王小琴,鄒玉安,薛 茜,常 青,孫 炎

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,張家口 075000;*通訊作者,E-mail:baiyitiansho@163.com)

缺血性腦血管病具有發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高、致殘率高、致死率高等特點(diǎn),嚴(yán)重危害了人類的健康和生命,因此它的防治逐漸引起了全球關(guān)注。早在1990年,Kitagawa等[1]首次發(fā)現(xiàn)在沙鼠全腦缺血之前給予一個短暫輕微的腦缺血可以減輕神經(jīng)損傷,隨后該發(fā)現(xiàn)引起了全球廣泛的關(guān)注,這種預(yù)先給予的輕微缺血被稱為缺血預(yù)處理。隨后大家發(fā)現(xiàn)這種缺血預(yù)處理的保護(hù)現(xiàn)象存在于多種器官如心臟、肝臟、腎臟等[2-4]。但由于腦缺血預(yù)處理操作復(fù)雜,臨床應(yīng)用價(jià)值不大,而后續(xù)大量實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)間斷的給予遠(yuǎn)端肢體數(shù)次輕微的、亞致死性的缺血即肢體缺血預(yù)處理(limb ischemic preconditioning,LIP),同樣可以預(yù)先調(diào)動內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制來減輕之后更嚴(yán)重缺血缺氧損傷的過程[5-7],但到目前為止LIP具體的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制仍不明確。

大量研究認(rèn)為,腦缺血再灌注損傷的機(jī)制包括興奮性氨基酸毒性、自由基損傷、炎癥反應(yīng)、Ca2+內(nèi)流、誘導(dǎo)凋亡等多種途徑實(shí)現(xiàn)的,并且各途徑相互作用形成一個非常復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng),最終結(jié)果是神經(jīng)細(xì)胞的死亡[8]。近年來研究發(fā)現(xiàn),炎癥反應(yīng)包括上游轉(zhuǎn)錄因子的激活和下游炎癥因子的釋放,在缺血再灌注損傷中起關(guān)鍵性作用[9]。其中核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB信號通路是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的經(jīng)典通路。腦缺血再灌注損傷后可以活化NF-κB,進(jìn)而促進(jìn)多種炎癥因子如TNF-α、IL-6的大量表達(dá),加重炎癥反應(yīng),而TNF-α、IL-6的產(chǎn)生又可以反過來進(jìn)一步激活更多NF-κB的表達(dá),進(jìn)一步損傷腦組織。本研究主要觀察LIP是否通過抑制NF-κB信號通路、降低TNF-α、IL-6炎癥因子的含量來減輕缺血再灌注損傷,探討LIP誘導(dǎo)內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)的機(jī)制,為缺血性和缺氧性腦病的臨床防治提供有效的策略。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

雄性SD大鼠(14-16周齡)PF/UAF級,體質(zhì)量(260±15)g,由北京華阜康生物科技股份有限公司提供,許可證號:SCXX(京)2014-0004。動物被隨機(jī)分為3組,sham組(n=12),I/R組(n=36),LIP+I/R組(n=36),后兩組又分為1,3,7 d亞組,每組12只,其中4只用于腦梗死體積測定,4只用于腦組織細(xì)胞形態(tài)觀察及NF-κB/p65表達(dá)檢測,4只用于TNF-α和IL-6含量測定,本實(shí)驗(yàn)共使用96只大鼠,剔除造模過程中死亡和造模不成功的大鼠,最終保證各時(shí)間點(diǎn)12只大鼠。

1.2 主要試劑與儀器

兔抗大鼠NF-κB/p65抗體、山羊抗兔SP試劑盒(IgG抗體)、DAB顯色盒(美國Santa Cruz公司);氯化-2,3,4-三苯基四氮唑(TTC)染色試劑(美國Amresco公司),TNF-α、IL-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(南京建成科技有限公司)。Safire2全波長多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan);栓線(北京西濃科技有限公司);生物組織脫水機(jī)(美國Thermo)。

