崔小麗,蔣 鋒,山 媛,趙 瑞,王 樂,袁 婕,張 強,胡 軍*

(陜西省人民醫(yī)院神經內一科,西安 710068;*通訊作者,E-mail:monkey8031@163.com)

線粒體在人體細胞中功能重大,為人體重要的能量提供器官,它將外界攝取來的氨基酸、葡萄糖等小分子物質,通過位于其內膜上呼吸鏈的氧化磷酸化作用來產生能量供應機體需求。癲癇為神經系統(tǒng)病變中的常見病,其一重要特征為發(fā)作的不可預知性[1,2],癲癇發(fā)作為腦神經元的異常同步激活及異常神經網絡的形成。目前有30%的癲癇患者為藥物難治性,這需要從其他機制入手,尋找新的抗癲癇藥物。癲癇持續(xù)狀態(tài)后能量代謝出現(xiàn)異常改變,線粒體的作用受到破壞。艾地苯醌與經典藥物輔酶Q10相似,它的親脂電子載體和內源性抗氧化功能在所有細胞線粒體膜中均具有[3],作用于線粒體的治療越來越受到人們重視,艾地苯醌獨特的優(yōu)勢—穿越血腦屏障,使其受到研究者的關注,有研究表明,艾地苯醌通過調節(jié)大鼠海馬的抗氧化狀態(tài)、DNA損傷、鈉-鉀ATP的激活對匹羅卡品誘導的癲癇大鼠有神經保護作用[4],本研究觀察艾地苯醌能否減少癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠靜默期后的反復自發(fā)發(fā)作及可能機制探討。

1 材料和方法

1.1 材料

健康清潔級別的SD(Spraque-Dawley)雄性實驗大鼠,共42只,購于西安交通大學實驗動物管理中心,動物合格證號:SCXK(陜)2007-001,動物體質量200-250 g,給予飲水自由、標準飲食,飼養(yǎng)環(huán)境:溫度(25±1)℃、濕度60±2%、照明12 h(早8:00-晚8:00)的光暗環(huán)境。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組 建模時死亡6只,將36只SD大鼠按隨機數(shù)字表等分為正常對照組,模型組及艾地苯醌干預組(每組12只)。

1.2.2 模型建立 首先將氯化鋰(3 meq/kg,美國Sigma公司)注射于實驗大鼠的腹腔,17-20 h后將匹羅卡品(30 mg/kg,美國Sigma公司)注射于大鼠腹腔。為減輕建模時膽堿能作用,溴甲基東莨菪堿(1 mg/kg,美國Sigma公司)注射于大鼠皮下,時間點為使用匹羅卡品前15-20 min,建模后約10 min觀察大鼠癲癇發(fā)作,發(fā)作等級按Racine法[5]評定(0級:無任何行為變化;Ⅰ級:面肌抽動,包含眨眼、節(jié)律性咀嚼、胡須抖動等;Ⅱ級:Ⅰ級+濕狗樣動作及節(jié)奏性點頭;Ⅲ級:Ⅱ級+前肢陣攣;Ⅳ級:Ⅲ級+后肢站立;Ⅴ級:Ⅳ級+摔倒)。當癲癇大鼠出現(xiàn)Ⅳ級及以上SE表現(xiàn)并延續(xù)70 min,將地西泮注射液(10 mg/kg,西安利君精華藥業(yè)有限公司)注射于大鼠腹腔使發(fā)作停止,將等量生理鹽水注射于對照組大鼠腹腔。建模終止30 min后,在每只實驗大鼠的皮下給予10 ml生理鹽水注射,用于補給建模時的耗損,死亡率明顯降低。造模后2 d,給予大鼠常規(guī)糊狀鼠糧,造模成功率約為80%。

1.2.3 艾地苯醌干預 艾地苯醌(60 mg/kg,山東西亞化學工業(yè)有限公司)溶于含5%羧甲基纖維素(carboxymethyl cellulose,CMC,山東西亞化學工業(yè)有限公司)的生理鹽水中,建模終止后24 h,艾地苯醌干預組開始給予灌胃,每天1次,共28 d,其余兩組實驗大鼠均給予等量含5%CMC的生理鹽水進行灌胃。

1.2.4 錄像觀察大鼠行為學變化 由于匹羅卡品致癇大鼠模型,癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus,SE)后的反復自發(fā)性癲癇發(fā)作(spontaneous recurrent seizures,SRS)發(fā)生在白天的次數(shù)和單次持續(xù)時間較晚上明顯增多。所以錄像均選在白天(早8:00-晚8:00)。自癲癇持續(xù)狀態(tài)后第15天開始錄像,連續(xù)錄像觀察分析2周。觀察視頻由兩個實驗者分析,分析統(tǒng)計各實驗組達到發(fā)作標準的持續(xù)時間和發(fā)作次數(shù)。

