胡丹陽，蔣碧云，王 獻(xiàn)，劉曉慧

(1.中南民族大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，國家民事委員會(huì)分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430074；2.復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院，上海 200032)

糖基化是一種具有重要生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)翻譯后修飾。與許多其他翻譯后修飾不同，蛋白質(zhì)的N糖基化的主要結(jié)構(gòu)N-聚糖是由許多單糖單元組成，且呈非線性排列，具有結(jié)構(gòu)多樣性，研究蛋白質(zhì)的糖基化對了解其生物學(xué)結(jié)構(gòu)和功能有著重要意義，如對糖蛋白和糖基化位點(diǎn)、對糖型進(jìn)行鑒定等[1-3]。研究表明[4-7]，糖蛋白參與了很多重要的生物學(xué)過程，包括細(xì)胞粘附、分子運(yùn)輸、受體激活和特定的蛋白功能等，許多疾病的病理過程與糖蛋白表達(dá)量的變化密切相關(guān)。據(jù)報(bào)道[8-9]，美國食品藥品監(jiān)督局批準(zhǔn)的25%腫瘤標(biāo)志物都是糖蛋白，例如載脂蛋白A1、甲胎蛋白(α-Fetoprotein)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen)等。

研究蛋白質(zhì)糖基化具有一定難度。糖蛋白在復(fù)雜樣品中的含量較低，糖肽的離子化效率有限，其質(zhì)譜響應(yīng)信號強(qiáng)度遠(yuǎn)低于非糖肽，且具有高度的微觀不均一性，若糖蛋白、糖肽不經(jīng)富集，幾乎無法用于質(zhì)譜直接鑒定[10-12]。因此，為獲得較理想的質(zhì)譜信息，在樣品處理過程中，將糖蛋白、糖肽從復(fù)雜樣品中富集出來是關(guān)鍵步驟。常見的糖蛋白/糖肽富集方法包括凝集素富集法、肼化學(xué)富集法[13]、兩性離子親水相互作用色譜富集法(zwitterionic hydrophilic interaction liquid chromatography, ZIC-HILIC)等。凝集素富集法是通過凝集素選擇性地識(shí)別某些特殊結(jié)構(gòu)的單糖或聚糖而實(shí)現(xiàn)對糖蛋白的富集，雖然該法具有高度的特異性，但凝集素與糖蛋白的結(jié)合力較弱[14]。肼化學(xué)富集法是通過糖鏈的順式二羥基被高碘酸鈉氧化形成二醛，然后與固定相上的肼官能團(tuán)反應(yīng)形成腙進(jìn)行富集，其特異性好、效率高，但糖鏈結(jié)構(gòu)會(huì)受到破壞[15]。糖基化修飾中的聚糖基團(tuán)具有親水性，親水相互作用色譜法(hydrophilic interaction liquid chromatography, HILIC)不需要對樣品進(jìn)行衍生，具有較強(qiáng)的保留能力。在此基礎(chǔ)上發(fā)展的兩性離子親水相互作用色譜(ZIC-HILIC)則是利用電荷相互作用和親水相互作用富集糖肽，固定相上存在正電荷和負(fù)電荷的中心，可以和被分析物表面基團(tuán)以及流動(dòng)相中的電解質(zhì)產(chǎn)生電荷相互作用和電荷-偶極相互作用，從而對糖肽進(jìn)行富集[16]。該方法高效、快速、不易破壞糖鏈。

糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝性疾病，目前糖尿病患者需終生服藥，飲食方面有諸多禁忌，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。糖尿病還伴隨多種并發(fā)癥，長期血糖升高會(huì)對心臟、血管、眼睛、腎臟和神經(jīng)系統(tǒng)造成較大損傷。目前，全球已有超過4億人患有糖尿病[17]，我國的糖尿病患者約9 500萬，糖尿病前期患者約1.5億[18]。研究發(fā)現(xiàn)，患者糖蛋白的表達(dá)量發(fā)生了變化[19-21]，O-糖基化糖蛋白在糖尿病及其并發(fā)癥的病因及形成中有重要作用[22]，但關(guān)于N-糖基化糖蛋白的相關(guān)報(bào)道較少。

