楊 陽，侯 宇，趙樹林，李璐璐，孫小燕，阿迪萊·艾力，趙紅瓊

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】胃泌素-膽囊收縮素家族多肽包括胃泌素(Gastrin, GAS)、膽囊收縮素(Cholecystokinin，CCK)、雨蛙素(Cerulein)和原脊索動(dòng)物(Proctochordea)神經(jīng)肽(Cionin)等多肽[1]，在哺乳動(dòng)物胃泌素-膽囊收縮素家族僅有GAS和CCK。GAS主要分泌于胃和十二指腸粘膜G細(xì)胞，而CCK主要分泌于十二指腸和空腸黏膜I細(xì)胞，它們對(duì)于消化液的分泌、消化道的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的調(diào)節(jié)作用。在進(jìn)行多肽功能研究、特異性抗體制備等過程中要注意動(dòng)物氨基酸序列不同與受體的親和力可能不同；多肽抗原序列不同，產(chǎn)生的抗體特異性不同，有必要了解目的多肽及其受體在動(dòng)物種屬之間的差異以及進(jìn)化關(guān)系。【前人研究進(jìn)展】根據(jù)氨基酸序列的長(zhǎng)短，GAS主要包括具有34和17個(gè)氨基酸的GAS-34和GAS-17，CCK主要包括具有58、33和8個(gè)氨基酸的CCK-58、CCK-33和CCK-8。根據(jù)GAS和CCK羧基端(C-端)分別對(duì)應(yīng)的第6位和第7位酪氨酸(Tyr)是否發(fā)生硫酸化，分為非硫酸化(-I)和硫酸化(-II)GAS和CCK，例如含17個(gè)氨基酸序列的非硫酸化胃泌素可表示為GAS-17-I，含33個(gè)氨基酸序列的硫酸化膽囊收縮素可表示為CCK-33-II。GAS-CCK家族包括CCK-A受體和CCK-B受體，均為7次跨膜(7-Transmembrane，7-TM)受體。7-TM受體一般包括N-端胞外域(含糖基化位點(diǎn))、跨膜域(含三個(gè)細(xì)胞外環(huán)，三個(gè)細(xì)胞質(zhì)環(huán)和七個(gè)疏水的跨膜片段)和C-端胞漿域(含蛋白激酶硫酸化位點(diǎn))[3-4]。CCK-A僅同CCK-II結(jié)合力強(qiáng)[5]，而CCK-B無論GAS和CCK酪氨酸硫酸化的程度如何均可結(jié)合，因而CCK-B也稱為GAS/CCK-B受體[6-8]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，針對(duì)不同動(dòng)物GAS和CCK及其受體氨基酸序列信息學(xué)的比較分析研究較少。研究對(duì)胃泌素和膽囊收縮素及其受體的氨基酸序列信息學(xué)進(jìn)行比較分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究比較GAS和CCK兩種激素及其受體的氨基酸序列在不同動(dòng)物種間的差異性，特別是羊同其他動(dòng)物之間的序列差異，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為GAS-CCK家族多肽或受體對(duì)羊生長(zhǎng)調(diào)控等領(lǐng)域的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

通過UniProt數(shù)據(jù)庫 (https://www.uniprot.org/)用“Gastrin”或“CCK”為關(guān)鍵詞檢索Gastrin和CCK及其受體的氨基酸序列，在同一種動(dòng)物有多個(gè)數(shù)據(jù)信息的時(shí)候，主要選用Swiss-Prot 標(biāo)記“引用(Reviewed)”的數(shù)據(jù)。再用“排列(Align)”功能進(jìn)行綿羊(Sheep)的某一種GAS和CCK多肽或受體蛋白氨基酸序列(主要為成熟肽或蛋白區(qū)域，不包括信號(hào)肽和原肽等)與其他動(dòng)物序列差異進(jìn)行比較。同時(shí)，比對(duì)了綿羊CCK-A與CCK-B氨基酸序列，并標(biāo)明各自7次跨膜區(qū)域，為其抗原設(shè)計(jì)提供膜內(nèi)外區(qū)域參考。

1.2 方 法

用1.1篩選出的不同動(dòng)物GAS和CCK全肽或受體蛋白氨基酸，包括信號(hào)肽(Signal peptide)、原肽(Propeptide)、成熟肽(Peptide)等所有氨基酸序列，通過DNAstar的Megalign 7.1構(gòu)建GAS和CCK全肽或受體蛋白氨基酸序列進(jìn)化樹[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同動(dòng)物GAS氨基酸序列比對(duì)

