閆 峻，顧 娟，馮 碩，姬瑞芳，全慶華，劉永剛

(1.核工業(yè)北京地質(zhì)研究院，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院，北京 100029；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

大青葉(Isatidis Folium)是十字花科植物菘藍(lán)的干燥葉，為臨床常用中藥，用于治療溫邪入營、高熱神昏、發(fā)斑發(fā)疹、黃疸熱痢、痄腮、喉痹、丹毒和癰腫等癥狀[1]。大青葉的化學(xué)成分主要包括吲哚類、喹唑酮類、芥子苷類、有機(jī)酸類和氨基酸類化合物等[2]，具有抗病原微生物、抗內(nèi)毒素、抗炎、增強(qiáng)免疫、解熱等藥理活性[3]，是應(yīng)用廣泛的中成藥的原料藥之一。

目前，對中藥及天然產(chǎn)物化學(xué)成分的分析主要采用溶劑分配和柱色譜法將其分離為單一化合物，然后用紅外、紫外、核磁等化學(xué)方法對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，此方法費(fèi)時(shí)，且無法對微量和痕量組分進(jìn)行分析[4]。隨著色譜、質(zhì)譜及其聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展，特別是電噴霧電離(ESI)、大氣壓化學(xué)電離(APCI)等軟電離質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，可同時(shí)完成成分分離和結(jié)構(gòu)鑒定，是目前研究中藥及天然產(chǎn)物化學(xué)成分的有效方法[5]。

現(xiàn)代研究表明[5]，自由基會(huì)損傷機(jī)體，與許多疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系。傳統(tǒng)的合成抗氧化劑雖然具有較強(qiáng)的抗氧化能力，但是長期服用會(huì)產(chǎn)生一定的毒性，甚至?xí)禄椭掳5]。大青葉具有一定的抗氧化活性，目前對大青葉的研究主要集中在不飽和脂肪酸類和多糖類成分[6-7]，較少涉及抗氧化活性成分的研究。對抗氧化活性組分進(jìn)行篩選，繼而確定其中抗氧化活性的有效成分，對大青葉的物質(zhì)基礎(chǔ)研究具有重要意義。

本研究擬采用高效液相色譜-大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜法(HPLC-APCI/MS)、高效液相色譜-電噴霧電離質(zhì)譜法(HPLC-ESI/MS)和電噴霧多級串聯(lián)質(zhì)譜法(ESI-MS2)分別分析大青葉乙酸乙酯、正丁醇和95%乙醇提取物的化學(xué)成分，同時(shí)，采用鐵離子還原能力法(FRAP)對大青葉的抗氧化活性進(jìn)行評價(jià)，并通過自由基清除法(DPPH)驗(yàn)證FRAP法的評價(jià)結(jié)果，以期為大青葉藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的制訂以及譜效關(guān)系的研究提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

Waters 2695高效液相色譜儀：美國Waters公司產(chǎn)品；Finnigan LCQ離子阱質(zhì)譜儀：美國Finnigan公司產(chǎn)品；自動(dòng)酶標(biāo)儀：奧地利CliniBio公司產(chǎn)品。

1.2 主要藥材與試劑

大青葉藥材：購于北京同仁堂長春藥店，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)王淑敏教授鑒定為十字花科植物菘藍(lán)的干燥葉；靛藍(lán)和靛玉紅對照品：中國藥品生物制品檢定所產(chǎn)品；吲哚-3-甲醛對照品：阿拉丁試劑(上海)有限公司產(chǎn)品；胞苷、腺嘌呤、尿苷、鳥苷、腺苷、苯丙氨酸、脯氨酸、精氨酸和蘋果酸對照品，以及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、2,4,6-三吡啶基三嗪、抗壞血酸：均為美國Sigma公司產(chǎn)品；甲醇和乙酸：均為色譜純，美國Fisher公司產(chǎn)品；其他試劑均為分析純。