本工作擬以6例正常人與6例糖尿病人的血清為樣品，深入研究N-糖蛋白，對血清進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)和糖蛋白質(zhì)組學(xué)的非標(biāo)記定量(label-free quantification)，以系統(tǒng)、全面地揭示糖尿病發(fā)病過程中蛋白質(zhì)和糖基化后修飾的變化，希望為進(jìn)一步揭示糖尿病的發(fā)病機(jī)理提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

Eksigent UPLC超高效液相色譜儀、Triple-TOFTM5600高分辨質(zhì)譜儀：均為美國AB Sciex公司產(chǎn)品；Milli-Q超純水系統(tǒng)：美國Millipore公司產(chǎn)品；C18除鹽柱：美國Waters公司產(chǎn)品；離心機(jī)、真空濃縮儀器、恒溫混勻儀：德國Eppendorf公司產(chǎn)品；兩性離子親水相互作用填料(ZIC-HILIC particles)、-80 ℃超低溫冰箱：美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品。

糖尿病人血清、正常人血清：由中山醫(yī)院提供；碳酸氫銨、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、三氟乙酸(TFA)：均為美國Sigma公司產(chǎn)品；胰蛋白酶(Trypsin)：美國Promega公司產(chǎn)品；肽N-糖苷酶F(PNGaseF)：美國New England Biolabs公司產(chǎn)品；乙腈(ACN)：德國Merck公司產(chǎn)品；甲酸：美國Fisher Scientific公司產(chǎn)品。

1.2 血清收集與處理

將采集的血液樣品在不加抗凝劑的情況下室溫靜置1 h凝血，隨后以1 500 r/min離心10 min，取上清液得到血清，分裝并置于-80 ℃冰箱保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)取出血清，在冰上進(jìn)行解凍，低溫下以14 000 r/min離心30 min，取中層血清于離心管中，并編號。

1.3 蛋白質(zhì)酶解與C18除鹽

各取55 μL每例血清，分別加入終濃度為1 mol/L尿素和100 mmol/L碳酸氫銨溶液稀釋后，使血清蛋白質(zhì)充分變性，然后加入終濃度為10 mmol/L二硫蘇糖醇，于56 ℃恒溫反應(yīng)1 h；避光加入終濃度25 mmol/L碘乙酰胺，于37 ℃避光振蕩30 min；按照胰蛋白酶與蛋白質(zhì)量比1∶50加入胰蛋白酶，于37 ℃反應(yīng)過夜；將酶解后的溶液以14 000 r/min離心15 min去除懸浮微粒，然后加入200 μL 乙腈活化C18柱，用200 μL 0.1%三氟乙酸平衡柱子；將酶解好的蛋白質(zhì)溶液重復(fù)上樣3次，并用0.1%三氟乙酸清洗3次；依次用200 μL 30%乙腈+0.1%三氟乙酸、60%乙腈+0.1%三氟乙酸將肽段從C18柱上洗脫下來，將多次洗脫液混合均勻后，各取每個(gè)樣品40 μL洗脫液于離心管中，在凍干機(jī)中凍干，直接用于蛋白水平質(zhì)譜鑒定；將剩余的洗脫液置于凍干機(jī)中凍干，待糖肽富集實(shí)驗(yàn)。

1.4 糖肽富集

將上述剩余肽段用200 μL 80%乙腈+1%三氟乙酸溶液溶解，并用200 μL 80%乙腈+1%三氟乙酸溶液平衡活化ZIC-HILIC柱3次，重復(fù)上樣3次，用80%乙腈+1%三氟乙酸淋洗6次除去未結(jié)合的肽段；然后將保留于ZIC-HILIC柱上的糖肽用0.1%TFA洗脫2次，收集洗脫液，凍干后置于-20 ℃冰箱中備用。將富集的糖肽用100 mmol/L碳酸氫銨溶解，向其中加入PNGaseF酶，并在37 ℃孵育振蕩過夜處理；將酶解后的肽段凍干，并用0.1%甲酸溶解，待LC-MS/MS分析，所有樣品處理過程一致。

1.5 實(shí)驗(yàn)條件

用于做全蛋白質(zhì)組分析的肽段以及經(jīng)富集后的糖肽，均以相同的液相色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行分析。采用Eksigent UPLC色譜儀與AB Sciex TripleTOF?5600質(zhì)譜儀聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行LC-MS/MS實(shí)驗(yàn)。

