周靈通 黃凱 宋敏* 劉小鈺 蔣林博 侯紅燕 董萬濤,2

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000 2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730020

骨骼在微觀層面是一種由骨形成(bone formation)與骨吸收(bone resorption)緊密耦合的動態(tài)組織，維持骨組織形成與吸收之間動態(tài)平衡關(guān)系的生理過程被稱為骨重建(bone remodeling)[1]。近年來的研究表明，骨重建過程是在特殊的結(jié)構(gòu)——骨重建單元(bone remodeling compartment，BRC)中以基礎(chǔ)多細(xì)胞元(basic multicellular unit，BMU)的形式進(jìn)行的。BMU中包含成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨細(xì)胞等，其中破骨細(xì)胞群吸收老化或損傷的骨組織，再由成骨細(xì)胞群產(chǎn)生新生骨組織補(bǔ)充，當(dāng)新生骨組織無法完全補(bǔ)充舊骨吸收所產(chǎn)生的空隙，則導(dǎo)致每個重建周期發(fā)生骨質(zhì)流失，最終引發(fā)機(jī)體骨量減少或骨質(zhì)疏松癥[2]。

全身或局部BMU相關(guān)因子共同調(diào)節(jié)骨重建處于動態(tài)平衡之中，目前研究較多的BMU相關(guān)因子包括：OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、Wnt信號通路及PTH/PTHrP等[3]，Notch信號通路能夠影響成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨細(xì)胞等的增殖、分化，還對成骨細(xì)胞前體細(xì)胞-骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的增殖、分化、凋亡具有調(diào)節(jié)作用。有趣的是，Notch信號通路對骨形成及骨吸收的刺激和抑制作用都被廣泛報道，其在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞生成或分化中的作用出現(xiàn)了“矛盾”的結(jié)果[4-7]，表現(xiàn)為對于骨形成-骨吸收偶聯(lián)關(guān)系的雙向調(diào)節(jié)作用。本文就Notch信號通路對成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生成、分化及功能的雙向調(diào)節(jié)作用做一綜述，以期為相關(guān)骨代謝疾病的研究思路提供參考。

1 Notch通路概述

1919年Morgan等發(fā)現(xiàn)果蠅中一種特定基因缺損后導(dǎo)致其翅膀邊緣出現(xiàn)缺口，因此將該基因命名為Notch，而后的研究表明Notch信號通路在生物體生長發(fā)育的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起重要作用[8]。Notch基因能夠編碼一類膜蛋白受體(包括：Notch 1、2、3、4)，其配體(包括：Jagged 1、2和Delta[Dll] 1、3、4)是位于相鄰細(xì)胞表面上的另一種膜蛋白，因此經(jīng)典的Notch信號傳導(dǎo)需要至少2個完整的細(xì)胞，即細(xì)胞表面表達(dá)Notch受體的“信號接收細(xì)胞”和表達(dá)配體的“信號發(fā)送細(xì)胞”[9]，Notch信號傳導(dǎo)的核心機(jī)制在于“信號發(fā)送細(xì)胞”上的5個Notch配體中的Jagged和Dll 1、4可直接相互作用并激活存在于“接受細(xì)胞”上的跨膜Notch受體，Notch受體需要經(jīng)過3次蛋白水解最終導(dǎo)致Notch通路的激活[10]。第一次水解發(fā)生于高爾基復(fù)合體，經(jīng)弗林轉(zhuǎn)化酶(furin)作用后轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜形成異二聚體[11]，由此產(chǎn)生的兩個Notch片段在膜上保持非共價締合。當(dāng)配體結(jié)合到Notch受體胞外區(qū)后會啟動膜上典型的Notch通路活化，該活化過程依賴于“信號細(xì)胞”中Notch配體內(nèi)吞作用形成物理牽引機(jī)制[12-13]，產(chǎn)生ADAM金屬蛋白酶(α-分泌酶)，催化肽鍵斷裂釋放Notch胞外區(qū)，完成第二次水解。然后，由γ-分泌酶(γ-secretase)在靠近胞膜內(nèi)的部位“切割”(第三次蛋白水解)[14],釋放Notch細(xì)胞內(nèi)段NICD結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，與DNA結(jié)合蛋白CSL(CBF1/Rbpj)結(jié)合后活化Hes和Hey等靶基因的轉(zhuǎn)錄，最終對細(xì)胞的分化、增殖和凋亡等過程產(chǎn)生效應(yīng)。

