王子銘，王麗琴，馬珍珍，楊 璐

(1.西北大學文化遺產(chǎn)學院，陜西 西安 710069；2.文化遺產(chǎn)研究與保護技術(shù)教育部重點實驗室，陜西 西安 710069)

中國古代所使用的膠結(jié)材料主要是天然化合物，如雞蛋、動物膠(骨皮、乳汁、血液)及植物膠等，該類物質(zhì)易降解、老化，給分析鑒定工作帶來了挑戰(zhàn)。目前，文物蛋白膠結(jié)材料(以下簡稱“膠料”)的分析方法主要有氨基酸分析法[1]、紅外光譜法[2-4]、拉曼光譜法[5-6]、高效液相色譜法[7]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[8-9]等。氨基酸分析法能檢測蛋白質(zhì)水解后生成的單一氨基酸，測定膠料中氨基酸總量，但需要樣品量較大[10]；紅外光譜和拉曼光譜同屬振動光譜，與色譜技術(shù)相比，檢出限較高[6]，但紅外光譜法只能通過特征峰鑒別含有多糖和蛋白質(zhì)的膠結(jié)材料，難以細分膠料種類[2]。色譜法是常見的有機物分析方法，其中液相色譜法具有優(yōu)異的重現(xiàn)性，適用于不易氣化或受熱易分解的樣品。但測定文物蛋白膠料時，由于氨基酸本身在紫外區(qū)吸收很弱，熒光性質(zhì)也較差，需先將其衍生為紫外吸收較強或有熒光性質(zhì)的物質(zhì)以便測試[11]。與液相色譜法相比，氣相色譜法更適于分析易氣化的樣品，具有較高的分離效能和靈敏度[12]，氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用后，在具有高效分離性能的基礎(chǔ)上，兼具特異鑒別能力[13]，這對測量復雜的文物樣品體系十分重要。

國內(nèi)外學者已利用GC-MS鑒定文物中的多種膠結(jié)材料。Guttmann等[14]使用GC-MS鑒別了19世紀特蘭西瓦尼亞玻璃繪畫中的膠結(jié)材料及其降解產(chǎn)物，其中雞蛋、動物膠、牛奶(酪蛋白)和亞麻籽油廣泛應用，部分樣品使用了松香和多糖類物質(zhì)；在古羅馬壁畫膠結(jié)材料中，植物蠟、十字花科植物油及松香等植物提取物比動物膠更受偏愛[15]。GC-MS分析結(jié)合光學顯微鏡觀察能用于壁畫工藝研究。例如，Tomasini等[16]采用該技術(shù)確定玻利維亞圣母瑪利亞教堂的壁畫是先用動物膠涂在石膏層上打底，然后將雞蛋和亞麻籽油與顏料混合的繪制工藝。但GC-MS鑒定蛋白膠料的方法學研究在國內(nèi)外仍為空白。本研究擬探討文物蛋白膠料的氣相色譜-質(zhì)譜分析方法，測定丙氨酸、甘氨酸等11種氨基酸的精密度和檢出限，并應用于文物蛋白膠料的鑒定。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Agilent公司產(chǎn)品，配有電子轟擊離子源(EI)及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；MSD-8G微波消解儀：上海新儀微波化學科技公司產(chǎn)品；KQ-500E超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；LXJ-ⅡB離心機：上海安亭科學儀器廠產(chǎn)品；QYN100-2氮氣吹掃儀：上海喬躍電子有限公司產(chǎn)品；Master-S Hitech-Sciencetool實驗室超純水系統(tǒng)：上海和泰儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

AAS18混合氨基酸標準溶液(包含L-丙氨酸、甘氨酸、L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-絲氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-天冬氨酸和L-谷氨酸，濃度均為2.5 mmol/L)，L-羥脯氨酸(簡稱Hyp)，內(nèi)標氨基酸為L-正亮氨酸(簡稱Nor)，衍生化試劑為N-(叔丁基二甲硅烷基)-N-甲基三氟乙酰胺(簡稱MTBSTFA)+1%特丁基二甲基氯代硅烷：均為美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；氨水、吡啶：色譜純，天津市光復精細化工研究所產(chǎn)品；三乙胺：色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司產(chǎn)品；高純氦氣(純度99.999%)：四川梅塞爾氣體產(chǎn)品有限公司產(chǎn)品；鹽酸：優(yōu)級純，四川西隴化工有限公司產(chǎn)品；實驗用水：Master-S Hitech-Sciencetool實驗室超純水。

