劉煥娜 張硯華 徐麗麗 朱曉琳 李華建 王春芝 楊乃龍*

1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，山東 青島 266000 2.青島李滄區(qū)中心醫(yī)院內(nèi)二科，山東 青島 266041 3.青島市市立醫(yī)院老年內(nèi)科，山東 青島 266071 4.海陽(yáng)市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，山東 煙臺(tái) 265100 5.海陽(yáng)市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，山東 煙臺(tái) 265100

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、折疊、成熟和加工的重要細(xì)胞器。當(dāng)細(xì)胞遭遇衰老、基因突變、營(yíng)養(yǎng)缺失、病原體感染時(shí)[1]，將會(huì)導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊或未折疊，這將會(huì)引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔中蛋白質(zhì)的累積，從而引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)[2]，過(guò)度的ERS會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而成骨細(xì)胞內(nèi)的ERS是發(fā)生骨質(zhì)疏松的主要機(jī)制之一[3]，但具體機(jī)制不清。

Ghrelin是主要分泌于胃底部泌酸粘膜區(qū)的一種胃腸道激素，其主要作用是促進(jìn)食欲和生長(zhǎng)激素的分泌，是生長(zhǎng)激素促分泌受體(GHSR)的天然配體[4]。GHSR表達(dá)于不同組織，如大腦[5]、腎臟[6]和前列腺[7]，同時(shí)也表達(dá)于成骨細(xì)胞，直接促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化[8]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)均以證明，ghrelin對(duì)骨形成具有保護(hù)作用[9]。在臨床中發(fā)現(xiàn)，胃大部切除術(shù)后可迅速引起骨量減少，而不依賴于鈣吸收不足等缺陷。說(shuō)明ghrelin對(duì)體內(nèi)的骨重建起到重要的作用[10]。本研究通過(guò)衣霉素誘導(dǎo)成骨細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型，利用ghrelin預(yù)處理成骨細(xì)胞后，觀察ghrelin對(duì)成骨細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

小鼠前體成骨細(xì)胞MC 3T3-E1購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)；α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；胰蛋白酶、青鏈霉素混合液、二甲基亞砜(DMSO)、CCK-8試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司；活性氧(ROS)測(cè)試盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；引物由上海生工公司設(shè)計(jì)并合成；胃饑餓素由南京肽業(yè)生物科技有限公司合成；衣霉素購(gòu)自美國(guó)Cayman Chemical公司；Trizol購(gòu)自美國(guó)Sigam公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒購(gòu)自日本Takara公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)：將MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、1%雙抗的α-MEM培養(yǎng)基中，置于5% CO2、37 ℃條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d 換液1次，待細(xì)胞密度長(zhǎng)至70%～80%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.2.2細(xì)胞活性檢測(cè)：采用CCK-8法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的細(xì)胞以5000/孔的密度接種于96孔板中，每孔100 μL，待培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 貼壁后，更換含不同濃度衣霉素的完全培養(yǎng)基，根據(jù)衣霉素的濃度分為5組，即0μg/mL組、0.5μg/mL 組、1μg/mL組、1.5μg/mL組。每組4個(gè)復(fù)孔，另設(shè)調(diào)零孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL的CCK-8試劑，孵育4 h后用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A值)。選取最敏感濃度1.5μg/mL的衣霉素濃度做后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。為驗(yàn)證ghrelin對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響，用不同濃度的ghrelin(0、10-11、10-9、10-7mol/L)預(yù)處理細(xì)胞4 h 后再加入1.5μg/mL的衣霉素干預(yù)24 h，每組4個(gè)復(fù)孔，另設(shè)零孔。培養(yǎng)結(jié)束后，采用上述方法檢測(cè)每孔吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。ghrelin的合成序列見(jiàn)圖1。

1.2.3胞內(nèi)活性氧(ROS)測(cè)定：根據(jù)ROS檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。簡(jiǎn)言之，將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞以5000/孔的密度接種于96孔板中，孵育24 h貼壁后，分組方法同前，每組4個(gè)復(fù)孔。用無(wú)血清的培養(yǎng)液將熒光探針DCFH-DA稀釋至10 μmol/L，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入50 μL的稀釋的DCFH-DA，于培養(yǎng)箱中避光孵育45 min，用PBS洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞的DCFH-DA。用熒光酶標(biāo)儀在488 nm激發(fā)波長(zhǎng)、525 nm發(fā)射波長(zhǎng)處檢測(cè)熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)：采用實(shí)時(shí)定量PCR 2-△△CT法。細(xì)胞以密度為105/孔接種于6孔板中，孵育24 h貼壁后，分組方法同上。每組設(shè)定3個(gè)平行孔。培養(yǎng)結(jié)束后，使用Trizol試劑常規(guī)提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定其純度、濃度并反轉(zhuǎn)錄為cDNA?？偡磻?yīng)體系為25 μL，包括dd水8.5 μL、正反引物各1 μL、cDNA 2 μL、TB Green Premix Ex TaqII 12.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)。各基因引物序列及引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度見(jiàn)表1。