研究表明,綿羊(Sheep，UniProt 登錄號(hào)O02 686，下同)GAS-34氨基酸序列同山羊(Goat，P04 564)、牛(Bovine，P01 352)、人(Human，P01 350)、小鼠(Mouse，P48 757)、大鼠(Rat，P04 563)、豬(Pig，P01 351)、豚鼠(Guinea pig，P06 885)、兔(Rabbit，G1TS39)、馬(Horse，P55 885)、狗(Dog，P01 353)、貓(Cat，P01 354)、駱駝(Camel，S9XCX3)、雞(Chicken，Q9PU41)、魚(Fish，A0A0M4JAV4)等14種動(dòng)物比對(duì)情況。從比對(duì)結(jié)果可知，除了雞和魚，其他動(dòng)物GAS-34的C-端7個(gè)氨基酸完全相同；綿羊、山羊和牛GAS-34氨基酸序列完全相同；雞和魚GAS僅C-端4個(gè)氨基酸序列同其它動(dòng)物。圖1

注：藍(lán)色背景氨基酸表示與綿羊GAS氨基酸序列比對(duì)不同的氨基酸

Note: The amino acids with blue background show differences compared to sheep gastrin

圖1 不同動(dòng)物GAS氨基酸序列比較
Fig.1 Comparison of gastrin amino acid sequences in different animals

在UniProt中用BLAST比較可知，綿羊的GAS氨基酸全長(zhǎng)序列同山羊比較完全相同，相似性為100%；其次為牛，相似性為95.2%；同人、大鼠和小鼠相似性分別為69.7%、67.7%和67%。未在BLAST所列的250個(gè)氨基酸序列數(shù)據(jù)庫中找到雞和魚的氨基酸比對(duì)數(shù)據(jù)。

用Megalign構(gòu)建進(jìn)化樹分析GAS全氨基酸序列表明，羊與牛，狗與貓，兔與駱駝，大鼠與小鼠，魚與雞分別在同一個(gè)分支上，草食動(dòng)物相對(duì)較近，而非草食動(dòng)物相對(duì)草食動(dòng)物遠(yuǎn)；魚和雞與其他哺乳動(dòng)物相距最遠(yuǎn)。圖2

圖2 不同動(dòng)物GAS全氨基酸序列進(jìn)化樹
Fig. 2 Evolution tree of whole gastrin amino acid sequence in different animals

2.2 不同動(dòng)物CCK氨基酸序列比對(duì)

研究表明,綿羊(Sheep，W5NZD6)CCK-33氨基酸序列同牛(Bovine，P41 520)、貓(Cat，M3W5D6)、小鼠(Mouse，P09 240)、豬(Pig，P01 356)、兔(Rabbit，G1T9Y3)、狗(Dog，Q9TS44)、人(Human，P06 307)、大鼠(Rat，P01 355)、馬(Horse，F(xiàn)7BAG1)、駱駝(Camel，S9WZ08)、鴕鳥(Ostrich，Q9PU29)、雞(Chicken，Q9PU41)、金魚(Goldfish，O93 464)、豚鼠(Guinea pig，H0VR95)等14種動(dòng)物比對(duì)情況。所有比對(duì)的15種動(dòng)物CCK-4(C-端4個(gè)氨基酸)完全相同；綿羊、牛和貓CCK-33序列完全相同；除了豚鼠外，所有比對(duì)動(dòng)物CCK-8(C-端8個(gè)氨基酸，為具有生物活性的最小CCK)完全相同；鴕鳥、雞、金魚和豚鼠CCK-33氨基端與綿羊等比較差異較大。

用Megalign構(gòu)建進(jìn)化樹分析CCK氨基酸全序列表明，綿羊與牛，豬與貓，大鼠與小鼠，人與兔，鴕鳥與雞分別在同一個(gè)分支上；魚類和禽類與其他哺乳動(dòng)物相距較遠(yuǎn)。在UniProt中用BLAST比較可知，綿羊同牛CCK氨基酸序列全長(zhǎng)的相似性最高，達(dá)95.7%；其次為狗，達(dá)91.4%；同人、大鼠和小鼠相似性分別為80%、76.8%和74.8%；與鴕鳥的相似性最低，僅為49.2%。未在BLAST所列的250個(gè)氨基酸序列中檢索到與豚鼠的相似性數(shù)據(jù)。

注：藍(lán)色背景氨基酸表示與綿羊CCK氨基酸序列比對(duì)不同的氨基酸

Note: The amino acids with blue background show differences compared to sheep CCK

圖3 不同動(dòng)物CCK氨基酸序列比較
Fig. 3 Comparison of CCK amino acid sequence in different animals

圖4 不同動(dòng)物CCK全氨基酸序列進(jìn)化樹
Fig. 4 Evolution tree of whole CCK amino acid sequence in different animals

