許小斌,武偉男,馬 寧,連世忠*

(1山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院神經(jīng)外科,太原 030001;2山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)外科;*通訊作者,E-mail:13934236496@163.com)

microRNA屬于一種非編碼RNA分子,它的序列非常短小,過去,人們一直認(rèn)為microRNA是沒有任何生物學(xué)功能的無用基因,但隨著研究的深入,人們發(fā)現(xiàn),它雖然沒有編碼蛋白質(zhì)的功能,卻扮演著調(diào)控mRNA分子的重要角色。microRNA通過與mRNA序列特異性結(jié)合、抑制或促進(jìn)mRNA的翻譯,參與mRNA的降解過程,從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和周期等細(xì)胞活性。miRNA-147屬于microRNA大家族中的一員,過表達(dá)miRNA-147可明顯抑制肺腺癌細(xì)胞A549的增殖能力和侵襲能力[1],miRNA-147可以作用于EGFR驅(qū)動的細(xì)胞周期網(wǎng)絡(luò)蛋白,抑制乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期[2],miRNA-147還可以通過調(diào)控Akt/mTOR信號通路,產(chǎn)生抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移的作用[3]。由上可知,miRNA-147在腫瘤中發(fā)揮著抑癌基因的作用,過表達(dá)miRNA-147可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖能力、遷移能力和細(xì)胞周期等細(xì)胞活性,因此我們推斷,過表達(dá)miRNA-147也可能會對膠質(zhì)瘤細(xì)胞產(chǎn)生類似的作用,本實驗通過轉(zhuǎn)染技術(shù)提高了膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中miRNA-147的表達(dá)量,并進(jìn)一步驗證了miRNA-147高表達(dá)是否會影響U87細(xì)胞的增殖、周期和遷移。

1 材料與方法

1.1 實驗細(xì)胞和試劑

U87細(xì)胞為本實驗室保存細(xì)胞株。SYBR Green PCR試劑盒購自KAPA Biosystems公司,DMEM購自Hyclone公司,胎牛血清購自Gibco公司,Cycletest Plus DNA Reagent Ki和碘化丙啶均購自BD公司,CCK-8購自Bioswamp公司,0.25%胰蛋白酶購自Bioswamp公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司等。

1.2 培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染細(xì)胞

培養(yǎng)基基本成分:DMEM、FBS;培養(yǎng)環(huán)境:5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱。根據(jù)Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒的說明書流程進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染,分別將陰性對照和miR-147模擬物轉(zhuǎn)染進(jìn)入膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87中,并分成兩組:陰性對照組和miR-147模擬物組。轉(zhuǎn)染48 h時,通過實時熒光定量PCR技術(shù)分別檢測對照組和模擬物組細(xì)胞中miR-147的表達(dá)量。

1.3 利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測各組細(xì)胞中miRNA-147的表達(dá)

通過實時熒光定量PCR擴增來判斷轉(zhuǎn)染前后miR-147表達(dá)差異。首先通過Trizol試劑提取出總RNA,然后在反轉(zhuǎn)錄試劑引導(dǎo)下進(jìn)行RNA的反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈,最后以單鏈cDNA為PCR模板,在對應(yīng)引物的引導(dǎo)下,以U6為內(nèi)參,進(jìn)行miR-147水平的實時熒光定量PCR檢測。引物如下:miR-147-F:GGGGTGTGTGGAAAT,miR-147-R:AACTGGTGTCGTGGAGTCGGC;U6-F:CTCGCTTCGGCAGCACA,U6-R:AACGCTTCACGAATTTGCGT。反應(yīng)程序:95 ℃,3 min;95 ℃ 5 s,56 ℃ 10 s,72 ℃ 25 s,39 cycles;65 ℃ 5 s,95 ℃ 50 s。miR-147的表達(dá)水平采用Ct值比較法進(jìn)行計算。

1.4 CCK-8法檢測各組細(xì)胞增殖能力

收集生長良好的對數(shù)期U87細(xì)胞,分于96孔板中,調(diào)整到適宜的細(xì)胞密度,每個時間點均設(shè)置3個復(fù)孔,培養(yǎng)至膠質(zhì)瘤細(xì)胞貼壁生長并轉(zhuǎn)染細(xì)胞。分別于0,24,48,72 h向各組培養(yǎng)孔中加入適量CCK8溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,最后檢測450 nm處各個孔相應(yīng)的OD值。