1.3 樣品制備

稱取10 g大青葉藥材，加水煎煮2次，每次1 h，過濾，合并濾液，濃縮至適量，加入3倍量乙醇，攪勻，靜置24 h，過濾，減壓濃縮至稠膏狀，得大青葉總提取物。向大青葉總提取物中加水使之溶解，用乙酸乙酯萃取，將乙酸乙酯層減壓濃縮并干燥，得大青葉乙酸乙酯提取物；用正丁醇萃取乙酸乙酯萃取后的水相部分，將正丁醇層減壓濃縮并干燥，得大青葉正丁醇提取物；將正丁醇萃取后的水相部分干燥，然后加入95%乙醇溶解，減壓抽濾，濃縮并干燥，得大青葉95%乙醇提取物。各取0.5 g大青葉乙酸乙酯、正丁醇和95%乙醇提取物，分別置于10 mL容量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，搖勻，過0.45 μm濾膜，取濾液，待測。

1.4 儀器條件

1.4.1大青葉乙酸乙酯提取物化學(xué)成分的色譜和質(zhì)譜條件 色譜條件：色譜柱為Kromasil C18分析柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)；流動(dòng)相為0.15%乙酸/水(A)和甲醇(B)；梯度洗脫程序：0～45 min(40%～100%B)，45～60 min(100%B)；流速0.8 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測波長254 nm。質(zhì)譜條件：大氣壓化學(xué)電離源，正、負(fù)離子模式檢測；質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 000；氣化溫度450 ℃；毛細(xì)管溫度150 ℃；噴霧電壓4.0 kV；鞘氣(N2)流速0.9 L/min；輔助氣(N2)流速1.5 L/min。

1.4.2大青葉正丁醇提取物化學(xué)成分的色譜和質(zhì)譜條件 色譜條件：色譜柱為Kromasil C18分析柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)；流動(dòng)相為0.15%乙酸/水(A)和甲醇(B)；梯度洗脫程序：0～10 min(5%B)，10～20 min(5%～20%B)，20～30 min(20%～30%B)，30～50 min(30%～35%B)，50～65 min(35%～55%B)；流速0.8 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測波長265 nm。質(zhì)譜條件：電噴霧電離源，正、負(fù)離子模式檢測；質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 000；毛細(xì)管溫度250 ℃；噴霧電壓4.5 kV；鞘氣(N2)流速0.9 L/min；輔助氣(N2)流速3.0 L/min。

1.4.3大青葉95%乙醇提取物化學(xué)成分的質(zhì)譜條件 電噴霧電離源，正、負(fù)離子模式檢測；質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 000；毛細(xì)管溫度200 ℃；噴霧電壓4.5 kV；鞘氣(N2)流速0.75 L/min；將大青葉95%乙醇提取物加甲醇稀釋后，采用流動(dòng)注射泵進(jìn)樣，進(jìn)樣流速5 μL/min。

1.5 大青葉抗氧化活性研究

1.5.1鐵離子還原能力法 分別用甲醇稀釋大青葉乙酸乙酯、正丁醇和95%乙醇提取物，配制成0.1 g/L待測樣品溶液，將抗壞血酸(Vc)對照品配制成500 μmol/L甲醇溶液作為對照品溶液。將300 mmol/L醋酸鈉緩沖溶液(pH 3.6)，10 mmol/L 2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)溶液(溶解在40 mmol/L HCl中)和20 mmol/L三氯化鐵溶液，以體積比10∶1∶1混合，配制成FRAP試劑。取10 μL Vc對照品溶液或待測樣品溶液，加入96孔板中，然后迅速加入300 μL FRAP試劑，37 ℃下用自動(dòng)酶標(biāo)儀分別測定0 min和4 min Vc對照品溶液和待測樣品溶液的吸光度值，平行測定3次。FRAP法的測量結(jié)果以相當(dāng)于500 μmol Vc的抗氧化能力計(jì)算，其計(jì)算公式為：

FRAP(μmol/L)=(0 min吸光度-
4 min吸光度)/(0 min Vc吸光度-
4 min Vc吸光度)×500×2

(1)

1.5.2自由基清除能力法 將大青葉乙酸乙酯、正丁醇和95%乙醇提取物分別用甲醇稀釋，在0.001～10 g/L內(nèi)配制成10個(gè)不同濃度的待測樣品溶液。用甲醇將1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)配制成65 μmol/L的DPPH溶液。將20 μL甲醇和100 μL DPPH溶液混合為A0，20 μL不同濃度待測樣品溶液和100 μL DPPH溶液混合為Ai，20 μL不同濃度待測樣品溶液和100 μL甲醇混合為Aj。將以上3種混合溶液避光放置30 min，用自動(dòng)酶標(biāo)儀在515 nm波長下分別測定其吸光度值，每個(gè)樣品平行測定3次，計(jì)算不同濃度樣品對DPPH自由基的清除率，計(jì)算公式為：

