易潤青 全向陽

【摘要】 目的：觀察川芎嗪對創(chuàng)傷性顱腦損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法：選取72只雄性SD大鼠，采用PCI3000建立創(chuàng)傷性顱腦損傷模型，造模成功后隨機(jī)分為模型組（n=15）、川芎嗪低劑量（10 mg/kg）組（n=15）、川芎嗪中劑量（20 mg/kg）組（n=15）、川芎嗪高劑量（40 mg/kg）組（n=15），同時建立假手術(shù)組（n=12）作為對照。川芎嗪三個劑量組分別尾靜脈注射給予相應(yīng)劑量的鹽酸川芎嗪注射液，1次/d，連續(xù)7 d，模型組和假手術(shù)組給予等體積的生理鹽水。給藥第2、4、6、8天分別進(jìn)行轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)和紙條粘附試驗(yàn)，第8天大鼠安樂死后取材進(jìn)行NeuN神經(jīng)元免疫組化染色和凋亡相關(guān)蛋白檢測。結(jié)果：川芎嗪中、高劑量組大鼠轉(zhuǎn)棒時間和紙條撕掉時間均短于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;川芎嗪中、高劑量組腦梗死體積分別為（16.50±2.59）、（14.10±2.29）mm3，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。免疫組化染色發(fā)現(xiàn)川芎嗪高劑量組和模型組TBI大鼠損傷區(qū)周圍皮層神經(jīng)元細(xì)胞存活數(shù)目分別為（290.70±41.19）和（225.00±59.44）個，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;Westernblot研究可見，與模型組相比，川芎嗪高劑量組Bax蛋白表達(dá)降低、Bcl-2蛋白表達(dá)升高、Bcl-2/Bax比例升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：川芎嗪對創(chuàng)傷性顱腦損傷大鼠具有很好的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞損傷有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 川芎嗪; 創(chuàng)傷性顱腦損傷; 氧化應(yīng)激; 細(xì)胞凋亡

【Abstract】 Objective：To observe the protective effect and mechanism of tetramethylpyrazine on traumatic craniocerebral injury.Method：72 male SD rats were selected and PCI3000 was used to establish the traumatic craniocerebral injury model，after successful modeling，they were randomly divided into the model group（n=15），the low dose（10 mg/kg）group（n=15），the medium dose（20 mg/kg）group（n=15），and the high dose（40 mg/kg）group（n=15），meanwhile，the sham operation group（n=12）was established as the control.Tetramethylpyrazine Hydrochloride Injection was injected into the tail vein of three dose groups，1 time/day for 7 days.The model group and the sham group were given equal volume saline.Rod transfer test and strip adhesion test were performed on days 2，4，6 and 8 after administration，after the rats were euthanized on day 8，NeuN neuron immunohistochemical staining and apoptosis-related protein detection were performed.Result：The rotarod test time and adhesive paper removal time in the tetramethylpyrazine medium group and the high dose group were significantly shorter than those in TBI model group，the differences were statistically significant（P<0.05）.Brain infarction volume was（16.50±2.59）mm3 ?and（14.10±2.29）mm3 in the tetramethylpyrazine medium dose group and high dose group，which were significantly decreased compared with model group（P<0.05）.Immunohistochemistry study showed that the NeuN+ neurons in the periphery area of TBI injury were（290.70±41.19）and（225.00±59.44）in the tetramethylpyrazine high dose group and model group，the difference between the two groups was statistically significant（P<0.05）.Western blot results displayed that，in tetramethylpyrazine high dose group，the Bax protein expression markedly decreased，Bcl-2 protein expression and the ratio of Bcl-2/Bax also obviously increased compared with than those of the model group（P<0.05）.Conclusion：Tetramethylpyrazine has a good protective effect on rats with traumatic brain injury and its mechanism may be related to the inhibition of apoptosis and the protection of nerve cell injury，Tetramethylpyrazine has a protective effect on rats with traumatic brain injury，which may be related to its inhibition of apoptosis.