圖1 酰化ghrelin的合成序列Fig.1 The synthetic sequence of acylated ghrelin

名稱引物序列片段長(zhǎng)度(bp)GRP78F:5′-GCCAACTGTAACAATCAA-3′R:5′-GCTGTCACTCGGAGAATA-3′165CHOPF:5′- GCTGGAAGCCTGGTATG-3′R:5′- CTTTGGGATGTGCGTGT-3′183Caspase-12F:5′-AAGGTAGGCAAGACTGGTTCC-3′R:5′-AATAGTGGGCATCTGGGTCA-3′147β-actionF:5′-CCTTCCGTGTTCCTACCC-3′R:5′-CCCAAGATGCCCTTCAGT-3′130

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 衣霉素干預(yù)對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響

與對(duì)照組相比，1.0 μg/mL和1.5 μg/mL的衣霉素干預(yù)24 h可明顯降低成骨細(xì)胞的增殖活力和生存率(P<0.05)，而0.5 μg/mL衣霉素干預(yù)24 h后對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響(P>0.05)。見(jiàn)表2。根據(jù)以上結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)決定用效果最明顯的1.5 μg/mL的衣霉素進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

組別A570存活率(%)對(duì)照組0.989±0.036100Tm(0.5 μg/mL)0.905±0.01177.12Tm(1.0 μg/mL)0.619±0.028?61.75?Tm(1.5 μg/mL)0.444±0.043??44.36??

注：Tm:衣霉素；G:ghrelin；與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 衣霉素干預(yù)對(duì)胞內(nèi)ROS的影響

用不同濃度的衣霉素干預(yù)24 h后，胞內(nèi)ROS的含量隨著衣霉素濃度的增加而增加，與對(duì)照組相比明顯升高(P<0.05)，而1.5 μg/mL的衣霉素干預(yù)細(xì)胞24 h后胞內(nèi)ROS的含量將近是空白對(duì)照組的2倍(P<0.001)。見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度的衣霉素對(duì)胞內(nèi)ROS含量的影響注：與0μg/mL的衣霉素相比，*P<0.05，**P<0.01。Fig.2 Effects of different concentrations of tunicamycin on intracellular ROS content

2.3 衣霉素干預(yù)成骨細(xì)胞對(duì)BIP、CHOP、caspase-12表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，用不同濃度的衣霉素干預(yù)成骨細(xì)胞24 h后CHOP、BIP、caspase-12 mRNA的表達(dá)水平呈濃度依賴性增加。于CHOP mRNA的表達(dá)，不同濃度的衣霉素均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。于BIP和caspase-12 mRNA的表達(dá)，1.0μg/mL和1.5μg/mL的衣霉素干預(yù)24 h后有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而0.5μg/mL的衣霉素干預(yù)24 h后無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

組別(μg/mL)CHOPBIPcaspase-12對(duì)照1.00±0.2311.00±0.1821.00±0.2370.515.68±0.470?1.29±0.2971.57±0.3621.020.49±0.124?5.71±0.673?8.23±0.450?1.527.48±0.205?8.57±0.534?10.23±0.471?

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.4 ghrelin預(yù)處理對(duì)衣霉素干預(yù)成骨細(xì)胞增殖的影響

與單純1.5 μg/mL的衣霉素相比，用不同濃度的ghrelin預(yù)處理4 h后再加入衣霉素干預(yù)24 h可以使細(xì)胞增殖活力和存活率提高。10-9mmol/L和10-7mmol/L的ghrelin組細(xì)胞增殖活力和存活率明顯提高(P<0.05),而10-11mmol/L的ghrelin組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組比，單純加入不同濃度的ghrelin干預(yù)4 h后，細(xì)胞增殖活力和生存率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表4。

組別(μg/mL+mmol/L)A570存活率(%)空白0.974±0.026100Tm0.467±0.03744.36Tm+G(10-11)0.509±0.03561.56Tm+G(10-9)0.639±0.038#73.63#Tm+G(10-7)0.741±0.031#83.87#