SA(%)=[A0-(Ai-Aj)]/A0×100%

(2)

以清除率對各樣品的濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程SA=aC+b，依此可以計(jì)算出清除率為50%時(shí)的樣品濃度(C)，即為該樣品的IC50值。

2 結(jié)果與討論

2.1 大青葉各提取物的化學(xué)成分分析

大青葉乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物的總離子流圖分別示于圖1、圖2。大青葉95%乙醇提取物的一級全掃描電噴霧質(zhì)譜圖示于圖3。

大青葉乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物化學(xué)成分的LC-MS2數(shù)據(jù)及其解析、對應(yīng)的化合物分別列于表1、表2。

注：a.高效液相色譜圖；b.正離子模式；c.負(fù)離子模式圖1 大青葉乙酸乙酯提取物的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of the acetate extract from Isatidis Folium

注：a.高效液相色譜圖；b.正離子模式；c.負(fù)離子模式圖2 大青葉正丁醇提取物的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatograms of the n-BuOH extract from Isatidis Folium

注：a.正離子模式；b.負(fù)離子模式圖3 大青葉95%乙醇提取物的一級全掃描質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectra of the 95% ethanol extract from Isatidis Folium

序號(hào)No.保留時(shí)間tR/min正離子模式Positive ion mode(m/z)負(fù)離子模式Negative ion mode(m/z)二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)MS2 data化合物Compounds110.45166[M+H]+166:148[M+H-H2O]+,120[M+H-HCOOH]+N-醛基氨基苯甲酸210.98267[M+H]+267:249[M+H-H2O]+,239[M+H-CO]+,146[M+H-C6H5COOH]+3-羧基苯基喹唑酮312.91137[M-H]-137:93[M-H-CO2]-水楊酸413.40146[M+H]+146:118[M+H-CO]+3-醛基吲哚513.84239[M+H]+239:221[M+H-H2O]+,211[M+H-CO]+3-羥苯基喹唑酮615.81327[M+H]+327:201[M+H-CH3CHC(COOH)COCH2]+依靛藍(lán)酮723.63249[M+H]+249:221[M+H-CO]+色胺酮828.28263[M+H]+263:235[M+H-CO]+,219[M-H-CO2]+靛藍(lán)934.25263[M+H]+263:235[M+H-CO]+,219[M-H-CO2]+靛玉紅1037.44279[M+H]+279:223[M+H-2CO]+,205[M+H-2CO-H2O]+羥基靛玉紅1146.39277[M-H]-277:259[M-H-H2O]-,233[M-H-CO2],217[M-H-CH3COOH]-亞麻酸1259.33535[M+H]+535:507[M-H-CO]+,463[M+H-C3H4O2]+,435[M+H-C3H4O2-CO]+焦脫鎂葉綠酸a

表2 大青葉正丁醇提取物的LC-MS2數(shù)據(jù)Table 2 LC-MS2 data of the n-BuOH extract from Isatidis Folium

由圖3可知，大青葉95%乙醇提取物在正離子模式下主要有m/z104、116、130、175、180、266、337、365和381離子，在負(fù)離子模式下主要有m/z133、341和377離子。

大青葉95%乙醇提取物化學(xué)成分ESI-MS2數(shù)據(jù)及其解析、對應(yīng)的化合物列于表3。

表3 大青葉95%乙醇提取物的ESI-MS2數(shù)據(jù)Table 3 ESI-MS2 data of the 95% ethanol extract from Isatidis Folium

