石沁 歐陽紅梅 宋建新

摘要：目的? 探討骨髓微環(huán)境中細(xì)胞因子IL-Iβ、IL-2、IL-4、IL-10、INF-γ、TNF-α水平與外周血中相應(yīng)細(xì)胞因子的差異。方法選取2018年1月～2019年2月云南省第一人民醫(yī)院血液科診斷的缺鐵性貧血（IDA）、骨髓增生異常綜合征（MDS-EB-1）、慢性粒細(xì)胞白血病慢性期（CML-CP）及急性髓系白血病（AML）患者各20例。應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析IDA、MDS-EB-1、CML-CP和AML患者骨髓及外周血IL-Iβ、IL-2、IL-4、IL-10、INF-γ、TNF-α的水平。結(jié)果? IDA患者骨髓微環(huán)境和外周血中細(xì)胞因子水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;MDS-EB-1、CML-CP及AML患者骨髓微環(huán)境中IL-Iβ、IL-2、IL-4、IL-10、INF-γ、TNF-α水平高于外周血，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論? IDA、MDS-EB-1、CML-CP及AML患者骨髓微環(huán)境中細(xì)胞因子IL-Iβ、IL-2、IL-4、IL-10、INF-γ、TNF-α的水平高于外周血中相應(yīng)的細(xì)胞因子水平。在研究血液系統(tǒng)惡性腫瘤細(xì)胞因子時(shí)，應(yīng)檢測(cè)骨髓微環(huán)境中的細(xì)胞因子。

關(guān)鍵詞：骨髓;外周血;細(xì)胞因子

中圖分類號(hào)：R73? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.13.022

文章編號(hào)：1006-1959（2019）13-0081-03

Abstract：Objective To investigate the differences of cytokines IL-Iβ， IL-2， IL-4， IL-10， INF-γ and TNF-α levels in the bone marrow microenvironment and corresponding cytokines in peripheral blood.Methods? The iron deficiency anemia （IDA）， myelodysplastic syndrome （MDS-EB-1） ，20 patients with chronic myeloid leukemia （CML-CP） and acute myeloid leukemia （AML）. Flow cytometry was used to analyze the levels of IL-Iβ， IL-2， IL-4， IL-10， INF-γ and TNF-α in bone marrow and peripheral blood of patients with IDA， MDS-EB-1， CML-CP and AML.Results? There was no significant difference in the cytokine levels between the bone marrow microenvironment and peripheral blood of patients with IDA （P>0.05）.The levels of IL-Iβ， IL-2， IL-4， IL-10， INF-γ and TNF-α in the bone marrow microenvironment of patients with MDS-EB-1， CML-CP and AML were higher than those in peripheral blood，the difference was statistically significant（P<0.05）.Conclusion? The levels of cytokines IL-Iβ， IL-2， IL-4， IL-10， INF-γ and TNF-α in bone marrow microenvironment of patients with IDA， MDS-EB-1， CML-CP and AML are higher than those of peripheral blood. Corresponding cytokine levels. In the study of hematological malignancies cytokines， cytokines in the bone marrow microenvironment should be examined.

Key words：Bone marrow;Peripheral blood;Cytokines

骨髓微環(huán)境（hematopoietic microenvironment）由基質(zhì)細(xì)胞、輔助細(xì)胞（T淋巴細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞）、細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞因子組成的一個(gè)有序的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，其不僅提供造血細(xì)胞賴以生存、發(fā)育及分化的場(chǎng)所，同時(shí)其改變?yōu)檠合到y(tǒng)惡性腫瘤提供了一個(gè)合適的生存空間。既往對(duì)細(xì)胞因子在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中的作用主要研究的是外周血（peripheral blood）[1-4]，而骨髓微環(huán)境中細(xì)胞因子的研究鮮見報(bào)道。本文對(duì)骨髓微環(huán)境及外周血的細(xì)胞因子差異作一分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料? 選取2018年1月～2019年2月云南省第一人民醫(yī)院血液科診斷的缺鐵性貧血（iron deficiency anenia，IDA）患者20例，其中男8例，女12例，年齡21～66歲，平均年齡（45.62±21.39）歲;骨髓增生異常綜合征伴原始細(xì)胞增多1型（myelodysplastic syndrome with primordial cell proliferation type 1，MDS-EB-1）患者20例，其中男14例，女6例，年齡37～75歲，平均年齡（52.16±23.94）歲;慢性粒細(xì)胞白血病慢性期（chronic myeloid leukemia，CML-CP）患者20例，其中男12例，女8例，年齡25～70歲，平均年齡（46.77±21.89）歲;急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）患者20例，其中男13例，女7例，年齡27～73歲，平均年齡（50.10±22.67）歲。本研究獲我院倫理委員會(huì)審批批準(zhǔn)，并征得所有受試者知情同意。

