于巖松 柳椰 那俊夫 于冬冬 楊鶇祥*

1.沈陽(yáng)市骨科醫(yī)院，沈陽(yáng)市骨科醫(yī)院承基醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110032 2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110032

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥主要類(lèi)型，其骨折發(fā)生率高[1]，老年P(guān)MOP在髖部及脊柱的骨質(zhì)疏松性骨折5年后生存率不到60%[2]。其致死原因?yàn)榛颊唛L(zhǎng)期臥床出現(xiàn)如墜積性肺炎、下肢深靜脈血栓形成等并發(fā)癥。PMOP患者骨量丟失嚴(yán)重，對(duì)內(nèi)固定物把持力弱，手術(shù)失敗率高[3]。補(bǔ)正續(xù)骨丸在我院應(yīng)用半個(gè)世紀(jì)，對(duì)骨質(zhì)疏松癥有一定的療效[4-7]，但對(duì)PMOP及相關(guān)骨折的作用及機(jī)制還不清楚，本研究對(duì)補(bǔ)正續(xù)骨對(duì)PMOP及相關(guān)骨折的作用及潛在機(jī)制進(jìn)行研究，為臨床應(yīng)用該藥治療PMOP及相關(guān)骨折提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD大鼠由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供，共100只，均為健康雌性大鼠，體重為180±20 g，許可證：SCXK(遼)2015-0001。遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.1.2主要實(shí)驗(yàn)藥物與試劑：本實(shí)驗(yàn)所用實(shí)驗(yàn)藥品均源于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，補(bǔ)正續(xù)骨丸由沈陽(yáng)金竹藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，組成：首烏(制)25 g、鹿茸 15 g、煅自然銅 40 g、骨碎補(bǔ) 30 g、續(xù)斷 30 g、枸杞 20 g、菟絲子 15 g、香櫞、雞血藤、合歡、烏賊骨各 15 g；骨疏康顆粒由遼寧康辰藥業(yè)有效公司生產(chǎn)，批號(hào)：160919；接骨七厘膠囊由湖南金沙藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：Z20053999；雷帕霉素(分裝)由上海MKL生化科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：K1089；阿侖膦酸鈉產(chǎn)于上海MKL生化科技有限公司，批號(hào)：A801267。

EDTA脫鈣液(AR1071，中國(guó))，P1NP ELISA試劑盒(m1002251，中國(guó))，β-CTX ELISA試劑盒(m1038002，中國(guó))，P70S6K一抗(bs-0295G-HRP，美國(guó))，4EBP-1一抗(bs-0885G-HRP，美國(guó))，羊抗兔二抗(bs-0 195 A-HRP，美國(guó))，DAB顯色試劑(KIT9710，中國(guó))。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器：骨密度儀(Straros DR，法國(guó))，光學(xué)顯微鏡(Nikon MODEL YS100，日本)，酶標(biāo)儀(Infinite F50，中國(guó))，脫水機(jī)(LEICA 300，德國(guó))，恒溫箱(DHG-9 070 A，中國(guó))，電熱恒溫箱(101-0-BS，中國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物模型制備及分組：大鼠稱重后采取0.7%水合氯醛溶液(5 mL/kg)腹腔麻醉，麻醉成功后，消毒、備皮，剃除大鼠背部毛發(fā)約3 cm×3cm，碘伏消毒。采取縱向切口，切口起自大鼠雙側(cè)肋下緣連線中點(diǎn)，長(zhǎng)約2 cm，將切口拉向左側(cè)，于背部旁開(kāi)2 cm、肋下1 cm處依次剪開(kāi)筋膜、肌肉，進(jìn)入腹腔，切口長(zhǎng)約0.5 cm，暴露子宮角，組織鑷夾持卵巢，縫合線結(jié)扎子宮角，剪除卵巢、縫合線，對(duì)側(cè)操作同上。沖洗、消毒、逐層縫合。術(shù)后3日予頭孢呋辛(70 mg/kg)每日一次肌注以預(yù)防感染。術(shù)后3日每日更換墊料。摘除大鼠雙側(cè)卵巢(圖1a)，造模成功6周后，腹腔注射麻藥，采用雙能X線骨密度儀測(cè)量大鼠股骨BMD(圖1b)。結(jié)果見(jiàn)表1，說(shuō)明造模成功。