1.2.5 組織制備 連續(xù)給藥28 d后,以10%水合氯醛(3.5 ml/kg)將各實驗組大鼠進行麻醉,將胸腔打開后迅速暴露膈肌,將心包膜剝離,通過左心室直接到達主動脈,將針頭牢固,瞬時將右心耳剪破,迅速灌注含0.37%的硫化鈉(Na2S)的生理鹽水,首先灌洗150 ml沖干凈血液,后使用固定液4%多聚甲醛(4 ℃,pH=7.4)灌洗固定,先較快速度灌注200 ml,再緩慢灌注200 ml。揭開顱骨,取出腦組織,入4%多聚甲醛進行固定4-6 h,后入30%蔗糖溶液,4 ℃放置,持續(xù)到組織沉淀,冰凍切片機恒溫切取腦片,將海馬部分以冠狀位連續(xù)切片,設置厚度30 μm。

1.2.6 Timm染色及評分標準 配制Timm染色液:50%阿拉伯膠60 ml(阿拉伯膠30 g+去離子水60 ml,攪拌混勻,放置24 h后用雙層紗布濾過),10 ml檸檬酸緩沖液(一水檸檬酸25.5 g+二水檸檬酸鈉23.5 g+去離子水100 ml),5.6%的對苯二酚30 ml,17%硝酸銀0.5 ml,將以上試劑于染色前在黑暗的實驗室攪拌均勻。

Timm染色步驟:在暗室將海馬切片入Timm染色液里孵育1.5 h;在暗室用自來水沖刷海馬切片15 min;將海馬切片自暗室移出,再次用自來水沖刷15 min;常規(guī)脫水、透明、封片:依次入70%，80%，90%，100%乙醇各5 min,再入二甲苯(Ⅰ)、二甲苯(Ⅱ)各15 min,最后用中性樹膠封固。

海馬齒狀回內分子層的Timm顆粒染色評分標準[6]:0分,無Timm顆粒;1分,Timm顆粒偶見,呈散在的點片狀分布;2分,Timm顆粒較多,呈片狀分布;3分,Timm顆粒分布接近連續(xù);4分,Timm顆粒呈接近連續(xù)或連續(xù)分布的濃密狀;5分,Timm顆粒呈連續(xù)分布層狀帶。

2 結果

2.1 癲癇大鼠行為學錄像分析

癲癇大鼠給予匹羅卡品腹腔注射后約15 min,出現(xiàn)Ⅰ、Ⅱ級發(fā)作,繼而出現(xiàn)后肢站立等Ⅳ級及以上的發(fā)作。

2.2 艾地苯醌干預后減少了大鼠SRS的次數(shù)及持續(xù)時間

模型組和艾地苯醌干預組發(fā)作持續(xù)時間分別為(1 143.20±117.61)s和(148.27±35.32)s。模型組和艾地苯醌干預組發(fā)作次數(shù)分別為71±11.63和11.29±3.41。艾地苯醌干預組發(fā)作的次數(shù)和持續(xù)時間較模型組明顯減少,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.3 艾地苯醌干預對海馬齒狀回異常的苔蘚纖維芽生(mossy fiber sprouting,MFS)的影響

各實驗組Timm染色結果見圖1,各實驗組海馬齒狀回Timm染色評分結果見圖2。正常對照組Timm染色評分為0.48±0.16,模型組為4.68±0.21,艾地苯醌干預組為1.61±0.31。與正常對照組相比,模型組的MFS明顯增加(P<0.05);與模型組相比,艾地苯醌干預組MFS減少明顯(P<0.05)。

A.模型組 B.正常對照組 C.艾地苯醌干預組圖1 艾地苯醌對各組癲癇大鼠海馬苔蘚纖維芽生的影響Figure1 Effect of idebenone on hippocampal mossy fiber sprouting in epileptic rats

與正常對照組相比,*P<0.05;與模型組相比,#P<0.05圖2 各組MFS半定量評分比較Figure 2 Semi-quantitative analysis for MFS in each group