1.5 流式分析儀分析各組細(xì)胞的細(xì)胞周期

用0.25%胰酶消化各組細(xì)胞,吹打使其充分變勻,制備成單細(xì)胞懸液離心,收集到流式專用管中,離心并去上清,PBS(其中含有FBS)進(jìn)行重懸,移入離心管內(nèi),加入無水乙醇,在-20 ℃溫度下固定24 h以上;細(xì)胞固定好以后,進(jìn)行離心,去掉上清液,使用PBS洗滌沉淀若干次,用1 mg/ml的RNase A溶液消化細(xì)胞內(nèi)的RNA;用PI溶液避光環(huán)境下染核10 min;最后用流式細(xì)胞儀分析兩組細(xì)胞細(xì)胞周期百分比。

1.6 劃痕實驗檢測各組細(xì)胞遷移能力

首先在6孔培養(yǎng)板背面均勻地畫出多條粗細(xì)均勻、距離相等的平行線,孔中加入細(xì)胞,待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)孔,用無菌移液頭在細(xì)胞中劃出劃痕,劃痕要求粗細(xì)均勻且垂直于平行線,緩慢沖洗散落的細(xì)胞,繼續(xù)無血清培養(yǎng)。以平行線與劃痕的交點作為觀察點,在0,24,48 h分別定點拍照記錄,觀察遷移的變化,軟件分析48 h時兩組細(xì)胞平均遷移距離的差異。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染miR-147模擬物對miR-147表達(dá)影響

通過Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48 h時,分別取模擬物組和對照組兩組細(xì)胞,使用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測各組細(xì)胞的miRNA-147表達(dá)量,結(jié)果顯示:模擬物組miRNA-147相對表達(dá)量(11.26±5.73)明顯高于對照組(1.03±0.24),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 轉(zhuǎn)染miR-147模擬物對細(xì)胞增殖能力的影響

U87細(xì)胞轉(zhuǎn)染模擬物后,CCK-8實驗結(jié)果顯示:在24 h時,模擬物組與對照組的OD值比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);而48,72 h檢測結(jié)果顯示模擬物組OD值(0.33±0.04和0.48±0.06)均明顯低于對照組(0.53±0.03和0.87±0.08),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 轉(zhuǎn)染miR-147模擬物對細(xì)胞周期的影響

U87細(xì)胞轉(zhuǎn)染模擬物后,溴化丙錠(PI)對細(xì)胞染色后,使用流式細(xì)胞分析儀分析細(xì)胞中的DNA含量,得到了流式周期圖(見圖1),統(tǒng)計結(jié)果顯示:模擬物組處于G0/G1期、S期的細(xì)胞數(shù)比率小于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而處于G2/M期的細(xì)胞比率明顯大于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,見圖2)。

圖1 對照組和模擬物組U87細(xì)胞周期分布圖Figure 1 Distribution of U87 cell cycle in control group and mimics group

與陰性對照組比較，*P<0.05,**P<0.01圖2 對照組和模擬物組U87細(xì)胞周期分布差異比較Figure 2 Comparison of U87 cell cycle distribution between control group and mimics group

2.4 轉(zhuǎn)染miR-147模擬物對細(xì)胞遷移能力的影響

U87細(xì)胞轉(zhuǎn)染模擬物后,分別于0,24,48 h進(jìn)行拍照記錄,分析48 h時的細(xì)胞遷移平均距離,對照組平均遷移距離為(186.52±21.26)μm,而miRNA-147模擬物組平均遷移距離為(106.63±18.06)μm,模擬物組遷移距離明顯小于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖3)。