【Key words】 Tetramethylpyrazine; Traumatic brain injury; Oxidative stress; Apoptosis

First-authors address：Guangzhou Medical Vocationl School，Guangzhou 510430，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.17.007

創(chuàng)傷性顱腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是神經(jīng)外科常見疾病。全球患病人數(shù)約為3 000多萬，每年死亡人數(shù)高于100萬。在中國，每年約有100萬TBI患者，死亡人數(shù)近十萬余人。TBI治療除了手術(shù)和常規(guī)對癥治療外，尚無有效的治療手段。TBI發(fā)病機(jī)制主要為直接創(chuàng)傷性顱腦損傷和繼發(fā)的氧化應(yīng)激損傷、細(xì)胞鈣超載、血管應(yīng)激性痙攣、氨基酸興奮性毒性等[1]，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡、神經(jīng)傳遞功能障礙并最終引起神經(jīng)功能的缺損。由于TBI發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，單一靶點(diǎn)藥物藥效有限，而多個靶點(diǎn)的藥物可能對TBI治療具有很好的作用。川芎嗪（tetramethylpyrazine，TMP）是中藥川芎的有效成分，其作用機(jī)制主要包括抑制鈣超載、清除自由基、舒張血管、抑制細(xì)胞凋亡、改善線粒體功能、抑制細(xì)胞炎性反應(yīng)等多種作用，臨床上主要用于缺血性腦卒中的治療[2]。近年來研究還發(fā)現(xiàn)川芎嗪還可以緩解蛛網(wǎng)膜下腔出血血管痙攣[3]，提示川芎嗪有可能對TBI具有很好的治療作用。然而目前尚未見川芎嗪對創(chuàng)傷性顱腦損傷的治療作用的研究報道，本研究旨在探討川芎嗪治療TBI的作用及其機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)?，F(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物與主要試劑 鹽酸川芎嗪注射液（生產(chǎn)廠家：鄭州卓峰制藥有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20055479，規(guī)格：2 mL︰40 mg）;0.9%氯化鈉注射液（生產(chǎn)廠家：山東齊都藥業(yè)有限公司）;Neu一抗購于Millipore公司;GFAP一抗、Bcl-2一抗、Bax一抗、Caspase-3一抗購于CST公司、GTVisionTM免疫組化檢測試劑盒購于上?；蚩萍加邢薰尽?/p>

1.2 儀器設(shè)備 PCI-3000顱腦損傷儀（Hatteras）;異氟烷麻醉系統(tǒng)（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）;PL3001天平（梅特勒-特利多）;大鼠轉(zhuǎn)棒儀（淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司）;164-5050電泳儀（Bio-Rad）;IS4000MM蛋白凝膠成像系統(tǒng)（Carestream）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物 雄性SD大鼠72只，體重300～350 g，購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2013-0002。大鼠飼養(yǎng)于SPF級實(shí)驗(yàn)動物中心，正常飼養(yǎng)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 TBI模型建立 SD大鼠造模前禁食不禁水至少10 h，采用異氟烷麻醉后規(guī)定到大鼠立體定位儀上，以大鼠前囟后右側(cè)旁開2 mm為起點(diǎn)，在前囟與后囟之間開約25 mm2骨窗。采用PCI3000顱腦損傷儀造模，選擇直徑為5 mm撞針，撞擊參數(shù)按照文獻(xiàn)[4]設(shè)定為速度1.5 m/s、深度5 mm、停留時間120 ms。假手術(shù)組僅開顱不采用顱腦損傷儀造模。術(shù)后縫合切口、碘伏消毒后放回SPF動物中心繼續(xù)正常飼養(yǎng)。