1.3 大腦中動脈阻塞模型及肢體缺血模型制作

sham組:將雙側(cè)頸總動脈分離干凈并暴露;I/R模型組:根據(jù)Zea-Longa的方法[10]建立右側(cè)大腦中動脈阻塞(MCAO)模型;LIP+I/R組:將SD大鼠腹腔麻醉后仰臥固定于手術(shù)臺上,在兩側(cè)股三角處剪毛消毒行縱行切口鈍性分離雙側(cè)股動脈,用動脈夾將雙側(cè)股動脈同時(shí)夾閉10 min,隨后移去動脈夾恢復(fù)股動脈血流10 min,共進(jìn)行3次,完畢后30 min,再行右側(cè)大腦中動脈(MCAO)模型,方法同上。

1.4 神經(jīng)功能缺損評分

在術(shù)后24 h,大鼠清醒狀態(tài)下按照Zea Longa 5級評分法[10]進(jìn)行評定。評分標(biāo)準(zhǔn):0分,無明顯神經(jīng)損害癥狀;1分,無對側(cè)前爪完全伸展;2分,行走時(shí)對側(cè)旋轉(zhuǎn);3分,行走時(shí)偏斜;4分,不能自主行走?；杳运劳稣咛蕹龑?shí)驗(yàn)。

1.5 TTC染色法測定腦梗死體積

分別在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相應(yīng)時(shí)間點(diǎn),10%的水合氯醛(350 mg/kg)腹腔麻醉大鼠,迅速斷頭取腦,沿冠狀面切成5片,每片厚約2 mm,迅速浸入2%的TTC磷酸鹽緩沖液中,37 ℃水浴箱避光孵育30 min,均勻染色后,丟棄TTC,將腦片放入4%多聚甲醛中,放入4 ℃冰箱中固定24 h,逐層拍照:按公式[(各片正反面梗死面積之和/2×片厚)/(各片正反面總面積之和/2×片厚)×100%]計(jì)算梗死體積占所取腦組織體積的百分比。

1.6 光鏡下觀察腦組織細(xì)胞形態(tài)

將多聚甲醛固定好腦組織切片進(jìn)行包埋并制成蠟塊,再切成4 μm厚度的腦組織石蠟切片。石蠟切片按HE染色步驟經(jīng)脫蠟、脫水、染色、沖洗、中性樹膠封片,光鏡下觀察腦組織細(xì)胞形態(tài)。

1.7 免疫組織化學(xué)檢測NF-κB/p65的表達(dá)

腦組織切片經(jīng)脫蠟、脫水、PBS反復(fù)沖洗,進(jìn)行抗原修復(fù),3% H2O2封閉,10%山羊血清孵育20 min,后加去山羊血清加入一抗工作液,放于4 ℃冰箱過夜;第二天復(fù)溫20 min,移去一抗,PBS液沖洗3次,每張切片滴加二抗(山羊抗兔IgG),室溫孵育20 min,PBS液反復(fù)沖洗3次,甩去PBS液,每張切片滴加DAB顯色,脫水透明封片。鏡下觀察并拍照,NF-κB/P65陽性細(xì)胞的胞核部分和胞質(zhì)部分呈現(xiàn)出棕黃色顆粒。記錄NF-κB/P65陽性細(xì)胞占整個視野的比例,采用Image-Pro plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行分析。

1.8 ELISA檢測缺血區(qū)腦組織TNF-α、IL-6含量

在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相應(yīng)時(shí)間位點(diǎn),分別將大鼠麻醉后,迅速冰盤上斷頭取腦,稱重,加入1 ∶9倍量的0-4 ℃生理鹽水,在冰水浴上機(jī)械勻漿得10%腦組織勻漿,將腦勻漿在4 ℃條件下以3 500 r/min低溫離心15 min,取上清置于-80 ℃冰箱備用,用于TNF-α、IL-6的測定。具體方法參照試劑盒說明。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,數(shù)值變量資料分析采用單因素方差分析(one-way ANOVA),實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。方差齊時(shí)組間兩兩比較采用最小顯著差LSD檢驗(yàn),方差不齊時(shí)采用Tamhane’sT2法檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能損傷評分結(jié)果

在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)各時(shí)間點(diǎn),sham組無神經(jīng)功能損傷癥狀,LIP+I/R組和I/R組大鼠分別出現(xiàn)不同程度神經(jīng)功能缺失癥狀,LIP+I/R組Longa評分較I/R組明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表1)。