圖1 經(jīng)典Notch信號傳導(dǎo)示意圖Fig.1 General Notch signaling diagram

除此之外，Notch非經(jīng)典激活途徑也受到關(guān)注，細(xì)胞微環(huán)境中的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)能夠直接與Notch受體/配體發(fā)生相互作用介導(dǎo)Notch通路下游分子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[15-16]。微環(huán)境中其他常見的生長因子和細(xì)胞因子，如TGF-β[17-18]、WNT/β-連環(huán)蛋白[19]和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)[20]等均能夠與Notch通路相互作用，引發(fā)其與其他信號網(wǎng)絡(luò)間的“對話”作用。最后，氧氣張力、血糖濃度、剪切應(yīng)力等因素也能在一定程度上影響Notch信號的激活和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[21-23]。

2 Notch通路與骨重建

2.1 Notch通路與成骨細(xì)胞

成骨細(xì)胞是骨重建過程中負(fù)責(zé)骨形成作用最主要的細(xì)胞之一，在初期骨架形成階段及后期骨生長過程中起重要作用。骨的形成有兩種機(jī)制，即膜化骨和軟骨化骨，膜化骨主要發(fā)生于扁平骨的形成，此過程中間充質(zhì)干細(xì)胞聚集分化為骨祖細(xì)胞，并逐漸生長分化為成熟的成骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞分泌 I 型膠原蛋白(Col I)作為構(gòu)成骨的原材料，還能夠產(chǎn)生骨鈣素(BGP)和堿性磷酸酶(ALP)促進(jìn)礦物質(zhì)的沉積。軟骨化骨通過間充質(zhì)干細(xì)胞增殖分化形成軟骨雛形，血管入侵后滋養(yǎng)深層骨祖細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞在軟骨表面產(chǎn)生類骨質(zhì)并逐漸被鈣化為骨基質(zhì)，骨基質(zhì)包繞形成初級骨松質(zhì)，成骨細(xì)胞不斷向骨小梁壁添加新骨基質(zhì)，同時破骨細(xì)胞、堿性磷酸酶等作用下軟骨退化形成初級骨化中心，并不斷從骨干中段向兩端進(jìn)行，延長骨干長度[24]。

一方面，Notch通路具有促進(jìn)成骨細(xì)胞活性及功能的作用。Engin等[25]研究高表達(dá)Notch1細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(N1ICD)的轉(zhuǎn)基因小鼠，發(fā)現(xiàn)4周齡時X線拍照顯示其骨質(zhì)量增加，11周齡時，甲苯胺藍(lán)染色顯示轉(zhuǎn)基因組小鼠的成骨細(xì)胞數(shù)量增加，組織形態(tài)計量學(xué)顯示骨小梁體積和成骨細(xì)胞數(shù)顯著增加。在成骨細(xì)胞MC3T3-E1中轉(zhuǎn)染由腺病毒載體遞送的Notch-IC，長期培養(yǎng)后觀察到鈣化結(jié)節(jié)形成顯著增加[26]。Nobta等[27]對股骨骨缺損小鼠模型行免疫組化發(fā)現(xiàn)Notch1在損傷部位成骨細(xì)胞中被激活，造模后第5天，Notch1、Delta1和Jagged1的表達(dá)均上調(diào)，表明在骨再生期間Notch通路上調(diào)Notch1、Delta1和Jagged1的表達(dá)來促進(jìn)成骨細(xì)胞成骨活性。