2.3 不同動(dòng)物CCK-A和CCK-B氨基酸序列比較

研究表明,CCK-A氨基酸序列進(jìn)化樹包括羊(Sheep，W5PET0)、牛(Bovine，A6QLH2)、人(Human，P32 238)、大鼠(Rat，P30 551)、小鼠(Mouse，O08 786)、豬(Pig，I3LFK5)、豚鼠(Guinea pig，Q63 931)、兔(Rabbit，O97772)、馬(Horse，F(xiàn)7AHW8)、狗(Dog，Q5D0K2)、貓(Cat，M3W880)、雞(Chicken，E5RVJ7)和魚(Fish，H2LRS6)。在進(jìn)化樹中，大鼠與小鼠、狗與貓、羊與牛分別在同一個(gè)分支上，魚類和禽類同其他哺乳動(dòng)物相距較遠(yuǎn)。BLAST分析顯示相對(duì)于綿羊CCK-A的氨基酸序列，與之相似性最高的是牛，為92.2%；其次為人、貓、豬，分別為87.6%、87.4%、87.2%；魚與綿羊CCK-A相似性最低，僅為59.4%。圖5

研究表明，CCK-B氨基酸序列進(jìn)化樹，包括羊(Sheep，W5QBM9)、牛(Bovine，P79266)、人(Human，P32239)、大鼠(Rat，P30553)、小鼠(Mouse，P56481)、豬(Pig，A0A287A2K5)、豚鼠(Guinea pig，H0VZC5)、兔(Rabbit，P46627)、馬(Horse，F(xiàn)6S229)、狗(Dog，P30552)、貓(Cat，M3WFK8)，雞(Chicken，A0A1D5P3F3)和金魚(Goldish，A0A0D5CPE1)。在進(jìn)化樹中，羊與牛、狗與貓、兔與人、豚鼠、大鼠與小鼠分別在同一個(gè)分支上，魚類和禽類與其他哺乳動(dòng)物相距較遠(yuǎn)。BLAST分析顯示，對(duì)于綿羊CCK-B的氨基酸序列，相似性最高的為牛，達(dá)98.7%，其次為豬，達(dá)94.7% ，與雞相似性最低，僅為57%。圖6

圖5 不同動(dòng)物CCK-A全氨基酸序列進(jìn)化樹
Fig. 5 Evolution tree of whole CCK-A amino acid sequences in different animals

圖6 不同動(dòng)物CCK-B全氨基酸序列進(jìn)化樹
Fig. 6 Evolution tree of whole CCK-B amino acid sequences in different animals

從UniProt數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)綿羊CCK-A(W5PET0)和CCK-B(W5QBM9)氨基酸序列長(zhǎng)度分別為452個(gè)和454個(gè)，位點(diǎn)相同氨基酸有216個(gè)，相似性為45.094%，但兩個(gè)受體氨基酸序列均為“Unreviewed”。兩個(gè)受體氨基酸序列比較可知，CCK-A和CCK-B的N-端胞外域分別為1～59和1～57位，C-端胞漿域分別為397～452和400～454位；兩種受體七個(gè)疏水的跨膜片段氨基酸位置比較相近，但序列有所差異。圖7

注：藍(lán)色背景部分氨基酸為7次跨膜區(qū)域

Note：Amino acid with blue background means the 7-TM region

圖7 綿羊CCK-A和CCK-B氨基酸序列比較
Fig.7 Amino acid sequences of the sheep CCK-A and CCK-B

3 討 論

對(duì)不同動(dòng)物GAS和CCK及其受體氨基酸序列進(jìn)行了比較，該比較結(jié)果可為不同動(dòng)物這兩種多肽及其受體蛋白抗原設(shè)計(jì)和活性多肽篩選提供參考。無論GAS還是CCK其生物學(xué)活性部位均在C-端[10]，序列比對(duì)結(jié)果顯示不同動(dòng)物之間C-端氨基酸序列相對(duì)于N-端序列具有高度的保守性。盡管在生理功能方面GAS被認(rèn)為主要是促進(jìn)胃液的分泌，而CCK主要是促進(jìn)膽囊收縮，但在生理功能方面兩者具有一定交叉性，例如刺激膽汁和ghrelin分泌等功能[11-13]。因此，在用ELISA、蛋白印跡和放射免疫等方法檢測(cè)和定位組織中GAS或CCK多肽的時(shí)候，要注意使用的抗體是否存在與CCK或GAS的交叉反應(yīng)問題，如果存在交叉反應(yīng)，多肽含量檢測(cè)結(jié)果將偏高，而其組織定位可能出現(xiàn)假陽性。

