宗婧婧 ，嚴(yán)忠雍 ，張小軍 *，李停停 ，高學(xué)慧

（1.浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山316021；2.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山316021）

泰妙菌素(tiamulin，TML)[1]和沃尼妙林(valnemulin，VLM)[2]是截短側(cè)耳素類半合成的動(dòng)物專用抗生素，均屬于雙萜類[3]，結(jié)構(gòu)中含有八元環(huán)、五元環(huán)上的羰基、C-11位上的羥基和C-14位上?；然鶊F(tuán)，見圖1。該類抗生素通過抑制菌體蛋白的合成對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌及支原體起抗菌作用[4-6]，具有抗菌活性強(qiáng)、治療效果顯著、休藥期短和使用安全性高等特點(diǎn)。在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，濫用這2種抗生素會(huì)導(dǎo)致其在水產(chǎn)品中大量殘留，最終通過食物鏈危害人類健康[7-10]。我國(guó)是水產(chǎn)養(yǎng)殖大國(guó)，水產(chǎn)品安全是全民關(guān)注的重點(diǎn)。為了避免泰妙菌素和沃尼妙林等藥物殘留，保證水產(chǎn)品的質(zhì)量安全，有必要建立一種水產(chǎn)品中泰妙菌素和沃尼妙林殘留量的檢測(cè)方法。

圖1 泰妙菌素和沃尼妙林結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of tiamulin and valnemulin

泰妙菌素和沃尼妙林是弱堿性化合物，采用強(qiáng)陽(yáng)離子固相萃取凈化技術(shù)，將其鎖定在強(qiáng)陽(yáng)離子交換點(diǎn)，降低由蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等成分引起的基質(zhì)效應(yīng)。這樣不僅避免了對(duì)目標(biāo)物定性的影響，還保證了方法的準(zhǔn)確性和高效性。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)這2種抗生素的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法(GC)[11]、高效液相色譜法(HPLC)[12-15]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLCMS/MS)[16-20]等。氣相色譜法需要衍生化，步驟復(fù)雜，操作煩瑣；高效液相色譜法雖然操作簡(jiǎn)便，但受基質(zhì)的影響較大，靈敏度低，檢測(cè)限高；而超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)[21-24]具有高效準(zhǔn)確、靈敏度高和檢出限低等優(yōu)點(diǎn)。目前，UPLCMS/MS法檢測(cè)泰妙菌素和沃尼妙林多以畜禽肉類為檢測(cè)源，對(duì)水產(chǎn)品的檢測(cè)較少，此方法的前處理步驟較為復(fù)雜，耗時(shí)較長(zhǎng)。本研究采用強(qiáng)陽(yáng)離子交換固相萃取柱凈化結(jié)合UPLC-MS/MS法，操作簡(jiǎn)便、快速準(zhǔn)確，與已報(bào)道的方法相比，本方法前處理用時(shí)更短、檢出限低、靈敏度高，更適合日常大批量樣品的篩查檢測(cè)。經(jīng)綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)考察了色譜和質(zhì)譜條件，并優(yōu)化了前處理提取和凈化方法，建立了一種UPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中泰妙菌素和沃尼妙林殘留量的分析方法。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

實(shí)驗(yàn)用草魚、鯽魚、對(duì)蝦和梭子蟹各10 kg，均購(gòu)自浙江舟山市臨城水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)。經(jīng)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)檢測(cè)，樣品均不含泰妙菌素和沃尼妙林藥物殘留。

泰妙菌素(tiamulin)、沃尼妙林(valnemulin)和泰妙菌素內(nèi)標(biāo)(Tiamulin-13C4Fumarate)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Oasis MCX(3 mL，60 mg)固相萃取柱購(gòu)自美國(guó)Waters公司；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q高純水；甲醇、乙腈、甲酸、乙酸銨和正己烷均為色譜純，氨水為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

ACQUITYTM型超高效液相色譜儀、Waters Xevo TQS四極桿質(zhì)譜儀(配電噴霧離子源)、ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱 (2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，美國(guó) Waters公司；MS2漩渦混合器，德國(guó)IKA公司；Centrifuge 5810高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；N-EVAP112氮吹儀，美國(guó)Organomation公司；VisiprepTMDL固相萃取裝置，美國(guó)Supelco公司；超聲波清洗器SK8200GT，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取泰妙菌素和沃尼妙林標(biāo)準(zhǔn)品各5.0 mg(精確至0.1 mg)，用甲醇溶解并定容至50 mL，配置成 100 μg·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，移取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各500 μL，用甲醇稀釋并定容至50 mL，在室溫下混勻配成1 μg·mL－1的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。再準(zhǔn)確稱取泰妙菌素內(nèi)標(biāo)1 mg(精確至0.1 mg)，用甲醇溶解并定容至 50 mL，配置成 20 μg·mL－1的泰妙菌素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。