豬皮膠：按照古代動物膠的制作工藝制成[17]；全蛋和牛奶：均為市售雞蛋和牛奶。

1.3 實驗條件

1.3.1色譜條件 色譜柱：HP MS-5毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；升溫程序：100 ℃保持2 min，以6 ℃/min升至280 ℃，并保持至所有待測物全部流出；載氣(He)流速1.5 mL/min。

1.3.2質(zhì)譜條件 電子轟擊(EI)離子源；電子能量70 eV；接口溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃。

1.4 實驗方法

1.4.1標準曲線 (1) 樣品配制：以水為溶劑將上述AAS18混合氨基酸標準溶液稀釋10倍，溶液中所分析的11種氨基酸濃度為0.25 mmol/L，該溶液簡稱為“混標”。分別取適量Hyp和Nor粉末，用水配制成1.25 mmol/L Hyp溶液，80 μg/g Nor溶液備用。(2) 取樣、加內(nèi)標：共選擇8個濃度點，取1、3、5、7、9、11、13、15 μL(混標和Hyp溶液各1 μL，以下同)，分別加入5 μL 80 μg/g Nor內(nèi)標，氮氣吹掃儀吹干。(3) 衍生化處理：在每個吹干后的樣品中，分別加入40 μL吡啶、10 μL衍生化試劑、2 μL三乙胺，放入烘箱中，于65 ℃下衍生30 min。(4) GC-MS測試：吸取2 μL樣品，手動進樣，按照1.3節(jié)條件進行測試，平行測量6次。

1.4.2檢出限 (1) 萃?。杭? 200 μL 2.5 mol/L氨水溶液于樣品瓶中，置于超聲波儀中萃取1.5 h，重復2次，將離心得到的上層萃取液于氮氣保護下吹干。(2) 凈化：采用固相萃取C4柱進行樣品凈化，方法同文獻[18]。(3) 水解：微波輔助鹽酸法水解蛋白質(zhì)。在步驟(2)的樣品瓶中加入2滴6 mol/L HCl，置于加有10 mL 6 mol/L HCl的消解罐中，充入氮氣并立即旋緊消解罐蓋子，于微波消解儀中進行水解。微波水解條件為：在500 W功率下，100 ℃加熱15 min后升溫至160 ℃，加熱30 min。(4) 衍生化處理：取出樣品瓶，冷卻降溫后加入5 μL 80 μg/g Nor內(nèi)標，并于氮氣保護下吹干。衍生化處理方法同1.4.1節(jié)中的步驟(3)。(5) GC-MS測試：方法同1.4.1節(jié)中的步驟(4)，平行測量12次。

1.4.3現(xiàn)代參考膠料的分析檢測 分別取豬皮膠、全蛋和牛奶膠料各5 mg，實驗方法同1.4.2節(jié)，僅在步驟(1)中加5 mg現(xiàn)代參考膠料，平行測量10次。

2 結(jié)果與討論

2.1 標準曲線及線性范圍

以校正峰面積(y)和濃度(x，μg/g)繪制11種氨基酸的標準曲線，并求得相關(guān)系數(shù)和線性范圍，結(jié)果列于表1?？芍?，11種氨基酸的線性關(guān)系良好，除羥脯氨酸的穩(wěn)定性略差外，其余氨基酸標準曲線方程的相關(guān)系數(shù)均大于0.99。

表1 11種氨基酸的標準曲線方程、線性范圍及檢出限Table 1 Linear equations, linearity ranges and limits of detection of 11 amino acids

圖1 豬皮膠(a)、全蛋(b)和牛奶(c)的GC-MS總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatograms of pigskin glue (a), egg (b) and milk (c)

2.2 精密度

按照1.4.1節(jié)方法，混標進樣量11 μL(n=6)時，11種氨基酸的相對標準偏差(RSD)在2.7%～6.3%范圍內(nèi)。絲氨酸、羥脯氨酸由于分子結(jié)構(gòu)中含有羥基，不穩(wěn)定，易被氧化[19]，導致RSD>5%，其他9種氨基酸的RSD均不超過5%。

2.3 檢出限

儀器檢出限是指在規(guī)定的條件下，當儀器處于穩(wěn)定狀態(tài)時，儀器本身存在的噪音引起測量讀數(shù)的漂移和波動，其物理含義是在一定的置信范圍內(nèi)能與儀器噪音相區(qū)別的最小檢測信號對應的待測物質(zhì)的量。

