侵襲過程[15]。p-ERK為ERK的活化形式,ERK磷酸化活性增強后轉化為p-ERK,可促進癌癥相關基因以及細胞周期調節(jié)基因的轉錄和表達,從而參與細胞的生長發(fā)育、增殖凋亡及分化和惡性轉化,持續(xù)激活ERK信號通路可促進正常細胞向腫瘤型轉化,而抑制ERK信號傳導通路則能促使腫瘤細胞慢慢恢復到非轉化型。金子等[16]研究顯示,姜黃素通過抑制ERK信號通路的活化,進而抑制腫瘤細胞的增殖,誘導其凋亡。漆黃素通過調控ERK信號通路誘導人宮頸癌細胞凋亡[17]。以上研究均提示ERK信號通路與癌細胞的增殖、凋亡相關。

本研究顯示與藏紅花素+順鉑組、ERK抑制劑組相比,聯(lián)合組細胞抑制率、凋亡率進一步降低,表明聯(lián)合處理后可進一步降低細胞增殖、誘導其凋亡,這可能與阻斷MAPK/ERK信號通路活性有關,結合過往研究推測藏紅花素+順鉑可能通過抑制ERK信號通路發(fā)揮腫瘤抑制、凋亡作用。

Bcl-2表達上調可抑制Bax的作用,從而促使Bax/Bax同源二聚體解離,形成穩(wěn)定的Bcl-2/Bax異二聚體,達到抗凋亡的作用。當Bax表達上調后,Bax/Bax同源二聚體將會增多,而線粒體通透性將會增加,進而促使細胞色素C釋放,激活caspase家族,促進凋亡[18]。本研究顯示與藏紅花素組+順鉑組、抑制劑組相比,聯(lián)合組Bax、cleaved-caspase3蛋白表達顯著升高,Bcl-2蛋白表達顯著降低,推測藏紅花素+順鉑組可上調Bax表達促進Caspase3活化,進而誘導細胞凋亡。

綜上所述,藏紅花素聯(lián)合順鉑可抑制胃癌細胞的增殖、促進其凋亡;其作用機制可能與抑制ERK信號通路,上調凋亡蛋白表達有關,然而胃癌細胞增殖、凋亡機制較復雜,是否還通過其他通路發(fā)揮作用,這還有待后續(xù)深入研究。