將上述標(biāo)準(zhǔn)溶液4℃避光冷藏保存，使用時(shí)分別用乙腈逐級(jí)稀釋成50 ng·mL－1的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液和100 ng·mL－1的泰妙菌素內(nèi)標(biāo)工作液，且現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 樣品的提取與凈化

1.4.1 提取

準(zhǔn)確稱取充分勻質(zhì)的樣品2.00(±0.01)g置于50 mL離心管中，加入100 ng·mL－1的泰妙菌素內(nèi)標(biāo)工作液50 μL用10 mL乙腈提取，渦旋30 s，超聲10 min，7 000 r·min－1離心 5 min，最后將上清液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，待凈化。

1.4.2 凈化

取3 mL甲醇活化Oasis MCX固相萃取柱(3 mL，60 mg)，2%甲酸-水溶液平衡。取上述乙腈提取液過柱，依次用2%甲酸水溶液、甲醇和正己烷各3 mL淋洗Oasis MCX固相萃取柱，待淋洗結(jié)束后，將柱內(nèi)殘留液抽干，最后用3 mL7%氨水-甲醇洗脫液洗脫目標(biāo)物，收集洗脫液，在50℃水浴中氮?dú)獯蹈伞＜尤? mL含0.05%甲酸的5 mmol·L－1乙酸銨-乙腈(v/v=4：1)復(fù)溶，渦旋混勻，經(jīng) 0.22 μm 有機(jī)相濾膜過濾后用UPLC-MS/MS檢測(cè)。

1.5 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；色譜柱溫度：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相 A 為含 0.05%甲酸的 5 mmol·L－1乙 酸 銨 水 溶 液 ，B 為 乙 腈 ；流 速 為 0.3 mL·min－1，梯度洗脫目標(biāo)物。梯度洗脫條件如表1所示。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions

1.6 質(zhì)譜條件

泰妙菌素和沃尼妙林經(jīng)色譜柱分離，用質(zhì)譜檢測(cè)，選用電噴霧離子源正離子掃描(ESI+)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(multiple reaction monitoring，MRM)，毛細(xì)管電壓為3.5 kV，離子源溫度為119℃，脫溶劑氣溫度為385℃，選擇高純氮?dú)庾鳛殄F孔氣和脫溶劑氣，流速分別控制在55 L·h－1和800 L·h－1。在此質(zhì)譜離子源條件下，泰妙菌素和沃尼妙林的質(zhì)譜分析參數(shù)如表2所示。

表2 泰妙菌素和沃尼妙林的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 2 Mass spectrometry parameters of tiamulin and valnemulin

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 提取液和固相萃取柱的選擇

考慮實(shí)驗(yàn)水產(chǎn)品的含水率較高，樣品基質(zhì)成分復(fù)雜且較為分散，振蕩提取的方式易導(dǎo)致基質(zhì)分散黏壁造成目標(biāo)物損失，因此選用超聲提取方式。

為充分提取和凈化，本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[25-27]的提取液和固相萃取柱(solid phase extraction column，SPE)方法，分別進(jìn)行乙腈和乙酸乙酯在MCX和HLB中的提取和凈化，并根據(jù)回收率分析提取效果，結(jié)果如圖2所示。由圖1知，乙腈和乙酸乙酯提取泰妙菌素的效果均較好，回收率均在97%以上，但用乙酸乙酯提取沃尼妙林的回收率較低。乙腈提取液能同時(shí)將2個(gè)待測(cè)物提取完全，回收率分別為103.33%和90.31%。而且在實(shí)驗(yàn)過程中，用Oasis HLB SPE柱凈化時(shí)，上樣體積的增加造成色素逐漸沉積，導(dǎo)致流速變慢甚至堵塞，前處理耗時(shí)長(zhǎng)。Oasis MCX SPE柱可以縮短樣品前處理時(shí)間，提升凈化效果。綜合考慮，實(shí)驗(yàn)選用乙腈作為提取液，結(jié)合超聲提取的方式，用Oasis MCX SPE柱凈化。