圖1 大鼠卵巢摘除及骨密度檢查a.大鼠卵巢摘除， b.正常組、模型組、假手術(shù)組大鼠骨密度檢查Fig.1 a, area of ovariectomy in rats, b, bone mineral density scan in rats (normal group, model group, and sham operation group)

Table1BMD was measured 6 weeks after removal of the ovary

組別數(shù)量BMD/(g/cm2)正常組 100.243±0.012△模型組 800.190±0.022假手術(shù)組100.242±0.009△

注：與模型組比較，△P<0.05。

將大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、假手術(shù)組、中藥組(高、中、低)、骨疏康、接骨七厘膠囊、雷帕霉素組(通路抑制劑組)、阿侖膦酸鈉10組，每組10只。中藥組以常規(guī)劑量作為中劑量，高∶中∶低=2∶1∶1/2，每日2次，雷帕霉素予8 mg/(kg.2 d)腹腔注射。骨疏康、接骨七厘膠囊予人體等效劑量為0.315 g、0.038 g，正常組、模型組、假手術(shù)組予等量蒸餾水灌胃。每周稱重調(diào)整給藥量。

1.2.2骨密度儀測(cè)量大鼠股骨BMD：大鼠造模成功后，按計(jì)劃給藥6周，予腹腔麻醉后測(cè)量大鼠股骨BMD。觀察各組在用藥后BMD差別。

1.2.3HE染色觀察大鼠股骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)：取大鼠股骨組織，固定、脫水、封閉、切片。每組選擇4張完整載玻片進(jìn)行HE染色，選取合適大小蓋玻片用樹(shù)膠完成封片、鏡檢。

1.2.4ELISA檢測(cè)法檢測(cè)大鼠外周血血清中β-CTX、P1NP含量的影響：抽取大鼠腹主動(dòng)脈血并制備血清。在96孔板上設(shè)置標(biāo)A孔為標(biāo)準(zhǔn)品孔，依次在標(biāo)準(zhǔn)品孔加入標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0、0.5、1、2、4、8倍濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL。設(shè)置B-G行為待測(cè)樣品孔，分別為正常組、模型組、中藥組(中)、骨疏康組、阿侖膦酸鈉組、雷帕霉素組，H行為空白孔，每組12孔以保證可重復(fù)性。加稀釋液40 μL、樣品10 μL，除空白孔外，加入酶標(biāo)試劑100 μL。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中CTX、P1NP含量。

1.2.5免疫組化測(cè)定大鼠脛骨組織中4EBP-1、p70S6K蛋白表達(dá)：組織脫蠟成功后行抗原修復(fù)、內(nèi)源性過(guò)氧化物酶封閉、非特異性抗原封閉。以試劑2作為抗原稀釋液一抗孵育，以試劑3行二抗孵育，以試劑4行過(guò)氧化物酶標(biāo)記。顯色劑顯色后加入蘇木素復(fù)染。樹(shù)膠封片、鏡檢。

1.2.6Western-blot測(cè)定大鼠脛骨樣本中蛋白含量：取150 mg大鼠脛骨組織樣本，加入細(xì)胞裂解液提取蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。制備上樣蛋白、配膠。20 μg蛋白樣品進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后調(diào)整電壓至90 V轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。37 ℃封閉1 h、一抗4 ℃孵育過(guò)夜。辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的稀釋二抗孵育。ECL發(fā)光法曝光成像，掃描入電腦。Image J軟件測(cè)定平均灰度值。

1.2.7觀察各組大鼠骨折愈合時(shí)間及骨痂密度：大鼠摘除卵巢6周后，進(jìn)行骨折造模。給藥后，大鼠腹腔麻醉后測(cè)量大鼠骨痂區(qū)的骨密度及骨折骨性愈合時(shí)間。觀察各組在用藥后骨痂區(qū)密度、愈合時(shí)間的差別。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 骨密度儀測(cè)量大鼠股骨BMD

股骨骨密度：與正常組相比，模型組、雷帕霉素組(通路抑制劑)骨密度明顯降低，P<0.05；與模型組組相比，中藥組骨密度明顯上調(diào)，P<0.05；中藥組中劑量骨密度高于高、低劑量組。