注：與單純1.5 μg/mL衣霉素相比，#P<0.05

2.5 ghrelin預(yù)處理對(duì)衣霉素干預(yù)成骨細(xì)胞胞內(nèi)ROS的影響

與單純1.5 μg/mL的衣霉素相比，用不同濃度的ghrelin預(yù)處理成骨細(xì)胞4 h后再加入衣霉素干預(yù)細(xì)胞24 h后，胞內(nèi)ROS的含量隨著ghrelin濃度的增加而減少。用10-11mmol/L的ghrelin預(yù)處理后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而10-9mmol/L和10-7mmol/L組的ghrelin預(yù)處理后差異有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。與對(duì)照組相比，單純ghrelin干預(yù)成骨細(xì)胞4 h,胞內(nèi)ROS的含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3 不同濃度的ghrelin預(yù)處理對(duì)衣霉素干預(yù)細(xì)胞后胞內(nèi)ROS含量的影響注：與單純1.5 μg/mL衣霉素相比，#P<0.05，##P<0.01。Fig.3 Effects of pretreatment with different concentrations of ghrelin on intracellular ROS content after tunicamycin intervention

2.6 Ghrelin預(yù)處理對(duì)衣霉素干預(yù)成骨細(xì)胞CHOP、BIP、caspase-12 mRNA表達(dá)的影響

與單純1.5 μg/mL的衣霉素相比，不同濃度的ghrelin預(yù)處理后均可降低由衣霉素引起的CHOP、BIP、caspase-12 mRNA表達(dá)的增高，對(duì)于CHOP mRNA的表達(dá)，在10-11mmol/L ghrelin干預(yù)4 h后無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，呈現(xiàn)與單純衣霉素干預(yù)組相反的趨勢(shì)(均P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5不同濃度的ghrelin預(yù)處理對(duì)衣霉素干預(yù)細(xì)胞后對(duì)CHOP、BIP、caspase-12 mRNA表達(dá)的影響

Table5Effects of pretreatment with different concentrations of ghrelin on the expression of CHOP, BIP, and caspase-12 mRNA in the cells

組別CHOPBIPcaspase-12對(duì)照組1.00±0.3251.00±0.0601.00±0.352Tm27.48±0.2058.57±0.62210.23±0.471Tm+G(10-11mmol/L)23.51±0.3365.45±0.546?7.89±0.358?Tm+G(10-9mmol/L)18.87±0.452?2.21±0.223?5.08±0.219?Tm+G(10-7mmol/L)9.06±0.209?1.19±0.856?2.67±0.177?

