信嘉軒 教傳華 商 華 朱雁飛 肖韓艷 李 麗 李文媛

牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，黑龍江牡丹江 157001

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是老年人群中常見的一組病因未明的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，特別是對于年齡＞65 歲的老年人，女性更常見[1-3]。該病主要表現(xiàn)為持續(xù)的認(rèn)知功能障礙以漸進(jìn)性記憶障礙、認(rèn)知功能喪失伴日常生活能力下降和行為改變?yōu)樘卣?，其發(fā)病率隨年齡增加而不斷增高。AD 顯著增加了家庭的負(fù)擔(dān)，且發(fā)病率逐年增加，已成為一個全球的健康問題[4-6]。AD 典型的病理特征主要表現(xiàn)為細(xì)胞外淀粉樣蛋白沉積形成老年斑、細(xì)胞內(nèi)Tau 蛋白高度磷酸化形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)以及神經(jīng)元大量凋亡。β-淀粉樣蛋白（β-amyloid peptide，Aβ）的生成和聚集在AD的發(fā)病中起核心作用。Aβ 被認(rèn)為在神經(jīng)干細(xì)胞（NSC）中具有強(qiáng)大的神經(jīng)毒性。NSC 是自我更新的多能細(xì)胞，遷移到最終的位置和功能，成為神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞。然后，基于NSC 治療的臨床發(fā)展仍處于起步階段。姜黃素是一種多酚類化合物，提取自中藥姜黃，可用作香料、食用色素和傳統(tǒng)草藥，具有抗氧化、抗炎、抗癌、改善腦功能、控制肥胖和糖尿病等保健作用[7-8]。相關(guān)研究結(jié)果表明，姜黃素具有多效性，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子（如NF-kB）、細(xì)胞因子（如 IL6， TNF-α）、粘附分子（如ICAM-1）和酶（如 MMPs），在炎癥和惡性腫瘤中起主要作用[9-11]。姜黃素對Aβ 誘導(dǎo)的NSC 損傷是否具有保護(hù)作用尚待研究。本研究旨在探討姜黃素對Aβ 誘導(dǎo)的NSC 損傷的影響。

1 資料與方法

1.1 NSC的提取與分組

選取孕14.5d 的 C57/BL6 小鼠，購買于昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證號SCXK（滇）-2011004。取胎鼠前腦的側(cè)腦室顆粒下層，剪碎，消化為單個細(xì)胞，將細(xì)胞重懸于12 孔板。體外培養(yǎng)5 ～7d，取5 ～7 代NSC 用 于 實(shí) 驗(yàn)。將NSC 隨機(jī)分為對照組、姜黃素組、Aβ 組和觀察組，分別加入DMSO（10 μL）、5 μmol/L 姜黃素10 μL、0.5 μmol/L Aβ 溶液（10μL）及DMSO（10μL）、5 μmol/L 姜黃素和0.5μmol/L Aβ 溶液 10 μL。

1.2 噻唑藍(lán)（MTT）測定細(xì)胞活力

NSC 置于96 孔板，每孔加入0.2mL NSC 貼壁培養(yǎng)基并給予處理，體外培養(yǎng)48h，采用MTT 法檢測細(xì)胞活性，使用酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices 公司，型號FlexStation 3）450nm 測定吸光度。細(xì)胞活力=（吸光度/溶劑空白對照組吸光度）× 100%。

1.3 RT-PCR測定

RT-PCR 測定NSC 中巢蛋白（Nestin） mRNA 及凋亡相關(guān)基因Caspase3 mRNA 表達(dá)。Trizol 試劑提取總RNA，按照 mRNA 試劑盒操作說明合成。RNA 純度和濃度用紫外分光光度法測定。Caspase-3 引物上游序列：5’-CAAACTTTTTCAGAGGGGATCG-3’，下游序列5’-GCATACTGTTTCAGCAGTTCA-3’，270bp。Nestin 上游 序 列：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下 游 序 列5’-TYGGCTCCACCCTTCAAGTG-3’。內(nèi) 對 照 基 因β 肌 動 蛋 白（β-actin） 引物：5’-GTGGGGCGCCCCAGGC A C C A-3’，5’CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’，682 bp。1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。每組重復(fù)3 次。

1.4 免疫組化染色

采用免疫組化染色檢測神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記分子Tuj-1 和膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）的表達(dá)。PBS液漂洗貼壁細(xì)胞后使用4%多聚甲醛固定細(xì)胞20min，0.3%的Triton-100 打孔15min，封固洗膜，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色、顯影、定影。曝光后保存圖片，采用Image J 軟件計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)目。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對NSC活力的影響

與對照組比較，姜黃素組NSC 的細(xì)胞活力、Nestin mRNA 表 達(dá) 明 顯 增 加，Caspase3 mRNA 表 達(dá)明顯降低（P ＜0.05 或P ＜0.01），而Aβ 組和觀察組NSC 活力、Nestin mRNA 表達(dá)明顯降低，Caspase3 mRNA 表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05或P ＜0.01）。與Aβ 組比較，觀察組NSCs 細(xì)胞活力、Nestin mRNA 表達(dá)增加，Caspase3 mRNA 表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），見表1。

表1 姜黃素對NSC增殖及凋亡的影響（n=5）

2.2 姜黃素對NSC分化的影響

與對照組比較，Aβ 組Tuj-1、GFAP 比例明顯減少（P ＜0.01）；姜黃素組Tuj-1 明顯升高，GFAP 明顯降低（P ＜0.05）；與Aβ 組比較，觀察組Tuj-1、GFAP 明顯增加（P ＜0.01），但明顯低于對照組（P ＜0.05），見表2。