表2 給藥后各組去卵巢大鼠骨密度Table 2 BMD after drug administration

注：與正常組比較，▲P<0.05；與模型組比較比較，△P<0.05；與阿侖膦酸鈉組比較，★P>0.05，☆P<0.05。

圖2 給藥后各組去卵巢大鼠骨密度Fig.2 BMD after drug administration

股骨骨密度：與正常組相比，模型組、雷帕霉素組(通路抑制劑)骨密度明顯降低，P<0.05；與模型組相比，中藥組骨密度明顯上調(diào)，P<0.05，；中藥組中劑量骨密度高于高、低劑量；與阿侖膦酸鈉組相比，中藥組骨密度差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。

2.2 補(bǔ)正續(xù)骨丸對(duì)去勢(shì)大鼠股骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)的影響

通過(guò)骨組織切片染色，比較各組骨小梁數(shù)量和形態(tài)。骨組織形態(tài)顯微Mimics圖像分析:制作股骨髁部松質(zhì)骨的HE染色切片后(圖3)，每個(gè)切片隨機(jī)選擇一個(gè)視野，在Mimics圖像處理與分析系統(tǒng)中進(jìn)行骨小梁面積測(cè)量(表3)。

由圖3可見(jiàn)，正常組骨小梁分布均勻、連續(xù)完整。模型組、雷帕霉素組骨小梁分布稀疏，且有部分連續(xù)性中斷。中藥組骨小梁分布較模型組密集、均勻，無(wú)明顯斷裂；較骨疏康組分布均勻，斷裂少；較阿侖膦酸鈉組，骨小梁寬度增寬。

由表3、圖4可見(jiàn)，與正常組相比，模型組、雷帕霉素組(通路抑制劑)骨小梁面積明顯降低，P<0.05；與模型組相比，中藥組骨小梁面積明顯上調(diào)，P<0.05；與阿侖膦酸鈉組相比，中藥組骨小梁面積明顯上調(diào)，P<0.05。

2.3 ELISA法檢測(cè)補(bǔ)正續(xù)骨丸對(duì)去勢(shì)大鼠外周血血清中β-CTX、P1NP含量的影響

根據(jù)樣品OD值計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5)。

P1NP測(cè)量結(jié)果顯示，模型組較正常組明顯降低，P<0.05。各給藥組與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明中藥組對(duì)P1NP水平無(wú)明顯影響。

β-CTX測(cè)量結(jié)果顯示，正常組與假手術(shù)組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與正常組比較，模型組CTX顯著升高。各給藥組與模型組比較，β-CTX水平不同程度降低(P<0.05)，說(shuō)明各治療組藥物均能不同程度降低β-CTX水平。與模型組比較，中藥組β-CTX水平顯著降低，補(bǔ)正續(xù)骨丸高劑量組與中、低劑量組β-CTX水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明補(bǔ)正續(xù)骨丸中、低劑量組能夠降低CTX水平，補(bǔ)正續(xù)骨丸高劑量組對(duì)β-CTX水平影響小于中低劑量。與骨疏康組比較，補(bǔ)正續(xù)骨丸中、低劑量組β-CTX水平升高，說(shuō)明補(bǔ)正續(xù)骨丸中、低劑量對(duì)β-CTX水平抑制作用強(qiáng)于骨疏康(見(jiàn)表4、圖6)。

圖3 各組骨小梁HE染色(10×10)A正常組、B模型組、C中藥中劑量組、D骨疏康組、E阿侖膦酸鈉組、F雷帕霉素組。Fig.3 HE staining of trabecular bone in each group (10×10 times)A, normal group, B, model group, C, medium-dose Chinese medicine group, D, Gushukang group, E, Alendronate group, F, rapamycin group.