2.1.2 提取次數(shù)的優(yōu)化

結(jié)合2.1.1節(jié)的結(jié)果，進(jìn)一步對(duì)比了10 mL乙腈提取1次和2次的區(qū)別。在草魚陰性樣本中加100 μL 50 ng·mL－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)其回收率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，提取1次基本能將目標(biāo)物完全回收，回收率為92.21%，提取2次回收率為90.20%。這是由于2次提取液含水量不同，合并后溶液中有雜質(zhì)析出，溶液變渾濁，導(dǎo)致凈化時(shí)固相萃取MCX柱色素沉積甚至堵塞，回收率變低。因此，選擇用10 mL乙腈提取1次。

圖2 提取液和固相萃取柱對(duì)回收率的影響Fig.2 Effect of extract and solid phase extraction column on the recovery rate

2.1.3 洗脫液中氨水比例和洗脫體積的確定

考察了氨水-甲醇洗脫液中氨水比例和洗脫體積對(duì)回收率的影響。分別用1%，3%，5%，7%和9%的氨水-甲醇作為洗脫液，平均每mL取1次，共取4次，測(cè)其回收率。結(jié)果如圖3所示，氨水的比例為7%時(shí)，洗脫能力強(qiáng)，回收率最高，分別為96.34%和97.07%，洗脫體積為3 mL時(shí)，基本能將目標(biāo)物全部洗脫，隨著洗脫體積的增大，后期不僅無目標(biāo)物，而且會(huì)洗脫出其他雜質(zhì)，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此,確定洗脫液為3 mL 7%氨水-甲醇。另外，考慮到水產(chǎn)品脂質(zhì)含量高，在淋洗時(shí)加入正己烷，防止乳化現(xiàn)象的發(fā)生。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)比采用常規(guī)液相色譜柱靈敏度更高，分析時(shí)間短，分離能力強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱 (50 mm×2.1 mm，1.7 μm)測(cè) 得 待 測(cè) 組 分 的 檢 出 限 為 0.03μg·kg－1，分析時(shí)間僅為5 min，結(jié)果基本不受基質(zhì)的影響，能夠在較短時(shí)間內(nèi)達(dá)到最有效的分離。

在流動(dòng)相中加入一定量的有機(jī)酸，可以提高待測(cè)組分的分離度和離子化程度，因此，為使靈敏度和分離度達(dá)到最佳，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了甲酸在流動(dòng)相中的比例。分別在流動(dòng)相中加入不同比例的甲酸溶液，結(jié)果如圖4所示，以泰妙菌素為例，色譜圖a、b、c、d和e中甲酸的比例分別為0.02%，0.05%，0.1%，0.2%和0.5%，色譜圖c、d和e的響應(yīng)值為1.77×107～1.91×107，較圖a、b低，峰面積小而且有拖尾現(xiàn)象；色譜圖b較色譜圖a峰形尖銳，靈敏度和響應(yīng)值相對(duì)較高，因此實(shí)驗(yàn)將甲酸比例優(yōu)化為0.05%。

圖3 洗脫液中氨水比例和洗脫體積對(duì)回收率的影響Fig.3 Effect of ammonia ratio and elution volume on the recovery rate in eluent

圖4 不同體積分?jǐn)?shù)的甲酸溶液所測(cè)得待測(cè)組分的色譜圖Fig.4 Chromatograms of measured components in the sample by formic acid of different volume fraction

本實(shí)驗(yàn)選擇梯度洗脫的方式，與等度洗脫相比，梯度洗脫降低了溶液中雜峰對(duì)泰妙菌素和沃尼妙林峰形的影響，避免造成分析誤差，而且峰形尖銳，響應(yīng)值高。泰妙菌素和沃尼妙林的分析時(shí)間為5 min，保留時(shí)間分別為1.95和2.03 min。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

由于泰妙菌素和沃尼妙林含有羰基、羥基和酰基等基團(tuán)，故采用電噴霧離子源下正離子掃描(ESI+)模式。取200 μg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以 20 μL·min－1的流速注入離子源，在ESI(+)的模式下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描，得到泰妙菌素和沃尼妙林的分子離子[M+H]+的m/z分別為494.08和565.46。調(diào)試確定毛細(xì)管電壓為3.20 V，泰妙菌素的錐孔電壓為30 V，沃尼妙林的錐孔電壓為10 V。在加載電壓和兩者的錐孔電壓不變的情況下，進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描。通過改變碰撞能量，確定響應(yīng)值最高的子離子為定量離子，響應(yīng)值次高的子離子為定性離子。圖5即為泰妙菌素和沃尼妙林的二級(jí)質(zhì)譜圖。