1.4.2 大鼠分組與給藥 大鼠TBI造模后隨機(jī)分為4組，模型組、川芎嗪低劑量（10 mg/kg）組、中劑量（20 mg/kg）組、高劑量（40 mg/kg）組，同時采用假手術(shù)大鼠作為對照（給予0.9%氯化鈉注射液），其中假手術(shù)組12只大鼠，其余每組15只大鼠。大鼠按照每組平均體重計(jì)算給藥量，每組大鼠按照川芎嗪低劑量組給藥體積調(diào)整每組的給藥體積，保證每只大鼠給藥體積相當(dāng)。TBI大鼠造模后當(dāng)日立即尾靜脈注射給藥1次，之后每日早上給藥一次，連續(xù)給藥7 d。

1.4.3 大鼠轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)行為學(xué)評價 大鼠在動物房飼養(yǎng)3 d后，參照文獻(xiàn)[5-6]連續(xù)3 d進(jìn)行大鼠轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練，排除不合格大鼠后造模，并記錄訓(xùn)練第3天合格大鼠的轉(zhuǎn)棒時間。造模后2 h和給藥第2、4、6、8天分別進(jìn)行測試，評價大鼠綜合運(yùn)動能力。

1.4.4 大鼠紙條粘附實(shí)驗(yàn)評價 參照文獻(xiàn)[7]制作1 cm寬，4 cm長的80 g打印紙紙條，紙條末端采用雙面膠環(huán)形固定到左前肢上，記錄大鼠撕去紙條時間。實(shí)驗(yàn)記錄大鼠造模前、造模后2 h和給藥第2、4、6、8天紙條撕去時間，評估大鼠感覺和協(xié)調(diào)運(yùn)動能力。

1.4.5 取材 實(shí)驗(yàn)第8天行為學(xué)評價后，大鼠采用吸入過量異氟烷安樂死，6只大鼠取右側(cè)前囟前-1 mm位置到前囟后6 mm的腦組織進(jìn)行OCT包埋;剩余大鼠取右側(cè)前囟前-2 mm位置到前囟后7 mm的腦組織放于-80 ℃保存，用于Western blot實(shí)驗(yàn)。

1.4.6 焦油紫染色 OCT包埋腦組織進(jìn)行冰凍切片，切片厚度20 ?m，每隔200 ?m保留一張切片，然后所有冰凍切片進(jìn)行焦油紫染色。切片室溫干燥后進(jìn)行掃描，應(yīng)用Image J軟件計(jì)算TBI損傷體積[8]。

1.4.7 免疫組化染色 在準(zhǔn)備焦油紫切片的時候，在大鼠前囟后2 mm位置進(jìn)行腦組織冰凍切片，切片厚度10 ?m，4 ℃預(yù)冷的多聚甲醛固定15 min后進(jìn)行免疫組化染色。Triton通透后進(jìn)行BSA封閉，然后孵育NeuN（1︰500）和GFAP（1︰400）一抗和按照試劑盒滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，DAB顯色后用熒光顯微鏡拍照，計(jì)數(shù)大鼠皮層NeuN和GFAP陽性細(xì)胞數(shù)目[9]。

1.4.8 凋亡蛋白檢測 提取腦組織蛋白，BCA定量后進(jìn)行凝膠電泳，分別過夜孵育Bcl-2（1︰1 000）、Bax（1︰1 000）、Caspase-3（1︰500）、β-actin（1︰1 000）一抗，洗膜后孵育二抗（1︰2 000），ECL發(fā)光液顯影，應(yīng)用Carestream MI系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析[10]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，大鼠轉(zhuǎn)棒時間、紙條粘附試驗(yàn)行為學(xué)評分采用重復(fù)測量（general linear model-repeated measures）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，大鼠體重、細(xì)胞計(jì)數(shù)和分子生物學(xué)數(shù)據(jù)采用One-ANOVA Dunnett進(jìn)行檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組一般資料比較 造模前，假手術(shù)組、模型組和川芎嗪低、中、高劑量組大鼠體重分別為（322.8±14.8）、（324.5±16.3）、（326.7±18.1）、（325.4±14.4）、（327.5±15.9）g，各組大鼠體重比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 五組大鼠轉(zhuǎn)棒時間比較 造模后2 h，模型組和川芎嗪低、中、高劑量組大鼠的轉(zhuǎn)棒時間與假手術(shù)組比較均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。隨后連續(xù)給藥一周進(jìn)行行為學(xué)重復(fù)測量，川芎嗪高劑量組與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），川芎嗪中劑量組與模型組轉(zhuǎn)棒時間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但是川芎嗪低劑量組與模型組轉(zhuǎn)棒時間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1和圖1。