Table3Ratio of trabecular bone area after drug administration

組別數(shù)量骨小梁面積比正常組100.318±0.012△模型組100.233±0.012▲中藥組中劑量100.308±0.032▲★骨疏康組100.262±0.036▲★阿侖膦酸鈉組100.208±0.029▲雷帕霉素組100.233±0.012▲●

注：與正常組比較，▲P<0.05，■P>0.05；與模型組比較，△P<0.01，●P>0.05；與西藥組比較，★P>0.05，☆P<0.05。

圖4 給藥后各組骨小梁面積比Fig.4 Ratio of trabecular bone area after drug administration

圖5 β-CTX、P1NP標(biāo)準(zhǔn)曲線β-CTX標(biāo)準(zhǔn)曲線(Y=2.6769X-0.1941)P1NP標(biāo)準(zhǔn)曲線(Y=1.9714X-0.063)Fig.5 The standard curve of β-CTX and P1NP

組別β-CTXP1NP正常組3.21±0.2110.96±0.22模型組3.58±0.18▲8.44±0.68▲中藥組中劑量2.51±0.17△☆8.45±0.19△★骨疏康組3.04±0.33△☆8.89±0.61△★阿侖膦酸鈉組3.56±0.20●10.74±0.29●雷帕霉素組3.06±0.37△8.78±0.48△

圖6 大鼠外周血情中β-CTX、P1NP水平注：與正常組比較，▲P<0.05，■P>0.05；與模型組比較比較，△P <0.05，●P>0.05；與西藥組比較，★P>0.05，☆P<0.05。Fig.6 The concentration of P1NP and beta -CTX in peripheral blood of rats

2.4 WB檢測(cè)4EBP-1、p70S6K蛋白量

正常組的蛋白的相對(duì)含量為1，各實(shí)驗(yàn)組與正常組進(jìn)行比較，計(jì)算得出比值。與正常組比較，模型組p70S6K、4EBP1相對(duì)灰度值表達(dá)顯著升高(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明模型對(duì)照組p70S6K、4EBP1的表達(dá)顯著升高。與模型組相比，補(bǔ)正續(xù)骨丸中劑量組相對(duì)灰度值降低(P<0.05)，說(shuō)明補(bǔ)正續(xù)骨丸能夠降低p70S6K、4EBP1的表達(dá)。中藥組與雷帕霉素組比較，補(bǔ)正續(xù)骨丸中劑量組p70S6K、4EBP1相對(duì)灰度值升高，說(shuō)明補(bǔ)正續(xù)骨丸中劑量對(duì)p70S6K、4EBP1抑制作用弱于雷帕霉素(圖7、表5)。

圖7 4EBP1、p70S6K蛋白表達(dá)A正常組、B模型組、C中藥中劑量組、D雷帕霉素組。Fig.7 4 EBP1,p70S6K expression from left to right, A, normal group, B, model group, C, medium-dose group, D, rapamycin group.

Table5Comparison of protein expressions of 4EBP1 and p70S6K (relative gray value)

組別4EBP1p70S6K正常組0.147±0.0120.145±0.017模型組0.418±0.072▲0.408±0.055▲補(bǔ)正續(xù)骨丸(中)0.308±0.033△★0.366±0.018△☆雷帕霉素組0.266±0.029△0.242±0.020△

注：與正常組比較，▲P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與雷帕霉素組比較，★P>0.05，☆P<0.05。

2.5 補(bǔ)正續(xù)骨丸對(duì)去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松性骨折的影響

大鼠摘除卵巢6周后，進(jìn)行骨折造模(圖8、圖9)。成功造模后，各組按計(jì)劃連續(xù)給藥6周，觀察各組在用藥后骨痂區(qū)密度、愈合時(shí)間的差別。

圖8 A、B大鼠造模操作，C股骨DR，D內(nèi)固定(取出)Fig.8 A, B, rat model operation, C, femur DR, D internal fixation (taken out)

圖9 大鼠股骨骨折骨性愈合DR(箭頭標(biāo)記處A未拆除內(nèi)固定，B拆除內(nèi)固定)Fig.9 Bone-healing DR of rat femur fractures (A internal fixation not being removed, B internal fixation being removed)

與正常組相比，模型組骨痂密度明顯降低，P<0.01；與模型組相比，中藥組骨痂密度明顯上調(diào)，P<0.05；與中藥對(duì)照組相比，中藥組骨痂密度差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05，(表6)。

表6補(bǔ)正續(xù)骨丸對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨痂密度的影響

Table6Effect of Buzhengxug pill on osteophyte density in osteoporotic rats

組別數(shù)量BMD/(g/cm2)正常組90.218±0.012模型組80.190±0.020▲補(bǔ)正續(xù)骨丸(中)90.215±0.008△☆接骨七厘組90.211±0.010