另一方面，Notch通路具有抑制成骨細(xì)胞活性及功能的作用。缺失Notch基因的突變小鼠胚胎成骨細(xì)胞中骨涎蛋白(Ibsp)、ColⅠ和ALP的表達(dá)水平較正常小鼠增高，說明Notch通路阻斷引起成骨細(xì)胞過度增殖[28]。Zanotti等[29]的研究發(fā)現(xiàn)在Notch過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠MC3T3成骨細(xì)胞中，胞漿β-連環(huán)蛋白水平和ALP活性顯著降低，高表達(dá)NICD的轉(zhuǎn)基因小鼠成骨細(xì)胞中BMP-2、Wnt3a和骨鈣素水平較正常組顯著下降。而β-連環(huán)蛋白、BMP-2、Wnt3a為Wnt/β-連環(huán)蛋白、BMPs通路等主要成骨信號通絡(luò)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，由此可知Notch通路可以通過與其他成骨信號通路交互作用發(fā)揮其對成骨細(xì)胞分化及成骨功能的抑制作用。

2.2 Notch通路與破骨細(xì)胞

破骨細(xì)胞是在巨噬細(xì)胞集落刺激因子(MCSF)和NF-κB配體(RANKL)受體激活劑的影響下從骨髓前體分化而來的多核巨細(xì)胞[30]，是骨重建過程中唯一確定具有降解骨骼作用的細(xì)胞，其功能對維持骨形成-骨吸收的動態(tài)平衡關(guān)系至關(guān)重要。破骨細(xì)胞的生成、壽命和活性受到全身性激素以及骨微環(huán)境中的相鄰細(xì)胞自分泌和旁分泌細(xì)胞因子和生長因子的調(diào)節(jié)，包括：OPG / RANKL / RANK信號通路、雌激素、整合素、骨鈣素、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)及溶酶體等[31]，破骨細(xì)胞形成和活化與骨質(zhì)疏松癥、骨硬化病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病關(guān)系密切。

Notch通路能夠促進(jìn)破骨細(xì)胞生成和活化。Canalis等[32]發(fā)現(xiàn)Notch通路中Notch2的ICD片段與核因子(NF)-κB的相互作用，導(dǎo)致Nfatc1(一種破骨細(xì)胞生成的關(guān)鍵基因)的轉(zhuǎn)錄，最終誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成增加。用γ-分泌酶抑制劑及Notch2mRNA抑制劑干預(yù)后顯示RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成下降?？梢?，Notch和NF-κB通路之間可以通過分子交聯(lián)作用于破骨細(xì)胞生成。Zhou等[33]也發(fā)現(xiàn)LNX2基因敲除的骨髓巨噬細(xì)胞中Numb(一種Notch抑制劑)蛋白的積累增加，同時其分化為破骨細(xì)胞的能力減弱。這些均證明Notch通路能夠在一定程度上促進(jìn)破骨細(xì)胞生成和活化，促進(jìn)骨吸收。

Notch通路也能夠抑制破骨細(xì)胞生成和活化。Notch基因突變導(dǎo)致人體骨骼發(fā)育缺陷，如脊椎肋骨發(fā)育不全(spondylocostal dysostosis，STD)是由人類Notch配體DLL3突變引起的[34]，而Notch2突變會引起Hagdu-Cheney綜合征——一種以面部異常，骨質(zhì)溶解為特征的罕見疾病[35]。Matthew等[28]對8周齡Notch相關(guān)基因缺失(PNN)小鼠脛骨切片的Trap染色顯示，基因缺失小鼠在每個骨表面區(qū)域具有比對照組更多的破骨細(xì)胞，破骨細(xì)胞侵蝕的骨表面百分比也增加。Yamada等[36]發(fā)現(xiàn)由Delta1激活Notch通路后，減少了破骨細(xì)胞前體細(xì)胞中巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體c-Fms的表面表達(dá)，并增強(qiáng)骨保護(hù)素在基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)，導(dǎo)致破骨細(xì)胞生成的下調(diào)。Bai等[37]的實驗也證實破骨細(xì)胞前體中notch1、2、3的缺失能夠增強(qiáng)破骨細(xì)胞生成和骨吸收。以上表明Notch通路對破骨細(xì)胞生成及功能的抑制作用。