2.3 TBI大鼠紙條粘附試驗(yàn)撕掉紙條時間比較 大鼠TBI造模后2 h，模型組大鼠和川芎嗪低、中、高劑量組大鼠紙條撕掉時間與造模前相比均顯著延長，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。連續(xù)給藥1周，川芎嗪中、高劑量組的紙條撕掉時間均較其造模后2 h縮短，且與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2和圖2。

2.4 五組TBI大鼠腦損傷體積比較 模型組TBI大鼠腦損傷體積為（24.0±8.2）mm3，川芎嗪低、中、高劑量組TBI大鼠腦損傷體積分別為（23.20±5.81）、（16.50±2.59）、（14.10±2.29）mm3，川芎嗪高、中劑量組TBI大鼠的腦損傷體積與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.028、0.005），見圖3。

2.5 三組大鼠皮層梗死區(qū)周圍神經(jīng)元數(shù)目比較 采用免疫組化觀察TBI大鼠損傷區(qū)周圍2 mm區(qū)域的NeuN陽性細(xì)胞數(shù)目，模型組神經(jīng)元數(shù)目為（225.00±59.44）個，假手術(shù)組的神經(jīng)元數(shù)目（337.00±57.05）個，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.007），川芎嗪高劑量組的神經(jīng)元數(shù)目為（290.70±41.19）個，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.047）。川芎嗪高劑量組神經(jīng)元數(shù)目與假手術(shù)組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖4、5。

2.6 川芎嗪對TBI大鼠皮層區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響 模型組促凋亡蛋白Bax表達(dá)高于假手術(shù)組，川芎嗪高劑量組的Bax蛋白表達(dá)較模型組顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;模型組抑制細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)低于假手術(shù)組，川芎嗪高劑量組Bcl-2蛋白表達(dá)高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。模型組Bcl-2/Bax表達(dá)比例較假手術(shù)組顯著降低（P<0.05），模型組存在嚴(yán)重的神經(jīng)細(xì)胞凋亡;川芎嗪高劑量組的Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)顯著高于模型組（P<0.05）。見表3和圖6。

3 討論

創(chuàng)傷性顱腦損傷（TBI）是發(fā)達(dá)國家青年和兒童死亡的首要病因，但缺乏有效的治療措施[11]。病理生理研究發(fā)現(xiàn)TBI損傷包括原發(fā)性顱腦損傷和繼發(fā)性損傷。原發(fā)性顱腦損傷機(jī)制為局部腦組織因外力直接導(dǎo)致位移引起局部微循環(huán)障礙和神經(jīng)細(xì)胞損傷;繼發(fā)性顱腦損傷是由于腦組織因密度不同不對等移動，引起神經(jīng)組織損傷局部腦組織微撕裂血液供應(yīng)障礙等。無論哪種形式的損傷，神經(jīng)細(xì)胞均會伴隨著鈣超載、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)等分子水平的改變，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷或死亡，引起機(jī)體相應(yīng)的神經(jīng)功能障礙[1，12]。由于TBI細(xì)胞損傷機(jī)制復(fù)雜，單一靶點(diǎn)藥物很難改善其癥狀，因此尋求多靶點(diǎn)藥物可能為TBI治療帶來希望[13]。