1.5.1色譜條件 C18反相色譜柱(0.3 mm×150 mm×3 μm)；流動(dòng)相：A為0.1%FA水溶液，B為0.1%FA的乙腈溶液；流速5 μL/min；洗脫程序：0～1 min(5%～7%B)，1～94 min(7%～24%B)，94～109 min(24%～38%B)，109～109.5 min(38%～80%B)，109.5～114 min(80%B)，114～114.5 min(80%～5%B)，114.5～119 min(5%B)。

1.5.2質(zhì)譜條件 正離子模式檢測；氣簾氣壓強(qiáng)172.4 kPa；噴霧電壓2 300 V；一級質(zhì)譜采集的質(zhì)量掃描范圍為m/z350～1 250；采集模式為數(shù)據(jù)依賴采集，并選取豐度最高的20個(gè)母離子進(jìn)行二級掃描；動(dòng)態(tài)排除時(shí)間為14 s，排除已檢測到的離子；檢測的肽段所帶電荷數(shù)為2～4。

1.6 數(shù)據(jù)庫檢索

質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用 Maxquant(1.6.0.1版本)軟件進(jìn)行分析，以Uniprot_human(20 394條肽段)為蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜庫。搜索參數(shù)：Trypsin蛋白酶，糖肽/糖蛋白鑒定漏切上限是2個(gè)(全蛋白組漏切位點(diǎn)參數(shù)設(shè)置為1)；可變修飾(variable modification)：蛋白N端乙?；?N-terminal acetylatin(+42.01 u))，甲硫氨酸上的氧化修飾(oxidation[M](+15.99 u))，天冬酰胺脫酰胺基(deamidated-N(+0.98 u))(僅限于糖蛋白)；固定修飾(fixed modification)：半胱氨酸的還原烷基化修飾(carbamidomethy[C]，(+57.02 u))；MS的質(zhì)量誤差為40×10-6，MS/MS的質(zhì)量誤差設(shè)為0.1 u，蛋白假陽性率(false discovery rate, FDR)設(shè)為1%；組間匹配(match between runs)：匹配時(shí)間窗口為0.7；對齊時(shí)間窗口為20；非標(biāo)定量參數(shù)：LFQ label-free定量，設(shè)定選擇獨(dú)有肽段(unique peptide)的強(qiáng)度信息進(jìn)行定量。各組數(shù)據(jù)依據(jù)總強(qiáng)度信息進(jìn)行強(qiáng)度歸一化后，組間通過肽段強(qiáng)度進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)方法

作為最廣泛的蛋白后修飾，糖基化修飾在疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中受到較多關(guān)注。糖蛋白天然豐度較低，非糖基化肽會(huì)嚴(yán)重干擾糖肽的信號，因此蛋白富集是糖蛋白組學(xué)分析中的重要環(huán)節(jié)之一。 ZIC-HILIC是一種簡單、快速且高通量的糖蛋白富集方法，處理過程不需要衍生，且不破壞糖鏈結(jié)構(gòu)，因此被廣泛應(yīng)用于糖基化位點(diǎn)、完整糖肽和位點(diǎn)特異性的糖蛋白分析。本研究采用ZIC-HILIC對糖肽進(jìn)行富集和分析，為了更準(zhǔn)確地找到糖基化水平發(fā)生變化的蛋白質(zhì)，選用未經(jīng)富集的肽段進(jìn)行定量分析，以蛋白質(zhì)表達(dá)水平作為參考，同時(shí)找出差異蛋白質(zhì)和糖基化水平發(fā)生變化的差異糖蛋白質(zhì)信息，作為研究糖尿病發(fā)生發(fā)展的參考。

常規(guī)蛋白質(zhì)組學(xué)研究采用的納升級液相色譜-質(zhì)譜法(nano-LC-MS/MS)具有檢測靈敏度高的特點(diǎn)，但是也存在較多缺點(diǎn)。首先，nano-LC-MS/MS的負(fù)載容量低，導(dǎo)致生物基質(zhì)中的濃度敏感度較低；其次，操作穩(wěn)定性相對較差，需要耗費(fèi)大量的人力、物力用來維護(hù)儀器，且分析通量相對較低，限制了其在大型隊(duì)列分析中的應(yīng)用。為了增加分析通量，且保證定量分析的穩(wěn)定性，本研究選擇微升級液相色譜-質(zhì)譜法(micro-LC-MS/MS)，同時(shí)采用label-free方法進(jìn)行定量分析，一次分析12個(gè)樣品的蛋白質(zhì)組差異和糖蛋白質(zhì)組差異。