注：與正常組比較，▲P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與接骨七厘組比較，★P>0.05，☆P<0.05。

與正常組相比，模型組骨折愈合時(shí)間明顯延長(zhǎng)，P<0.05；與模型組相比，中藥組骨折愈合時(shí)間明顯縮短，P<0.05，；與中藥對(duì)照組相比，中藥組骨折愈合時(shí)間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05，(表7)。

表7補(bǔ)正續(xù)骨丸對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠股骨骨折愈合時(shí)間的影響

Table7Effect of Buzhengxugu pill on the healing time of femoral fracture in osteoporotic rats

組別數(shù)量愈合時(shí)間/(d)正常組954±2.5模型組864±2.1▲補(bǔ)正續(xù)骨丸(中)960±1.4△☆接骨七厘組959±2.5★

注：與正常組比較，▲P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與接骨七厘組比較，★P>0.05，☆P<0.05。

3 討論

骨形成作用和骨吸收作用之間的動(dòng)態(tài)平衡是維持骨骼健康的關(guān)鍵因素[8]。雌激素分泌減少導(dǎo)致的骨吸收能力增強(qiáng)，是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的主要因素[9-10]。雌激素通過(guò)調(diào)節(jié)自噬而調(diào)節(jié)骨折端血管內(nèi)皮及成骨細(xì)胞增殖促進(jìn)骨折愈合[11]。成骨細(xì)胞分泌骨保護(hù)素亦受到雌激素調(diào)控[12]，雌激素可調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞凋亡[13]。骨折愈合起初由破骨細(xì)胞吞噬壞死骨細(xì)胞，隨后破骨細(xì)胞通過(guò)自噬活性逐步降低，成骨細(xì)胞活性升高。

研究發(fā)現(xiàn)抑制 mTOR1信號(hào)通路可對(duì)成骨及破骨細(xì)胞增殖有一定的影響[14]。自噬在代謝性骨病發(fā)病中發(fā)揮重要作用[15]，與自噬影響細(xì)胞生長(zhǎng)、存活、分化和細(xì)胞自身穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)，ROS-AKT-mTOR1信號(hào)軸在信號(hào)軸也參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和增殖[16]。Alvarez-Garcia等[17]給4周70 g左右的雄性大鼠，腹腔注射Rapamycin [2 mg/(kg/day)]兩周，發(fā)現(xiàn)通過(guò)雷帕霉素抑制mTOR1通路能明顯減少生長(zhǎng)板中破骨細(xì)胞的數(shù)量。與此同時(shí)，mTOR1通路亦可通過(guò)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的數(shù)量促進(jìn)軟骨生成[18]，也涉及促紅細(xì)胞生成誘導(dǎo)成骨[19]。

本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)補(bǔ)正續(xù)骨丸對(duì)PMOP有一定的防治作用。其能夠降低大鼠血清中β-CTX水平從而抑制骨吸收。然而，其對(duì)P1NP無(wú)明顯影響，說(shuō)明補(bǔ)正續(xù)骨丸對(duì)骨形成無(wú)明顯影響。PMOP的發(fā)生可升高mTOR1信號(hào)通路中p70S6K、4EBP1的表達(dá)，然而我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)：補(bǔ)正續(xù)骨丸可以抑制mTOR1信號(hào)通路中p70S6K、4EBP1的表達(dá)，繼而促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨折的愈合，提升骨痂密度。

綜上所述，本研究對(duì)補(bǔ)正續(xù)骨丸治療PMOP及骨質(zhì)疏松性骨折進(jìn)行研究，結(jié)果表明補(bǔ)正續(xù)骨丸對(duì)PMOP及骨質(zhì)疏松性骨折有一定的防治作用，并且是通過(guò)調(diào)節(jié)自噬相關(guān)mTOR1信號(hào)通路p70S6K、4EBP1的表達(dá)來(lái)抑制骨吸收來(lái)實(shí)現(xiàn)的，為補(bǔ)正續(xù)骨丸用于臨床防治PMOP提供新的理論基礎(chǔ)。