3 討論

癲癇是神經科最為常見的疾病之一[1],全球大概有6千萬病患受該病困擾,有部分患者治療效果欠佳,目前藥物不能阻止該疾病或阻斷其發(fā)展,僅僅是控制發(fā)作癥狀。長時間的癲癇發(fā)作和不能較快完全控制發(fā)作,對社會及患者身體和心理均影響極大,這將導致患者生活質量下降,經濟負擔加重。癲癇的一個臨床特征是反復自發(fā)發(fā)作,據(jù)估計高達50%的患者發(fā)病源于一開始的創(chuàng)傷,如癲癇持續(xù)狀態(tài)、中風、腦外傷等,高達30%的癲癇患者對目前抗癲癇藥物反應欠佳,有實驗表明[7],生物要素和環(huán)境要素均促成了藥物難治性癲癇的產生。盡管有大量的臨床前及臨床研究,但對癲癇發(fā)生的機制仍了解有限。在癲癇發(fā)作期神經網絡激活,能量需求增加,腦代謝和腦血流量增加[6,8],這和氧化應激有關[9,10]。有研究表明,在健康大鼠腦室內注射葡萄糖的類似物D-2-脫氧葡萄糖,以達到緩慢部分阻斷腦內糖酵解,可以誘發(fā)癲癇發(fā)生[9,11]?，F(xiàn)有研究表明,迅速并持續(xù)阻斷腦內葡萄糖消耗,可導致氧化應激,進而導致癲癇發(fā)生[12]。有研究表明[13],三種不同的癲癇模型中,給予丙酮酸可以抗驚厥發(fā)作。這表明能量代謝在癲癇發(fā)生中意義重大。除了增強有氧代謝外,多余的葡萄糖通過無氧代謝轉化為乳酸,在癲癇患者、癲癇動物及體外癲癇模型均可見癲癇發(fā)作時有乳酸堆積[14]。單羧酸轉用蛋白介導乳酸的攝取和釋放,這依賴于轉運蛋白的親和力和濃度梯度[15]。由于跨膜離子梯度的恢復是由能量消耗泵機制介導的,因此癲癇發(fā)作對大腦的能量代謝造成了巨大的負擔。破壞了能量代謝,改變了神經活動后組織跨膜離子濃度梯度的改變,進而導致了癲癇發(fā)作,這在線粒體腦病[16]和顳葉癲癇[17]中均可見。

艾地苯醌為一可溶性的輔酶Q10類似物,較輔酶Q10更易于穿過血腦屏障[18],可以激活線粒體功能、促進ATP的生成、抗氧化及去除自由基。艾地苯醌已被用來治療神經退行性疾病和病因為線粒體功能障礙的患者[19]。臨床前實驗報道艾地苯醌有神經保護作用,可對抗β淀粉樣蛋白產生的神經毒性,既往研究表明艾地苯醌對癲癇大鼠有神經保護作用[4]。本研究發(fā)現(xiàn),艾地苯醌可以減少癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠后期的反復自發(fā)發(fā)作。海馬齒狀回顆粒細胞軸突的異常抽芽,即苔蘚纖維芽生(mossy fiber sprouting,MFS),為癲癇中一個重要的病理變化[20],MFS的形成發(fā)生在兩個階段:①損傷本身導致了神經元的激活和釋放生長因子;②顆粒細胞軸突的生長和延伸[21]。在形態(tài)學上,海馬齒狀回包含三層:自內向外為多形細胞層、顆粒細胞層、分子層,分子層為無細胞層,包含顆粒細胞的頂樹突和傳遞信息的興奮末梢,這些信息或來自于內嗅皮層,或來自于聯(lián)合投射區(qū)。顆粒細胞層密集分布著小直徑的胞體(即顆粒細胞),顆粒細胞軸突延伸到門區(qū),首先投射到興奮性中間神經元(苔蘚細胞)和抑制性中間神經元,然后穿過透明層,到達突觸,連接CA3區(qū)的錐體神經元。在癲癇的海馬齒狀回組織,門區(qū)丟失了苔蘚纖維的投射靶點,異常的苔蘚纖維,并延伸到內分子層,與顆粒細胞樹突的近端部分形成興奮性突觸連接。

在內側顳葉癲癇動物模型中,可見到苔蘚纖維軸突重組在內側顳葉癲癇的標本中,使用Timm染色,可以見到大量濃密的富含鋅顆粒的苔蘚纖維,在海仁酸誘導的癲癇模型及其他癲癇動物模型中也有類似的發(fā)現(xiàn)[22,23]。在海仁酸誘導癲癇持續(xù)狀態(tài)前給予哌立福辛預處理,可以抑制神經元的死亡和MFS,減少反復自發(fā)發(fā)作[24]。在匹羅卡品誘導的SE大鼠模型中,給予靜脈輸注大鼠骨髓間充質干細胞,有神經保護作用,可以減少認知損害、抑制MFS,其結論是,移植可能通過抑制異常MFS來減少癲癇的發(fā)生[25]。我們的研究表明艾地苯醌可以減少苔蘚纖維芽生,與上面這些研究一致。減少苔蘚纖維芽生可能是減少癲癇發(fā)生的機制之一

本研究表明,艾地苯醌可以減少癲癇持續(xù)狀態(tài)后自發(fā)性癲癇發(fā)作,提示艾地苯醌成為臨床上治療癲癇的新方法。我們還需要進一步探討其他給藥時間窗、給藥時間的長短及其他可能的機制研究,以期臨床上能夠治療難治性癲癇。