3 討論

膠質(zhì)瘤瘤細(xì)胞非常容易轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)離原發(fā)灶的腦組織中,試圖通過手術(shù)徹底切除擴散的腫瘤組織,其可能性微乎其微;浸潤生長、復(fù)發(fā)、放化療耐受是膠質(zhì)瘤導(dǎo)致患者死亡的主要因素;雖然針對膠質(zhì)瘤治療的研究越來越深入,但到目前為止,還是沒能尋找到明顯提高膠質(zhì)瘤生存率的治療手段,所以它的病死率仍居高不下[4,5]。近年來神經(jīng)膠質(zhì)瘤在外科和醫(yī)學(xué)影像技術(shù)以及放療、電場治療、化療和免疫療法等多個領(lǐng)域都取得了令人矚目的成果,但膠質(zhì)瘤細(xì)胞十分容易在正常腦實質(zhì)內(nèi)廣泛傳播的本質(zhì)特性還是嚴(yán)重限制了其治療的效果[6-8]。microRNA可以刺激某些靶基因的活化,也可以沉默某些基因,借此調(diào)控疾病的發(fā)生與發(fā)展[9]。已有大量研究證明,microRNA與對應(yīng)靶基因之間存在相互調(diào)控,這種調(diào)控存在著一種平衡,平衡一旦被打破,很可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[10]。microRNA參與了腫瘤細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡、分化、生長、侵襲、遷移以及血管新生等各個環(huán)節(jié),對腫瘤細(xì)胞的生物活性有很大的調(diào)控作用,研究microRNA與腫瘤細(xì)胞生物活性的關(guān)系,可以為腫瘤的研究指明新的方向,有利于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)和早期治療[11]。

圖3 對照組和模擬物組U87細(xì)胞遷移距離 (×100)Figure 3 Migration distance of U87 cells in control group and mimics group (×100)

miRNA-147屬于microRNA大家族中的重要一員,miR-147在大腸癌組織中表達(dá)下調(diào),MAFG-AS1在大腸癌組織中的表達(dá)上調(diào),MAFG-AS1過表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖、加快細(xì)胞周期進(jìn)程,并抑制細(xì)胞凋亡,而miR-147的轉(zhuǎn)導(dǎo)可以部分逆轉(zhuǎn)MAFG-AS1對細(xì)胞過程的影響[12];柳家榮等[13]通過細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn),miRNA-147過表達(dá)可抑制Skov3細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡;HOXD-AS1基因敲除可抑制NSCLC細(xì)胞增殖,促進(jìn)其凋亡,Wang等[14]研究發(fā)現(xiàn),抑制miRNA-147可阻斷HOXD-AS1基因敲除對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響;在乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231中,miRNA-147可通過調(diào)控Akt/mTOR信號通路,產(chǎn)生抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的作用[3]。

綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)miRNA-147可以抑制多種癌細(xì)胞的細(xì)胞活性。為了證明miRNA-147是否會抑制膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的增殖能力、遷移能力和細(xì)胞周期,本實驗首先將miRNA-147模擬物轉(zhuǎn)染進(jìn)入U87細(xì)胞中,并通過實時熒光定量PCR技術(shù)檢測了轉(zhuǎn)染后的miRNA-147表達(dá)水平,結(jié)果顯示模擬物組細(xì)胞中miRNA-147的表達(dá)水平顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。在此基礎(chǔ)上研究了miRNA-147高表達(dá)對U87細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移和細(xì)胞周期的影響,實驗結(jié)果顯示,細(xì)胞轉(zhuǎn)染48,72 h時,模擬物組光密度值均明顯低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,說明miRNA-147可以抑制U87細(xì)胞的增殖能力;細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h時,模擬物組處于G2/M期的細(xì)胞比例明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,說明miRNA-147可以阻滯U87細(xì)胞于G2/M期,結(jié)合前面的增殖檢測結(jié)果,我們推測,miRNA-147可能是通過阻滯U87細(xì)胞的細(xì)胞周期,影響其進(jìn)行正常的有絲分裂,進(jìn)而降低了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力;細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h時,模擬物組細(xì)胞遷移距離明顯小于對照組,說明miRNA-147可以抑制U87細(xì)胞的遷移能力。但是,miRNA-147是通過何種機制對U87細(xì)胞產(chǎn)生作用的,它的作用靶基因是什么,仍需要進(jìn)一步實驗驗證。

綜上所述,miRNA-147可以抑制U87細(xì)胞的增殖能力、遷移能力,并阻滯U87細(xì)胞于G2/M期,影響其進(jìn)行正常的有絲分裂,miRNA-147可能在膠質(zhì)瘤中發(fā)揮抑癌基因的作用,這為神經(jīng)外科診斷和治療膠質(zhì)瘤提供了新的標(biāo)記物。