血清樣品取材侵入性小、易于保存，且包含了機(jī)體豐富的生理病理信息，是疾病早期診斷和預(yù)后研究中重要的生物樣品材料。因此，本研究以6例正常人與6例糖尿病人的血清為樣品，對其進(jìn)行Trypsin酶解后分成2份，其中1份進(jìn)行LC-MS/MS分析，得到全蛋白質(zhì)組的定性和定量結(jié)果；另一份經(jīng)HILIC富集糖肽與PNGaseF酶切糖肽后進(jìn)行LC-MS/MS鑒定，得到糖肽的鑒定和差異表達(dá)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)流程示于圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖Fig.1 Flow chart of analysis of serum

2.2 血清蛋白與糖蛋白定量結(jié)果分析

通過Maxquant搜庫得到6例正常人與6例糖尿病人血清樣品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)信息，在蛋白質(zhì)水平上，選取2種樣品均含有的肽段進(jìn)行去冗余，共鑒定出291個(gè)非冗余蛋白質(zhì)和2 500條非冗余肽段；在糖肽水平上，首先以Deamidated為條件篩選出糖基化的肽段，選取2種樣品均含有的糖基化肽段去冗余，并找出具有糖基化位點(diǎn)序列特征(N-!P-S/T/C，其中!P不是脯氨酸)的肽段，結(jié)果共鑒定到181個(gè)非冗余糖蛋白和637條非冗余糖基化肽段。

采用Student’s T-test，以蛋白質(zhì)在糖尿病患者血清和正常人血清中表達(dá)含量作為參考，找出具有顯著性差異的蛋白(P<0.05)，并分別以兩組樣品中的蛋白強(qiáng)度平均值計(jì)算含量比值。為找到更多的差異蛋白質(zhì)，采用表達(dá)量± 20%為差異，即蛋白在糖尿病患者血清中相比正常人血清升高1.2倍或者降低0.8倍為參考值[23-25]。在蛋白水平上共分析得到65種差異蛋白質(zhì)，其中有29種顯著下調(diào)，36種顯著上調(diào)，結(jié)果列于表1。在糖蛋白水平上，分析得到24種正常人血清與糖尿病患者血清的差異糖蛋白，其中有17種顯著上調(diào)，7種顯著下調(diào)，并對糖蛋白的位點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)注，結(jié)果列于表2。

表1 蛋白水平上差異蛋白信息Table 1 Information of differential protein on protein level

續(xù)表1

續(xù)表1

注：#DIV/0!代表正常血清6次重復(fù)中有0次有定量值的情況

表2 糖尿病人與正常人血清的差異糖蛋白信息Table 2 Differential glycoprotein information between diabetic and normal human serum

注：*表示糖蛋白的位點(diǎn)

2.3 蛋白與糖蛋白水平的比較分析

通過比較蛋白和糖基化水平的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)有21種蛋白質(zhì)在蛋白水平上無差異而糖基化水平表達(dá)有差異，結(jié)果列于表3。選取其中2種代表性的糖蛋白進(jìn)行分析。

硒蛋白P是一種特殊的細(xì)胞外糖蛋白，有研究表明[26-28]，無論硒蛋白過量或缺乏，均會(huì)引起體內(nèi)葡萄糖穩(wěn)態(tài)的異常調(diào)節(jié)。本研究中，糖尿病患者血清中的硒蛋白P有1.7倍上調(diào)，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[27]，硒蛋白P通過抑制肝臟中AMP活化蛋白激酶和乙酰CoA羧化酶的磷酸化水平抑制胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而導(dǎo)致胰島素抵抗和糖尿病的發(fā)生和發(fā)展。