根據(jù)表1中各氨基酸標準曲線方程，以截距為0的曲線方程式計算求得空白樣品中每種氨基酸濃度、標準偏差及檢出限D(zhuǎn)L，其中DL計算公式如下[20]：

式中：k為置信因子；S為空白樣品響應值的標準偏差；b為截距為0時標準曲線的斜率(也稱“儀器靈敏度”)。取k=3，置信概率為99.7%。

由表1可知，甘氨酸的檢出限最低，為0.066 μg/g；亮氨酸的檢出限最高，為0.676 μg/g。

2.4 現(xiàn)代參考膠料的分析檢測

豬皮膠、全蛋和牛奶3種現(xiàn)代參考膠料的GC-MS譜圖示于圖1。由圖可見，3種現(xiàn)代參考膠料中的11種氨基酸在該色譜條件下完全分離，峰型基本呈高斯分布，基線平穩(wěn)。由表1標準曲線方程求得10次測量的氨基酸含量歸一化結(jié)果的平均值，結(jié)果列于表2。由表2可見，3種膠料的氨基酸含量具有特征性，豬皮膠含有的羥脯氨酸是動物膠的特征標志物，可以同牛奶、全蛋相區(qū)分。

表2 現(xiàn)代參考膠料和文物樣品的氨基酸含量歸一化結(jié)果Table 2 Relative amino acid molar percentage contents of reference samples and cultural relic

2.5 文物蛋白膠料的鑒定

依據(jù)本研究建立的方法對廣西服飾金線文物樣品進行分析，結(jié)果列于表2。由表2可知，文物樣品中含有羥脯氨酸，說明膠料中含有動物膠。使用SPSS軟件對文物樣品和2.4節(jié)中現(xiàn)代參考膠料的氨基酸含量進行主成分分析(簡稱PCA)，結(jié)果表明，前兩個主成分Factor 1和Factor 2的累計貢獻率達到95.58%，說明這兩個成分可以較好地表征原數(shù)據(jù)的信息。前兩個主成分的因子得分散點圖和主成分因子載荷矩陣圖分別示于圖2和圖3。

圖2 前兩個主成分的因子得分散點圖Fig.2 Scatter scores plots of the first two factors

由圖2可知，豬皮膠、全蛋、牛奶3種現(xiàn)代參考膠料在PCA圖上各自呈明顯的聚類效應，豬皮膠位于Factor 1軸負值方向，全蛋和牛奶位于Factor 1軸正值方向，利用Factor 1的差異可將豬皮膠與全蛋、牛奶區(qū)分；全蛋和牛奶分別位于Factor 2軸的正、負值方向，利用Factor 2的差異可將全蛋與牛奶區(qū)分，實現(xiàn)3類膠料的鑒別。3類膠料產(chǎn)生這種聚類效應的原因可由圖3和表2解釋：高含量的羥脯氨酸和甘氨酸會導致向Factor 1軸負向移動，高含量的亮氨酸、谷氨酸會導致向Factor 1軸正向移動；結(jié)合表2，豬皮膠含有羥脯氨酸(9.33%)、高甘氨酸(31.74%)、低亮氨酸(4.32%)和低谷氨酸(11.19%)，全蛋、牛奶不含羥脯氨酸，含有低甘氨酸(5.58%、2.84%)、高亮氨酸(11.88%、12.58%)和高谷氨酸(18.59%、27.67%)，導致豬皮膠和全蛋、牛奶分別位于Factor 1軸的正、負方向。同理，全蛋的高絲氨酸和天冬氨酸、牛奶的高谷氨酸含量，導致兩者分別處于Factor 2軸的正負方向。根據(jù)圖2，推測文物樣品成分為動物膠和蛋類的混合膠。

圖3 主成分因子載荷矩陣圖Fig.3 Load matrix plot of principal component factor

3 結(jié)論

本研究探討了文物蛋白膠料的氣相色譜-質(zhì)譜分析方法，結(jié)果表明，現(xiàn)代參考膠料中常見的丙氨酸、甘氨酸等11種氨基酸標準曲線的線性關(guān)系良好，其中10種氨基酸曲線的相關(guān)系數(shù)大于0.99，相對標準偏差在2.7%～6.3%之間，檢出限范圍為0.066～0.676 μg/g。氣相色譜-質(zhì)譜分析結(jié)合主成分分析鑒定出廣西服飾金線文物樣品的膠料為動物膠和蛋類的混合膠。該方法適用于文物蛋白膠料的定量分析，可為GC-MS分析蛋白膠結(jié)材料提供方法參考。