1.2納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 IDA? 納入標(biāo)準(zhǔn)：按照《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》中IDA診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，血紅蛋白男性<120 g/L、女性<110 g/L，血清鐵蛋白<12 μg/L，血清鐵<8.95 μmol/L，總鐵結(jié)合力>64.44 μmol/L，轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度<15%，骨髓細(xì)胞外鐵明消失，鐵粒幼細(xì)胞比例<15%。排除標(biāo)準(zhǔn)：①由先天性的疾病所引起的重癥病例;②合并有地中海貧血或者其他血液系統(tǒng)的病例;③患有惡性腫瘤或者免疫功能不全的病例。

1.2.2 MDS-EB-1? 納入標(biāo)準(zhǔn)：①按照《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》中MDS診斷標(biāo)準(zhǔn)及2006年MDS維也納最低標(biāo)準(zhǔn)[5]，外周血血細(xì)胞1～3個(gè)系別減少，原始細(xì)胞≤2%～4%，單核細(xì)胞<1×109/L;②骨髓單系或多系發(fā)育異常，原始細(xì)胞5%～9%，無Auer小體。排除標(biāo)準(zhǔn)：血細(xì)胞減少/發(fā)育異常原發(fā)原因的所有其他造血組織或非造血組織疾病。

1.2.3 CML-CP? 納入標(biāo)準(zhǔn)：①按照《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》中CML-CP診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，臨床表現(xiàn)為貧血、脾腫大、持續(xù)性白細(xì)胞計(jì)數(shù)增高;②經(jīng)骨髓和外周血涂片檢查原始細(xì)胞<10%;③PH染色體和BCR/ABL融合基因檢測(cè)呈陽性。排除標(biāo)準(zhǔn)：①CML加速期或急變期患者;②患急性白血病等血液疾病者;③合并其它惡性腫瘤者。

1.2.4 AML? 納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》中AML診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，外周血和（或）骨髓中原始細(xì)胞占所有有核細(xì)胞≥20%，過氧化物酶（POX）染色陽性率>3%，白血病免疫分型表達(dá)MPO、CD13、CD15、CD33、CD117且積分>2分，細(xì)胞遺傳學(xué)檢查有克隆性遺傳學(xué)異常，如t（8;21）（q22;q22）、inv（16）（p13;q22）或t（16;16）（p13;q22）以及t（15;17）（q22;q12）。排除標(biāo)準(zhǔn)：①治療相關(guān)性急性髓系白血病患者;②骨髓增生異常綜合征或骨髓增殖性疾病轉(zhuǎn)化而來的急性髓系白血病患者。

1.3試劑和儀器? 主要試劑盒：IL-Iβ、IL-2、IL-4、IL-10、INF-γ、TNF-α試劑盒（美國Becton-Dickinson公司，規(guī)格：80Tests）。主要儀器：流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter Inc，批號(hào)：AN02002，型號(hào)：FC500）。

1.4標(biāo)本采集? 常規(guī)采集IDA、MDS-EB-1、CML-CP、AML患者骨髓液2.0 ml，同時(shí)采集相應(yīng)患者外周血2.0 ml，EDTA-K2抗凝，以3000 r/min 離心30 min，收集上清，-80℃保存待測(cè)。

1.5細(xì)胞因子檢測(cè)? 按照試劑盒說明書設(shè)計(jì)流式細(xì)胞術(shù)方案，計(jì)算所需微球量，混合微球（Bead），以1500 r/min 離心10 min，棄上清，加入丟棄上清相同量的增強(qiáng)劑混合待用;取試管編號(hào)，每管分別加入20 μl離心后的骨髓及外周血上清液，每管加入混合微球50 μl及PE染料50 μl，避光孵育3 h，加入清洗緩沖液600 ml混勻，1500 r/min 離心10 min，棄上清，加入300 μl 清洗緩沖液混勻上機(jī)檢測(cè)，用FCAP分析軟件分析。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析? 數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用（x±s）表示，行t檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