2.3 Notch通路與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

干細(xì)胞(stem cell，SC)是指一類具有自我更新和分化能力的多能細(xì)胞，根據(jù)干細(xì)胞所處的發(fā)育階段可分為胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ESC)和成體干細(xì)胞 (adult stem cell，ASC)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)是存在于骨髓微環(huán)境中的具有自我更新能力和多向分化潛能的干細(xì)胞[39]，是干細(xì)胞家族的重要成員，在適宜的誘導(dǎo)條件下可向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等多個方向分化。近年來，越來越多的研究表明，隨著機(jī)體的衰老，骨髓中BMSCs的含量下降，BMSCs向脂肪細(xì)胞分化增多而向成骨細(xì)胞分化減少，BMSCs成骨成脂分化失衡可能是骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制之一。

Notch通路促進(jìn)BMSCs成骨分化、抑制BMSCs成脂分化。有學(xué)者[39]應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染hMSCs使Notch1的ICD片段過表達(dá)，通過比較細(xì)胞內(nèi)ALP、進(jìn)行茜素紅染色等，證明Notch通路能夠促進(jìn)hMSCs的成骨分化。Tezuka[26]等發(fā)現(xiàn)被EGFP-NIC腺病毒感染5天，hMSCs中ALP活性增強(qiáng)，ColⅠ的表達(dá)也相應(yīng)增加，并認(rèn)為Notch1可能是治療骨質(zhì)疏松癥的獨(dú)特靶分子。Nobta等[40-41]也用病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)使MSCs中Notch配體Jagged1和Delta1過表達(dá)，進(jìn)行成脂誘導(dǎo)后發(fā)現(xiàn)其成脂分化相關(guān)因子過氧化物酶體增殖物激活受體γ亞型(PPAR-γ)、脂肪酸結(jié)合蛋白-4(FABP-4)較對照組顯著降低。DAPT作為γ-分泌酶的抑制劑，能夠有效阻斷Notch受體的細(xì)胞內(nèi)蛋白水解，是常用的Notch信號通路阻斷劑[42]。Yaoting等[43]用DAPT干預(yù)成骨誘導(dǎo)分化的BMSCs，發(fā)現(xiàn)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d后，DAPT組礦化結(jié)節(jié)數(shù)量明顯低于對照組。還有報道[42]顯示，DAPT干預(yù)BMSCs成骨分化能夠顯著降低礦化相關(guān)基因如細(xì)胞外基質(zhì)磷酸糖蛋白(Mepe)、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白-1(Dmp1)、硬化蛋白(Sost)和維生素D低磷性佝僂病蛋白(Phex)的表達(dá)。

Notch通路也能抑制BMSCs成骨分化、促進(jìn)BMSCs成脂分化。Sciaudone等[44]應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄病毒使NotchIC轉(zhuǎn)染小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞(ST-2)后，CBF1 / RBP-Jκ途徑被激活并且經(jīng)典Wnt途徑被抑制，成脂誘導(dǎo)后發(fā)現(xiàn)Notch IC有利于ST-2細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞。Nicolas等[45]發(fā)現(xiàn)在基質(zhì)細(xì)胞如角質(zhì)形成細(xì)胞中，也存在Notch IC缺失導(dǎo)致β-連環(huán)蛋白水平升高，重新引入Notch受體后可以抑制β-連環(huán)蛋白水平增高的現(xiàn)象，可知Notch信號在一定條件下具有抑制Wnt信號傳導(dǎo)的作用。Liu等[46]在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(MRL/lpr小鼠)小鼠模型中,觀察到BMSCs中Notch信號的持續(xù)活化：Notch1、Notch2、Jag1和NICD蛋白的高表達(dá)，同時觀察到模型小鼠嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松表型。當(dāng)通過DAPT間歇性抑制MRL/lpr小鼠中的Notch信號傳導(dǎo)時，其骨形成作用顯著增強(qiáng)。