2.2 各組大鼠腦梗死體積測定結(jié)果

在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)各時(shí)間點(diǎn),sham組腦組織無梗死病灶,各時(shí)間點(diǎn)LIP+I/R組腦梗死體積均較I/R組明顯縮小(P<0.01,見表2)。

表1 大鼠缺血再灌注各時(shí)間點(diǎn)的Longa評分

Table 1 The Longa scores in rats at each time point after cerebral ischemia reperfusion

組別第1天 第3天 第7天 sham組0 0 0 I/R組2.72±0.43?2.83±0.46?2.62±0.51?LIP+I/R組1.72±0.41?#1.82±0.56?#1.69±0.43?#

與sham組比較,*P<0.05;與I/R組比較,#P<0.05

表2 各組大鼠缺血再灌注各時(shí)間點(diǎn)的腦梗死體積(n=4,%)

Table 2 Cerebral infarct volume in rats at different time after cerebral ischemia(n=4, %)

組別第1天 第3天 第7天 sham組0 0 0 I/R組25.76±1.32??44.90±3.43??41.21±3.98??LIP+I/R組20.84±1.74?#38.17±1.85?#35.60±1.86?#

與sham組比較,*P<0.05,**P<0.01;與I/R組比較,#P<0.05

2.3 腦組織病理學(xué)變化

光鏡下,sham組海馬區(qū)神經(jīng)元排列整齊,細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,胞質(zhì)豐富,胞核飽滿,核膜、核仁清晰,無明顯腫脹、細(xì)胞核固縮、碎裂現(xiàn)象;I/R組腦組織梗死區(qū)細(xì)胞排列紊亂,細(xì)胞體積明顯縮小,大量細(xì)胞的胞核固縮、碎裂,組織間蒼白、水腫,幾乎觀察不到正常組織結(jié)構(gòu);LIP+I/R組可見細(xì)胞排列較規(guī)則,細(xì)胞損傷程度較輕,部分細(xì)胞有體積縮小、細(xì)胞核固縮、核碎裂等現(xiàn)象,但與I/R組相比,細(xì)胞變性死亡數(shù)量明顯減少(見圖1)。

A.sham組 B.I/R組再灌24 h C.LIP+I/R組再灌24 h圖1 HE法染色后光鏡下觀察大鼠腦組織病理變化 (HE,×400)Figure 1 Histopathological changes of rat brain under light microscope after HE staining (HE,×400)

2.4 免疫組織化學(xué)檢測腦組織NF-κB/P65陽性細(xì)胞

sham組可見極少量NF-κB/P65陽性細(xì)胞表達(dá);與sham組比較,LIP+I/R組和I/R組NF-κB/P65陽性細(xì)胞表達(dá)百分比明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);LIP+I/R組較I/R組NF-κB/P65的表達(dá)百分比有所下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖2、表3)。

A.sham組 B.I/R組 C.LIP+I/R組圖2 免疫組化法檢測大鼠腦組織NF-κB/p65的表達(dá) (×400)Figure 2 The expression of NF-κB/p65 in brain tissue of rats by immunohistochemistry (×400)

表3 大鼠缺血再灌注各時(shí)間點(diǎn)的腦組織NF-κB/P65表達(dá)(n=4,%)

Table 3 Expressions of NF-κB/P65 in brain tissue of rats at each time point after ischemia-reperfusion(n=4,%)

組別第1天 第3天 第7天 sham組 4.23±1.01 5.42±1.78 3.99±0.92I/R組59.76±1.32??67.21±13.21??62.76±16.28??LIP+I/R組36.48±9.27??#40.92±10.25??#34.38±8.66??#

與sham組比較,**P<0.01;與I/R組比較,*P<0.05

2.5 腦組織TNF-α、IL-6含量的變化

與sham組比較,LIP+I/R組和I/R組TNF-α、IL-6的含量第1天開始升高(P<0.05),第3天達(dá)高峰,第7天仍高于正常水平,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與I/R組比較,LIP+I/R組各時(shí)間點(diǎn)TNF-α、IL-6的含量均明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表4,5)。

表4 大鼠缺血再灌注各時(shí)間點(diǎn)腦組織中TNF-α的含量(ng/L,n=6)

Table 4 Comparison of content of brain TNF-α in rats among all groups(ng/L,n=6)