在正離子模式下，m/z104離子的MS2譜中有m/z86[M+H-H2O]+和m/z60[M+H-CO2]+碎片離子，根據(jù)質(zhì)譜裂解規(guī)律，結(jié)合文獻(xiàn)[13]，推斷其為γ-氨基丁酸；m/z116離子的MS2譜中有m/z70[M+H-HCOOH]+碎片離子，與脯氨酸對照品具有相同的質(zhì)譜裂解規(guī)律，確定其為脯氨酸；m/z130離子的MS2譜中有m/z113[M+H-NH3]+、m/z84[M+H-SCH2]+和m/z70[M+H-SC2H4]+碎片離子，根據(jù)質(zhì)譜裂解規(guī)律，推斷其為表告依春；m/z175離子的MS2譜中有m/z157[M+H-H2O]+、m/z140[M+H-H2O-NH3]+和m/z112[M+H-HCOOC-NH3]+碎片離子，與精氨酸對照品具有相同的裂解規(guī)律，可以確定其為精氨酸；m/z180離子的MS2譜中有m/z162[M+H-H2O]+、m/z144[M+H-2H2O]+、m/z84[M+H-2H2O-C2H4O2]+和m/z72[M+H-H2O-C3H6O3]+碎片離子，根據(jù)文獻(xiàn)[13-14]報(bào)道，確定其為氨基葡萄糖；m/z365和m/z381在一級全掃描質(zhì)譜中的質(zhì)荷比相差16，初步判斷其可能分別為蔗糖的[M+Na]+和[M+K]+峰，其中m/z365的MS2譜中有m/z203[M+Na-glc]+和m/z185[M+Na-glc-H2O]+碎片離子，m/z381的MS2譜中有m/z219[M+K-glc]+和m/z201[M+K-glc-H2O]+碎片離子，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[15-16]，確定其為蔗糖。

在負(fù)離子模式下，m/z133的MS2譜中有m/z115[M-H-H2O]-碎片離子，與蘋果酸對照品具有相同的質(zhì)譜裂解規(guī)律，同時(shí)結(jié)合文獻(xiàn)[17]報(bào)道，確定其為蘋果酸；m/z341的MS2譜中有m/z281[M-H-C2H4O2]-、m/z179[M-H-glc]-和m/z161[M-H-H2O]-碎片離子，與正離子模式下的m/z365、381離子相對應(yīng)，為蔗糖的[M-H]-峰[15-16]；m/z191的MS2譜中有m/z173[M-H-H2O]-和m/z111[M-H-2H2O-CO2]-碎片離子，與檸檬酸對照品具有相同的質(zhì)譜裂解規(guī)律，可以確定其為檸檬酸；m/z195離子在MS2中產(chǎn)生m/z177[M-H-H2O]-、m/z159[M-H-2H2O]-、m/z129[M-H-2H2O-CH2O]-和m/z99[M-H-2H2O-2CH2O]-碎片離子，根據(jù)文獻(xiàn)[13-14]報(bào)道，確定該化合物為葡萄糖醛酸。

2.2 大青葉抗氧化活性的研究

FRAP值的大小可以反映樣品對鐵離子還原能力的強(qiáng)弱，F(xiàn)RAP值越大，說明該樣品對鐵離子的還原能力越強(qiáng)，即其抗氧化活性越強(qiáng)，反之越弱。樣品的IC50值可以反映該樣品對DPPH自由基清除能力的強(qiáng)弱，IC50值越小，表明該樣品對DPPH自由基的清除能力越強(qiáng)，即其抗氧化能力越強(qiáng)，反之越弱[4,18]。大青葉乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇和總提取物的抗氧化活性結(jié)果列于表4。大青葉不同化學(xué)組分抗氧化活性強(qiáng)弱依次為：大青葉乙酸乙酯提取物>總提取物>正丁醇提取物>95%乙醇提取物。大青葉乙酸乙酯提取物的抗氧化活性最強(qiáng)，高于總提取物，表明大青葉抗氧化活性的有效成分主要集中在極性較低的化學(xué)組分中。

表4 大青葉提取物的抗氧化活性Table 4 Antioxidant activity of Isatidis Folium

3 結(jié)論

本研究采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析大青葉乙酸乙酯、正丁醇提取物的化學(xué)成分，采用電噴霧多級質(zhì)譜技術(shù)分析大青葉95%乙醇提取物的化學(xué)成分。從大青葉乙酸乙酯、正丁醇和95%乙醇提取物中共鑒別出39種化合物，其中包括6種有機(jī)酸類化合物，8種生物堿類化合物，6種核苷嘌呤類化合物，4種氨基酸類化合物，11種黃酮類化合物，2種糖類化合物，1種卟啉類化合物，1種含硫類化合物。

大青葉抗氧化活性評價(jià)結(jié)果表明，大青葉抗氧化活性成分主要集中在極性較低的化學(xué)組分中，其主要有效成分為吲哚類、喹唑酮類和有機(jī)酸類化合物，糖類和氨基酸類化合物的抗氧化活性較弱。本研究結(jié)果可為大青葉藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的制訂和譜效關(guān)系的研究提供理論依據(jù)。