3 Notch基因突變與骨骼疾病

以上論述說明Notch對骨重建過程起重要調(diào)節(jié)作用，在骨骼的生長發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用，Notch基因的獲得性及喪失性突變能夠造成多種重要的骨骼疾病。Adams-Oliver綜合征(AOS)是一類表現(xiàn)為先天性皮膚發(fā)育不良伴有顱骨缺損、指(趾)殘缺，部分掌骨缺如等臨床癥狀的骨骼系統(tǒng)罕見疾病[47]。Stittrich等[48]發(fā)現(xiàn)AOS的大多數(shù)基因突變發(fā)生在細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的EGF樣重復(fù)序列中，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)改變和Notch1功能缺失。Alagille綜合征是一種常染色體顯性遺傳病，以顱面骨骼和椎骨發(fā)育異常、膽汁淤積性肝病、腎功能衰竭等為特征[49]，研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)病與Jagged1基因喪失性突變關(guān)系密切[50]，而該病患者腎臟發(fā)育不良及功能不全與Notch2基因喪失性突變有關(guān)[51]。短指癥(Brachydactyly) 是以指骨短、缺失或掌骨變短致使手指、腳趾短為特征的遺傳性疾病[52-53]，有研究[54]表明Notch信號的過度活化是造成該疾病的重要原因。Hajdu-Cheney綜合征(HCS)是一種罕見的遺傳疾病，其特征在于指/趾骨遠(yuǎn)端骨質(zhì)溶解、變形以及骨骼，牙齒和關(guān)節(jié)的發(fā)育缺陷，導(dǎo)致顱面和顱骨特異性改變、骨質(zhì)疏松和身材矮小[55-56]，Canalis等[57]的研究發(fā)現(xiàn)HCS患者骨質(zhì)溶解及改變與Notch2過度激活、Notch2 NICD與NfκB共同誘導(dǎo)破骨細(xì)胞前體中的Nfatc1，刺激破骨細(xì)胞分化有關(guān)。骨肉瘤作為最常見的原發(fā)性骨惡性腫瘤，決定其發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制尚未完全清楚，最近有研究[58-59]表明Notch2和JAG1在大多數(shù)骨肉瘤樣品中上調(diào)，Notch1和DLL1在一名患者中上調(diào)，Notch靶基因，尤其是HEY1和HEY2均在骨肉瘤樣品中上調(diào)，因此Notch受體和配體可能成為骨肉瘤的治療靶點(diǎn)。

4 小結(jié)

Notch信號通路對骨形成或骨吸收過程的影響并非單一的促進(jìn)或抑制作用，而是在全身或局部相關(guān)因子共同影響下的雙向調(diào)節(jié)，其作用表現(xiàn)為調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞譜系細(xì)胞的分化和功能，并在骨骼發(fā)育，軟骨形成，成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞生成及功能中起關(guān)鍵作用。Notch信號的雙向調(diào)節(jié)機(jī)制對維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和骨重建機(jī)制至關(guān)重要。有學(xué)者認(rèn)為不同的Notch信號分子發(fā)揮不同的調(diào)節(jié)作用，如在一定條件下，Notch1抑制破骨細(xì)胞生成，而Notch2通過與NfκB相互作用誘導(dǎo)Nfatc1和破骨細(xì)胞分化[60]；而Yaoting等認(rèn)為細(xì)胞不同分化時期Notch信號發(fā)揮的作用不同，在成骨細(xì)胞分化的早期階段，Notch信號的持續(xù)激活抑制了BMSC向成骨細(xì)胞的分化，導(dǎo)致BMSCs增多和BMSCs向骨細(xì)胞分化減少，在成骨細(xì)胞分化的晚期階段Notch信號的持續(xù)激活促進(jìn)成骨細(xì)胞分化為骨細(xì)胞，導(dǎo)致成骨細(xì)胞數(shù)目暫時減少和骨細(xì)胞數(shù)量增加[43]。另外，Notch通路各環(huán)節(jié)信號分子基因獲得性及喪失性突變導(dǎo)致各種遺傳性疾病伴有顯著的骨骼異常表現(xiàn)，則更進(jìn)一步說明了Notch信號在骨骼發(fā)育及骨代謝中的重要作用，深入研究Notch信號通路在調(diào)節(jié)骨形成-骨吸收中的具體作用機(jī)制，對于探索相關(guān)骨骼系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制及治療新思路具有重要意義。