表2 各組Tuj-1和GFAP表達(dá)水平的比較（%）

3 討論

AD 是一種具有破壞性的神經(jīng)退行性疾病，治療方法有限，Aβ 是AD 的一個標(biāo)志，它在NSC 中具有強(qiáng)大的神經(jīng)毒性[12]。NSC 是一類具有分裂潛能和自我更新能力的前體細(xì)胞，盡管NSC 領(lǐng)域的工作已超過20 年，但該領(lǐng)域仍處于起步階段，因?yàn)槟壳皩ι窠?jīng)系統(tǒng)疾病中可用于改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生的基本機(jī)制的了解仍在不斷增長，通過促進(jìn)神經(jīng)新生來治療AD 已經(jīng)成為了NSC 研究的主要方向之一，為神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的治療開辟了新的方向。

近年來的研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的分子在NSC 的細(xì)胞命運(yùn)決定中起著重要作用[13]。Tuj-1 和GFAP 為神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記分子。GFAP 是中樞神經(jīng)系統(tǒng)星形膠質(zhì)細(xì)胞、周圍神經(jīng)系統(tǒng)非髓鞘雪旺細(xì)胞和腸內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞中唯一發(fā)現(xiàn)的中間絲Ⅲ蛋白。GFAP基因激活和蛋白誘導(dǎo)似乎在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和神經(jīng)退行性變后的星形膠質(zhì)細(xì)胞激活（星形膠質(zhì)細(xì)胞?。┲衅鹬P(guān)鍵作用。GFAP 及其分解產(chǎn)物迅速釋放到生物流體中，使其成為此類神經(jīng)疾病的有力候選生物標(biāo)記物。

姜黃素是姜科姜黃屬植物根莖的提取物，近年來，有研究結(jié)果究顯示，姜黃素具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用，并且姜黃素可刺激胚胎神經(jīng)前體細(xì)胞增殖，也可增強(qiáng)成年海馬的神經(jīng)發(fā)生[14-16]。姜黃素是一種天然小分子多酚類化合物，是姜黃中一種著名的二芳基庚烷類化合物，姜黃素有抗腫瘤活性[17]，能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成，抑制某些酶活性，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的信號傳導(dǎo)等[18]。姜黃素的抗癌作用主要是由于腫瘤細(xì)胞凋亡通路的激活，以及抑制腫瘤微環(huán)境如炎癥、血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移等所引起的[19-26]。盧曉云等[27]研究發(fā)現(xiàn)姜黃素對AOM/DSS 致腸癌有一定的抑制作用，能通過調(diào)控Wnt/β-連環(huán)素信號通路阻斷EMT 過程，起到防治結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌的作用。李新等[28]研究認(rèn)為下調(diào)KLF8 基因表達(dá)和姜黃素均能通過抑制JAK2/STAT3 信號通路降低乳腺癌細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，兩者聯(lián)合對細(xì)胞活力及凋亡的影響作用更強(qiáng)。唐鄧等[29]研究認(rèn)為姜黃素在較低濃度時(shí)可促進(jìn)胃正常上皮GES-1 細(xì)胞遷移及侵襲能力，姜黃素在高濃度（80μmol/L）時(shí)可抑制細(xì)胞遷移及侵襲能力，對胃正常上皮細(xì)胞及不同分化程度胃腺癌細(xì)胞的增殖抑制、誘導(dǎo)凋亡及遷移侵襲能力均呈劑量及時(shí)間依賴性。楊秦梅等[30]研究認(rèn)為姜黃素抑制肺癌干細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡與Notch 信號通路有關(guān)。

本研究通過測定nestin 的表達(dá)來鑒定NSC，并通過免疫熒光雙重標(biāo)記Tuj-1 和 GFAP 來評價(jià)NSC的分化，結(jié)果顯示， 與對照組比較，姜黃素組NSC的細(xì)胞活力、Nestin mRNA 表達(dá)明顯增加，Caspase3 mRNA 表 達(dá) 明 顯 降 低（P ＜0.05 或P ＜0.01），而Aβ 組和觀察組NSC 活力、Nestin mRNA 表達(dá)明顯降低，Caspase3 mRNA 表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）；與Aβ 組比較，觀察組NSCs 細(xì)胞活力、Nestin mRNA 表達(dá)增加，Caspase3 mRNA 表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01），提示姜黃素能增加NSC增殖速度，增加NSC 活力，促進(jìn)NSCNestin 蛋白mRNA 表達(dá)，降低凋亡蛋白Caspase3 mRNA 表達(dá)，逆轉(zhuǎn)AB 對NSC 的損傷，姜黃素的神經(jīng)保護(hù)作用，可能是通過降低凋亡蛋白表達(dá)來發(fā)揮保護(hù)NSC、促進(jìn)NSC 增殖的作用。與對照組比較，Aβ 組Tuj-1、GFAP 比例明顯減少（P ＜0.01）；姜黃素組Tuj-1明顯升高，GFAP 明顯降低（P ＜0.05）；與Aβ 組比較，觀察組Tuj-1、GFAP 明顯增加（P ＜0.01），但明顯低于對照組（P ＜0.05），提示Aβ 組NSC向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞分化比例均減少，姜黃素組NSC 向神經(jīng)元分化，減少星形膠質(zhì)細(xì)胞分化比例；觀察組神經(jīng)元分化Aβ 組增加，但低于對照組。

綜述所述，姜黃素可促進(jìn)NSC 增殖，促進(jìn)NSC向神經(jīng)元分化，逆轉(zhuǎn)Aβ 對NSC 的損傷可能是由于抑制了凋亡基因表達(dá)，為功能性神經(jīng)元治療Aβ 沉積所致神經(jīng)損傷性疾病提供理論依據(jù)。