從受體親和力看，CCK-A僅同C-端第7位酪氨酸硫酸化的CCK(即CCK-II)結(jié)合力強(qiáng)，也就是說，如果要激活CCK-A受體，除了需要C-端保守的氨基酸序列外，第7位酪氨酸硫酸化也是必須的[14]。相反，無論GAS和CCK是否酪氨酸硫酸化，CCK-B均可與其結(jié)合[15]。目前，市面上出售的GAS或CCK產(chǎn)品，主要是根據(jù)人或鼠類氨基酸序列制備，因而在選購(gòu)用于其他動(dòng)物的GAS或CCK產(chǎn)品時(shí)，要關(guān)注購(gòu)買多肽C-端序列是否和目的動(dòng)物的相似，相似性越高，則在目的動(dòng)物使用與其內(nèi)源性受體親和力越高，受體激活后表現(xiàn)出的生物學(xué)效應(yīng)也越強(qiáng)。Zhao等[16]研究表明，一次性靜脈注射牛GAS-17和GAS-34(無論是否第6位酪氨酸硫酸化)均可促進(jìn)犢牛血液生長(zhǎng)激素水平升高，而注射同樣摩爾劑量CCK-4或者GAS-9均未影響犢牛生長(zhǎng)激素水平，可見雖然后兩種多肽與前兩種多肽C-端部分氨基酸相同，但是卻無該促進(jìn)生長(zhǎng)激素分泌的生物學(xué)效應(yīng)。

CCK-A和CCK-B兩種受體亞型均屬于G蛋白偶聯(lián)7-TM受體家族，包括N-端胞外域(含糖基化位點(diǎn))、跨膜域(含三個(gè)細(xì)胞外環(huán)，三個(gè)細(xì)胞質(zhì)環(huán)和七個(gè)疏水的跨膜片段)和C-端胞漿域(含蛋白激酶硫酸化位點(diǎn))[17-18]。研究顯示，羊CCK-A和CCK-B兩種受體相似性僅為45.094%，這可能是它們同內(nèi)源性配體(GAS和CCK)親和力不同的原因之一[19]。在用多肽片段為抗原制備膜受體特異性抗體的時(shí)候，最好選擇靶動(dòng)物N-端胞外域或跨膜域的三個(gè)細(xì)胞外環(huán)氨基酸序列，這樣利于將來獲得的抗體在不破壞細(xì)胞的情況下與靶動(dòng)物受體膜外區(qū)域結(jié)合。同樣，在選擇商品化受體抗體的時(shí)候，也要關(guān)注其使用的抗原氨基酸序列是否在靶動(dòng)物受體序列存在或相似度高，以此初步判定是否可使用該商品化受體抗體。

哺乳動(dòng)物血液循環(huán)中具有生物活性最小的GAS是GAS-17[20-21]；研究顯示，雞和魚GAS的C-端僅有5個(gè)氨基酸與哺乳動(dòng)物相同，因而在禽類和魚類是否存在具有生物活性的GAS值得探討。哺乳動(dòng)物血液循環(huán)中具有生物活性最小的CCK是CCK-8，而雞和魚CCK的C-端有10個(gè)氨基酸與哺乳動(dòng)物相同，因而從氨基酸序列比對(duì)結(jié)果可以推測(cè)在禽類和魚類應(yīng)具有生物活性的CCK。

4 結(jié) 論

除了雞和魚，其他動(dòng)物GAS-34的C-端7個(gè)氨基酸完全相同；綿羊、山羊和牛GAS-34氨基酸序列相似性為100%；雞和魚GAS僅C-端4個(gè)氨基酸序列同其它動(dòng)物。所有比對(duì)的15種動(dòng)物CCK-4(C-端4個(gè)氨基酸)完全相同；綿羊、牛和貓CCK-33序列相似性為100%；除了豚鼠外，所有比對(duì)動(dòng)物CCK-8(C-端8個(gè)氨基酸，為具有生物活性的最小CCK)完全相同。

綿羊的GAS氨基酸全長(zhǎng)序列同山羊比較完全相同，相似性為100%；其次為牛，相似性為95.2%；綿羊同牛CCK氨基酸序列全長(zhǎng)的相似性最高，達(dá)95.7%；其次為狗，達(dá)91.4%。從GAS和CCK及受體全氨基酸序列(包括信號(hào)肽和原肽)來看，禽類和魚類序列同哺乳動(dòng)物差距均較大；綿羊CCK-A與CCK-B氨基酸序列相似性僅為45.094%。

GAS和CCK的C-端氨基酸序列在不同動(dòng)物之間均具有高度的保守性，而N-端為變化區(qū)域。該信息分析學(xué)結(jié)果為不同動(dòng)物這兩種多肽及其受體蛋白抗原設(shè)計(jì)和活性多肽篩選等研究提供參考。