載脂蛋白B-100的主要功能是：1) 將膽固醇運(yùn)送到外周組織；2) 識(shí)別、調(diào)節(jié)低密度脂蛋白受體與低密度脂蛋白的結(jié)合；3) 刺激血管平滑肌增生，與內(nèi)膜基質(zhì)結(jié)合[29]。結(jié)果表明，糖尿病患者血清中的載脂蛋白B-100的含量有2.83倍上調(diào)，可能是由于糖尿病患者血漿中低密度脂蛋白膽固醇濃度升高，或高血糖下低密度脂蛋白修飾使其無法進(jìn)入正常的代謝途徑，從而引起病變[30]。

表3 蛋白水平無差異而糖基化水平有差異的蛋白質(zhì)信息Table 3 Protein information with no difference in protein levels and difference in glycosylation levels

2.4 差異蛋白與糖蛋白的功能富集分析及比較

為了深入了解鑒定到的差異蛋白與差異糖蛋白所屬的細(xì)胞組分、對應(yīng)的分子功能和參與的生物學(xué)過程，本實(shí)驗(yàn)使用DAVID軟件(https:∥david.ncifcrf.gov/)對鑒定到的差異蛋白與差異糖蛋白進(jìn)行基因本體功能富集分析(gene ontology, GO)，結(jié)果示于圖2。

從圖2可見，差異蛋白質(zhì)主要集中在血微粒、細(xì)胞外區(qū)域、胞外外泌體、細(xì)胞外間隙等區(qū)域；差異糖蛋白質(zhì)主要集中于血微粒、細(xì)胞外區(qū)域、血小板、胞外外泌體等區(qū)域。在分子功能富集分析中，差異蛋白質(zhì)行使的分子功能包括絲氨酸型肽鏈內(nèi)切酶活性、絲氨酸型肽鏈內(nèi)切酶抑制劑活性、肽鏈內(nèi)切酶抑制劑活性、肝素結(jié)合等；差異糖蛋白的分子功能包括絲氨酸型肽鏈內(nèi)切酶活性、肝素結(jié)合、絲氨酸型肽鏈內(nèi)切酶抑制劑活性、免疫球蛋白A結(jié)合等。差異蛋白參與的主要生物學(xué)過程包括補(bǔ)體激活(經(jīng)典途徑)、血小板解聚、補(bǔ)體激活的調(diào)節(jié)、補(bǔ)體激活等；差異糖蛋白參與的生物進(jìn)程有血小板解聚、凝血(內(nèi)在途經(jīng))、受體介導(dǎo)內(nèi)吞作用、凝血等。

比較差異蛋白質(zhì)與差異糖蛋白質(zhì)功能富集結(jié)果，發(fā)現(xiàn)二者細(xì)胞定位接近；在分子功能上，差異蛋白質(zhì)中絲氨酸型肽鏈內(nèi)切酶活性、絲氨酸型肽鏈內(nèi)切酶抑制劑活性所占比例與差異糖蛋白中相應(yīng)比例相差較大；生物過程中，差異蛋白參與的生物過程較多，且分布相對均勻，差異糖蛋白中血小板解聚以及凝血相關(guān)過程所占比例較大。

圖2 差異蛋白(a,b,c)與差異糖蛋白(d,e,f)的GO分析圖Fig.2 GO analysis of differentially expressed proteins (a, b, c) and differentially expressed glycoproteins (d, e, f)

3 結(jié)論

為揭示糖尿病發(fā)病過程中糖蛋白的變化，本研究根據(jù)糖尿病的特點(diǎn)以及分析要求，從樣品選擇、糖肽富集方法、LC-MS/MS分析和數(shù)據(jù)處理等方面進(jìn)行了探討。選擇血清作為研究對象，并選用穩(wěn)定性好的micro-LC-MS/MS方法進(jìn)行l(wèi)abel-free檢測，建立了基于所有肽段與ZIC-HILIC富集后肽段雙重定量的方法以確定蛋白質(zhì)糖基化的差異。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)得到65個(gè)蛋白水平的差異蛋白，鑒定得到24種糖基化水平的顯著差異糖蛋白，該實(shí)驗(yàn)可為復(fù)雜體系樣品分析、差異蛋白質(zhì)的定性定量分析提供可靠準(zhǔn)確的方法，同時(shí)為糖尿病的研究提供詳實(shí)的數(shù)據(jù)參考。