IDA患者骨髓微環(huán)境和外周血中細(xì)胞因子比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;MDS-EB-1、CML-CP和AML患者骨髓微環(huán)境中IL-Iβ、IL-2、IL-4、IL-10、INF-γ、TNF-α水平均高于相應(yīng)患者外周血中細(xì)胞因子水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

3討論

細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞和某些非免疫細(xì)胞經(jīng)刺激而合成、分泌的一類具有廣泛生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)，主要介導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)。細(xì)胞因子作為骨髓微環(huán)境中的重要組成部分的細(xì)胞因子，在維持骨髓微環(huán)境的動(dòng)態(tài)平衡中起著重要作用。一旦微環(huán)境的性質(zhì)和功能發(fā)生改變，將可能對(duì)造血干細(xì)胞的生長、分化產(chǎn)生重要影響[6]。

越來越多的研究證實(shí)，在不同的腫瘤中都存在局部微環(huán)境的改變，如MDS、白血病、淋巴瘤等血液系統(tǒng)惡性腫瘤微環(huán)境中有巨噬細(xì)胞的異常浸潤[7-9]，巨噬細(xì)胞可大量分泌多種細(xì)胞因子，如M1型巨噬細(xì)胞分泌IL-2、IL-12、INF-γ、TNF-α等細(xì)胞因子和趨化因子，M2型巨噬細(xì)胞分泌IL-Iβ、IL-4、IL-6、IL-10等而發(fā)揮抗腫瘤或促腫瘤作用[10-12]。

本研究結(jié)果表明，在相對(duì)良性血液系統(tǒng)疾病IDA患者骨髓微環(huán)境中，骨髓微環(huán)境中的細(xì)胞因子IL-Iβ、IL-2、IL-4、IL-10、INF-γ、TNF-α水平雖高于外周血水平，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），原因可能是IDA僅是由于儲(chǔ)存鐵被耗竭后所發(fā)生的貧血，而在局部沒有巨噬細(xì)胞的異常浸潤及基質(zhì)細(xì)胞、輔助細(xì)胞的激活有關(guān)。而在血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者骨髓中，無論是MDS-EB-1、CML-CP還是AML，細(xì)胞因子IL-Iβ、IL-2、IL-4、IL-10、INF-γ、TNF-α水平均高于外周血，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這是由于在血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者骨髓微環(huán)境中存在一個(gè)巨噬細(xì)胞的擴(kuò)增環(huán)，在白血病細(xì)胞來源的趨化因子，如CCL2、VEGF等細(xì)胞因子的作用下，將外周血單核細(xì)胞大量招募進(jìn)入骨髓微環(huán)境而分化為巨噬細(xì)胞，由于Th1類細(xì)胞因子IL-2、INF-γ減少和Th2類細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α及多功能炎性因子IL-1β等細(xì)胞因子的增高而將招募進(jìn)入骨髓微環(huán)境的巨噬細(xì)胞極化為M2型，而白血病細(xì)胞本身也能分泌大量的CCL2、IL-10、IL-1β和VEGF，進(jìn)一步促進(jìn)巨噬細(xì)胞的招募與極化，同時(shí)由于基質(zhì)細(xì)胞、輔助細(xì)胞等分泌大量細(xì)胞因子，導(dǎo)致局部的細(xì)胞因子“風(fēng)暴”所致[7-9]。

綜上所述，IDA、MDS-EB-1、CML-CP及AML患者骨髓微環(huán)境中細(xì)胞因子IL-Iβ、IL-2、IL-4、IL-10、INF-γ、TNF-α的水平高于外周血中相應(yīng)的細(xì)胞因子水平。因此，在研究血液系統(tǒng)惡性腫瘤細(xì)胞因子時(shí)，應(yīng)檢測(cè)骨髓微環(huán)境中的細(xì)胞因子，才能更準(zhǔn)確的反映骨髓微環(huán)境的變化對(duì)血液系統(tǒng)惡性腫瘤的影響。

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收稿日期：2019-2-13;修回日期：2019-2-28

編輯/杜帆