組別第1天 第3天 第7天 sham組 84.45±15.54 83.76±15.90 85.34±16.65I/R組112.53±22.32?157.76±28.87?118.12±19.76?LIP+I/R組104.87±22.38?#138.04±25.65?#103.40±14.35?#

與sham組比較,*P<0.05;與I/R組比較,#P<0.05

表5 大鼠缺血再灌注各時(shí)間點(diǎn)腦組織中IL-6的含量(ng/L,n=6)

Table 5 Comparison of content of brain IL-6 in rats among all groups(ng/L,n=6)

組別第1天第3天第7天sham組11.09±1.6310.16±2.0811.16±2.08I/R組25.61±3.50?16.98±2.98?15.32±2.61?LIP+I/R組19.05±2.79?#15.74±2.83?#13.84±2.14?#

與sham組比較,*P<0.05;與I/R組比較,#P<0.05

3 討論

LIP作為一種新的腦保護(hù)方法已經(jīng)被大量實(shí)驗(yàn)證實(shí),Ren等[11]發(fā)現(xiàn)單次肢體缺血預(yù)處理可提供短期保護(hù),但在再灌注14 d內(nèi),聯(lián)合反復(fù)遠(yuǎn)端預(yù)處理可以明顯改善腦缺血再灌注損傷,但遠(yuǎn)端肢體與大腦相距離較遠(yuǎn),其保護(hù)機(jī)制仍然不清楚,目前推測其可能是通過神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的,可能機(jī)制包括抑制自由基毒性、抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)一氧化氮含量、增加線粒體功能、減輕興奮性氨基酸毒性、促進(jìn)細(xì)胞增殖以及抑制凋亡等。NF-κB是廣泛存在于神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的一種轉(zhuǎn)錄因子,它在炎癥反應(yīng)中起至關(guān)重要的作用,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它可以通過與IL-1、IL-6、TNF-α等基因啟動子結(jié)合而啟動轉(zhuǎn)錄功能,產(chǎn)生大量IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子及黏附因子和趨化因子等,導(dǎo)致細(xì)胞死亡[12]。同時(shí)相關(guān)炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α也反過來促進(jìn)NF-κB表達(dá)增強(qiáng),他們相互促進(jìn)形成惡性循環(huán),進(jìn)一步加重?fù)p傷。TNF-α作為一個前炎癥因子是啟動炎癥的關(guān)鍵因子,一旦機(jī)體出現(xiàn)缺血、缺氧、微生物感染等情況便會引發(fā)炎癥免疫瀑布,損傷機(jī)體,因此,它是腦缺血再灌注損傷過程中一個重要的炎癥因子[13]。IL-6作為一種神經(jīng)營養(yǎng)因子具有多種生物學(xué)功能,機(jī)體正常情況下其含量較低,對神經(jīng)元有營養(yǎng)保護(hù)和修復(fù)損傷的作用。腦缺血后TNF-α、IL-6作為重要的前炎癥細(xì)胞因子在炎性細(xì)胞反應(yīng)出現(xiàn)之前出現(xiàn),然后通過復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)來影響其他炎癥因子、炎性細(xì)胞功能和合成,從而介導(dǎo)隨后的缺血損傷。因此抑制NF-κB通路,減少TNF-α、IL-6的含量可以明顯減輕炎癥反應(yīng)。

本研究觀察了各組NF-κB信號通路中的NF-κB/P56蛋白,以及TNF-α、IL-6的含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn),腦缺血再灌注的腦組織中NF-κB/P56表達(dá)明顯增強(qiáng),TNF-α、IL-6的含量明顯升高,并且NF-κB/P56表達(dá)的強(qiáng)弱與腦梗死體積大小呈正相關(guān),提示NF-κB參與了腦缺血再灌注損傷的過程,這與Williams等[14]的結(jié)果是一致的。而提前給予數(shù)次LIP能夠降低大鼠神經(jīng)功能缺損,保護(hù)神經(jīng)元。與此同時(shí),我們也觀察到LIP可以降低缺血腦組織中TNF-α、IL-6的含量,表明LIP可能通過抑制NF-κB信號通路的激活來減少TNF-α、IL-6等炎癥因子釋放從而減輕炎癥反應(yīng),實(shí)現(xiàn)內(nèi)源性保護(hù)作用。