圖5 泰妙菌素和沃尼妙林的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.5 Secondary mass spectrometry graph of tiamulin and valnemulin

2.4 線性范圍檢出限與定量限（標(biāo)準(zhǔn)曲線）

優(yōu)化色譜條件、質(zhì)譜條件和前處理?xiàng)l件后，配制成濃度分別為 0.1，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 ng·mL－1的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，在1.5節(jié)和1.6節(jié)的色譜質(zhì)譜條件下進(jìn)行測(cè)定，得到線性回歸方程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，泰妙菌素和沃尼妙林的線性回歸方程分別為

泰妙菌素和沃尼妙林在0.1～10.0 ng·mL－1內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系。以3倍信噪比為檢出限，10倍信噪比為定量限，確定本方法泰妙菌素和沃尼妙林的檢出限和定量限分別為0.03 和0.1 μg·kg－1。目前，我國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 4483―2016《出口活魚泰妙菌素檢測(cè)技術(shù)規(guī)范》[28]中，泰妙菌素的檢測(cè)限為 50 μg·kg－1，因此，本實(shí)驗(yàn)建立的方法能夠滿足國(guó)內(nèi)檢測(cè)的要求。

2.5 方法回收率和精密度

對(duì)草魚、對(duì)蝦和梭子蟹分別進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，在每批次樣品中分別加入 0.1，1.0，5.0，10.0 μg·kg-14種水平的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，并設(shè)置空白對(duì)照組，每個(gè)水平平行測(cè)定6次，共進(jìn)行3批次實(shí)驗(yàn)，最終計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3，泰妙菌素和沃尼妙林的平均回收率為87%～114%，進(jìn)一步證明樣品前處理方法優(yōu)化后降低了基質(zhì)的干擾。實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.87%～6.50%，批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.19%～9.96%，均小于10%。

2.6 實(shí)際樣品驗(yàn)證

將 50條鯽魚喂養(yǎng)在濃度為 0.5 μg·mL－1的泰妙菌素和沃尼妙林混合溶液中，連續(xù)藥浴7 d。利用已建立的方法測(cè)定鯽魚體內(nèi)泰妙菌素和沃尼妙林的殘留量，結(jié)果如表4所示。鯽魚的各個(gè)組織中均能檢測(cè)到泰妙菌素和沃尼妙林，其中，腎臟組織中泰妙菌素和沃尼妙林的總殘留量最高，為453.81 μg·kg－1，肝臟次之，為 236.97 μg·kg－1。實(shí)驗(yàn)表明，本方法能用于日常泰妙菌素和沃尼妙林殘留量的測(cè)定。

3 結(jié) 論

本研究采用強(qiáng)陽(yáng)離子固相萃取技術(shù)凈化，選用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)檢測(cè)，建立了一種能夠檢測(cè)水產(chǎn)品中泰妙菌素和沃尼妙林殘留量的方法。方法采用乙腈提取1次，振蕩超聲后用MCX強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱凈化，檢測(cè)時(shí)間僅為5 min，高效準(zhǔn)確。選用內(nèi)標(biāo)法定量分析泰妙菌素，外標(biāo)法定量分析沃尼妙林，在空白草魚、對(duì)蝦和梭子蟹中分別加入 0.1，1.0，5.0 和 10.0 μg·kg－14個(gè)添加水平，2種抗生素藥物的平均回收率為87%～114%，RSD小于10%。優(yōu)化各項(xiàng)參數(shù)條件后，可降低基質(zhì)效應(yīng)，縮短前處理時(shí)間，且靈敏度較高，檢出限和定量限分別為 0.03和 0.1 μg·kg－1，滿足國(guó)內(nèi)檢測(cè)的相關(guān)要求，也為水產(chǎn)品中泰妙菌素和沃尼妙林殘留量的檢測(cè)提供了技術(shù)支持，可廣泛應(yīng)用于檢測(cè)機(jī)構(gòu)和水產(chǎn)企業(yè)的日常檢驗(yàn)監(jiān)測(cè)工作。

表3 樣品中4種濃度水平的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 3 Recovery and relative standard deviation of analytes spiked with 0.1，1.0，5.0 and 10.0 μg·kg-1in sample（n=6）

表4 鯽魚各組織中泰妙菌素和沃尼妙林的殘留量Table 4 Crucian carp residues in various organizations