注：Tm:1.5 μg/mL衣霉素；G:ghrelin；與單純1.5 μg/mL衣霉素相比，*P<0.05。

3 討論

ghrelin是1999年由日本科學(xué)家Kojima發(fā)現(xiàn)的含有28個(gè)氨基酸的多肽激素，主要分泌于胃底部泌酸粘膜區(qū)的X/A細(xì)胞，另在垂體、下丘腦、肺、腎臟、睪丸、卵巢中少量分泌[11-12]。ghrelin最初發(fā)現(xiàn)是作為內(nèi)源性生長(zhǎng)激素促泌受體(GHSR)的天然配體，其主要作用是促進(jìn)食欲和生長(zhǎng)激素的分泌。因GHSR廣泛表達(dá)于多種組織中，其生物作用非常廣泛，可促進(jìn)胃蠕動(dòng)和胃酸的分泌[13]，與味覺(jué)[14]、壓力和焦慮[15]、葡萄糖的代謝[16]、心臟的輸出[17]和骨形成[8]有關(guān)。近年來(lái)隨著對(duì)ghrelin的深入研究，越來(lái)越多的證據(jù)證明ghrelin和骨質(zhì)疏松之間存在著密切的關(guān)系。Nouh等[18]以絕經(jīng)前、圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后婦女為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行骨礦物質(zhì)密度(BMD)和ghrelin水平的測(cè)定。發(fā)現(xiàn)與絕經(jīng)前組相比，圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后組的平均血漿ghrelin水平和BMD顯著下降，且ghrelin與BMD之間存在顯著的正相關(guān)，證明ghrelin可以影響B(tài)MD，但具體機(jī)制不清。有學(xué)者認(rèn)為ghrelin有可能是骨骼的潛在促進(jìn)因子[19-20]。Yu等[21]觀察到，對(duì)30位病態(tài)肥胖患者進(jìn)行胃旁路手術(shù)，20位肥胖患者進(jìn)行假手術(shù)。2年后手術(shù)組比假手術(shù)組脊柱和髖部BMD均明顯下降，且兩組中血鈣、維生素D和甲狀旁腺素(PTH)水平保持穩(wěn)定，BMD下降原因具體機(jī)制不清，因胃旁路手術(shù)后阻斷胃底部血運(yùn)，致ghrelin分泌減少。所以考慮是因ghrelin水平降低所導(dǎo)致的。但至今研究甚少，需進(jìn)一步研究證明。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)合成、折疊、運(yùn)輸?shù)闹匾?xì)胞器，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的量超過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處理能力后即會(huì)發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激?；钚匝?ROS)是生物代謝的衍生物，可破壞并氧化蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA，導(dǎo)致細(xì)胞功能改變，促進(jìn)骨質(zhì)的流失引起骨質(zhì)疏松[22]。據(jù)報(bào)道，ROS是導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯(cuò)誤蛋白折疊的主要原因[23]。觀察性研究發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松患者和去卵巢成年大鼠的ROS和BMD值之間呈負(fù)相關(guān)[24]。適度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以保護(hù)細(xì)胞的功能，而過(guò)度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激則促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中存在三種跨膜蛋白，分別是蛋白激酶激酶RNA樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase RNA-like endoplasmic retieulum kinas, PERK)，IRE1(inositol requiring kinase 1)、活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)。正常情況下，三種跨膜蛋白和分子伴侶免疫球蛋白結(jié)合蛋白/葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(immunoglobulin binding protein，BIP/glucose-regulated protein 78，GRP78)結(jié)合，使其失去活性[25]。當(dāng)適度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，BIP從三種跨膜蛋白中解離并活化PERK、IRE1、ATF6，啟動(dòng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的保護(hù)作用[26]。當(dāng)持續(xù)或過(guò)度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，細(xì)胞已不能恢復(fù)功能，則通過(guò)CHOP途徑、caspase-12途徑、JNK途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[27]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與許多疾病有關(guān)。包括癌癥[28]、神經(jīng)性疾病[29]、糖尿病[30]、心臟病[31]、肝臟疾病[32]和骨質(zhì)疏松癥[3]。而成骨細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是發(fā)生骨質(zhì)疏松的重要機(jī)制之一[3,33]，但在成骨細(xì)胞中有關(guān)ghrelin和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)系研究甚少。

本研究是探究ghrelin是否可以抑制成骨細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來(lái)預(yù)防骨質(zhì)疏松的發(fā)生。以MC3T3-E1為研究對(duì)象，通過(guò)1.5 μg/mL的衣霉素干預(yù)成骨細(xì)胞建立內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型，測(cè)定成骨細(xì)胞的增殖活力，胞內(nèi)ROS的含量、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志性基因的表達(dá)含量能反映內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。然后用不同濃度的ghrelin預(yù)處理細(xì)胞4 h后，用同樣方法檢測(cè)上述指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ghrelin預(yù)處理后細(xì)胞的存活率升高，胞內(nèi)ROS的含量和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)標(biāo)志性基因表達(dá)量降低，說(shuō)明ghrelin可以改善成骨細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。已經(jīng)提出一種ghrelin改善細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的機(jī)制，即ghrelin增加細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性[34]，我們的數(shù)據(jù)顯示ghrelin可以降低衣霉素誘導(dǎo)后胞內(nèi)ROS的含量，表明ghrelin可以上調(diào)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶或ghrelin即具有抗氧化活性。一項(xiàng)研究[35]發(fā)現(xiàn)，ghrelin可以改善由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的大鼠心肌損傷和凋亡，其可能通過(guò)激活A(yù)MP依賴的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)，AMPK作為燃料傳感器，調(diào)節(jié)細(xì)胞和全身的的能量平衡。也有研究[36]認(rèn)為，ghrelin的保護(hù)作用是由刺激GHSR所介導(dǎo)的，但具體下游機(jī)制還未確定。但有待于觀察ghrelin是否通過(guò)AMPK改善成骨細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激?，F(xiàn)已證明ghrelin可以改善心肌細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，防止動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[17]和缺血再灌注損傷[37]。ghrelin還可改善由高水平的亞硫酸鹽誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[38]。在成骨細(xì)胞中，已證明ghrelin可以改善氧化應(yīng)激帶來(lái)的細(xì)胞的凋亡[39]。雖現(xiàn)對(duì)ghrelin對(duì)成骨細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的研究甚少，但不能否定其價(jià)值。尤其對(duì)于骨質(zhì)疏松的治療，不僅可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，同時(shí)抑制細(xì)胞的凋亡，為骨質(zhì)疏松的治療提供新的方案，但需要更多的試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。