川芎作為傳統(tǒng)中藥在我國臨床應(yīng)用有兩千多年歷史，具有活血行氣、消散瘀血、祛風(fēng)止痛之功效。川芎嗪是中藥川芎的有效成分之一，臨床用于缺血性腦血管疾病、心血管疾病和缺血再灌注損傷等疾病[14]。川芎嗪藥理活性包括抑制L-鈣通道、清除自由基降低氧化應(yīng)激、抑制細(xì)胞凋亡、降低炎性反應(yīng)、抑制血小板聚集等多種作用機(jī)制[2]，更重要的是藥代研究發(fā)現(xiàn)川芎嗪具有非常好的血腦屏障通透率[15-16]，在臨床得到廣泛應(yīng)用。因此，川芎嗪可能對創(chuàng)傷性顱腦損傷具有很好的保護(hù)作用。

Liao等[5]在缺血性腦卒中模型中探索了川芎嗪的治療劑量，川芎嗪在10、20、40 mg/kg劑量下對缺血腦卒中大鼠具有劑量依賴性的保護(hù)作用，因此本實(shí)驗(yàn)選擇這三個劑量用于其保護(hù)TBI藥理活性研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，川芎嗪在20、40 mg/kg劑量下可以非常顯著的縮短紙條撕掉時間，說明川芎嗪可以顯著改善TBI大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀，降低TBI大鼠腦損傷體積，但是其低劑量10 mg/kg未見保護(hù)作用，可能與TBI發(fā)病機(jī)制較腦卒中更復(fù)雜有關(guān)。由于40 mg/kg川芎嗪展示出更好的神經(jīng)保護(hù)作用，筆者對40 mg/kg組的TBI大鼠進(jìn)行進(jìn)一步機(jī)制研究。采用NeuN神經(jīng)元細(xì)胞特異性的免疫組化，觀察TBI大鼠損傷區(qū)外2 mm位置的神經(jīng)元細(xì)胞損傷情況，可見模型組缺損周邊神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目較假手術(shù)組顯著降低，說明創(chuàng)傷性顱腦損傷除了原發(fā)性的外力直接導(dǎo)致?lián)p傷外，其他繼發(fā)性損傷機(jī)制同樣參與了神經(jīng)細(xì)胞的損傷。而給予川芎嗪后，存活的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目顯著增加，川芎嗪改善TBI大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀可能與其神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用有關(guān)。細(xì)胞凋亡是TBI神經(jīng)細(xì)胞損傷主要的下游信號調(diào)控通路之一，并且有研究表明川芎嗪可以通過抑制細(xì)胞凋亡保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞損傷[17]，本實(shí)驗(yàn)針對凋亡關(guān)鍵蛋白抑制凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax進(jìn)行WB檢測，川芎嗪可以顯著的降低TBI大鼠Bax蛋白表達(dá)和增加Bcl-2表達(dá)，逆轉(zhuǎn)Bcl-2/Bax比例，可以顯著抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，這可能是其保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞損傷改善其功能的其中一種機(jī)制。

川芎嗪由于具有一定的抑制血栓形成和抑制血小板聚集作用[18-19]，因此臨床上對于出血風(fēng)險的患者慎用或禁用。筆者綜合分析川芎嗪抑制血小板聚集作用，其藥理活性濃度范圍為0.5～1.5 mM[18]，而大鼠靜脈注射給予40 mg/kg的川芎嗪，其最大血藥濃度約為64 ?M[15]，遠(yuǎn)低于川芎嗪抑制血小板聚集的最低藥理活性濃度500 ?M。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)川芎嗪在20、40 mg/kg均可以顯著保護(hù)TBI大鼠腦損傷，而在該劑量下，川芎嗪沒有抑制血小板聚集活性，具有很好的安全性。同時有研究報道，健康人口服給予200 mg的磷酸川芎嗪片最大血藥濃度為9.4 ?M[20]，同樣也遠(yuǎn)低于其抑制血小板最低藥物濃度。人體該給藥劑量換算為大鼠給藥等效劑量約為20 mg/kg，在該劑量下川芎嗪具有很好的改善TBI神經(jīng)缺損癥狀，說明川芎嗪在其有效的治療范圍內(nèi)具有較高的安全性，值得臨床進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用。

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