徐久翔，郭斯宇，錢衍霓，孫 珍

(大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034)

啤酒是一種微生物穩(wěn)定的飲料，但在啤酒生產(chǎn)過程中，不可避免地會發(fā)生微生物污染，從而對啤酒的生產(chǎn)和安全構(gòu)成威脅[1]。啤酒釀造過程中需要加入酒花，其可以賦予啤酒特定的苦味[2]，同時酒花苦味物質(zhì)能夠通過破壞細(xì)胞跨膜pH梯度抑制微生物生長[3]。研究表明[4-6]，酒花抗性菌株有多種機(jī)制來抵抗酒花對其產(chǎn)生的危害：細(xì)胞可以通過增加多藥物抗性基因(HorA)的表達(dá)量將胞內(nèi)積累的酒花苦味酸或其他毒性分子由胞內(nèi)排出細(xì)胞外；也可以通過增加質(zhì)子轉(zhuǎn)運H+-ATPase酶的表達(dá)量，以排出質(zhì)子來抵消酒花苦味酸的質(zhì)子轉(zhuǎn)運作用；還可以通過改變細(xì)胞壁上的半乳糖苷基甘油磷壁酸以及細(xì)胞膜的膜脂組分，增加細(xì)胞壁對酒花苦味酸的過膜障礙，從而造成啤酒腐敗。

蛋白質(zhì)組學(xué)是20世紀(jì)末發(fā)展起來的一項基于質(zhì)譜對蛋白質(zhì)進(jìn)行研究的新興技術(shù)[7]，該技術(shù)能夠在高通量水平上研究蛋白質(zhì)的特征，包括蛋白的表達(dá)水平、結(jié)構(gòu)、豐度變化、翻譯后修飾等，對蛋白質(zhì)的功能做出更精細(xì)和準(zhǔn)確的闡述，由此獲得蛋白質(zhì)水平上關(guān)于疾病發(fā)生、細(xì)胞代謝等過程的整體、全面的認(rèn)識[8]。使用質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)具有靈敏、快速、重復(fù)性好、自動化程度高等特點[9]。質(zhì)譜技術(shù)不是直接分析完整的蛋白分子，而是將蛋白質(zhì)經(jīng)過特異的蛋白酶(胰蛋白酶、糜蛋白酶等)水解，得到肽段混合物進(jìn)行質(zhì)譜分析[10]。蛋白質(zhì)酶解過程是否充分、酶解產(chǎn)生的肽段分子質(zhì)量是否能落在質(zhì)譜掃描范圍內(nèi)，直接決定了蛋白質(zhì)能否被鑒定到。因此，除了常規(guī)使用的胰蛋白酶，其他種類的蛋白酶(如糜蛋白酶)也可以被用來酶解蛋白質(zhì)。胰蛋白酶可以特異性地切割堿性氨基酸殘基(賴氨酸Lys和精氨酸Arg)的羧基末端，糜蛋白酶主要切割芳香族氨基酸殘基(酪氨酸Tyr，色氨酸Trp，苯丙氨酸Phe)和亮氨酸Leu的羧基末端。糜蛋白酶與胰蛋白酶的切割位點具有高度互補性，所以可以預(yù)計，在僅使用胰蛋白酶酶切時許多不能被鑒定到的蛋白質(zhì)，在使用糜蛋白酶等其他蛋白酶酶解后有可能被鑒定到[11-12]。

短乳桿菌49(Lactobacillusbrevis49)是本實驗室從腐敗啤酒中分離得到的酒花抗性菌株[13]，希望通過利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對L.brevis49的蛋白質(zhì)組成進(jìn)行研究來獲取更多的酒花抗性相關(guān)信息。L.brevis49的蛋白質(zhì)組成包括菌體內(nèi)的蛋白質(zhì)(胞內(nèi)蛋白)以及分泌到培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)(胞外蛋白)兩部分。在細(xì)胞中，胞外分泌蛋白合成于與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合的核糖體上，核糖體合成出的多肽在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中翻譯后修飾，最后被轉(zhuǎn)運到細(xì)胞外[14]。胞外分泌蛋白在細(xì)胞生長、信號傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡等生命過程中起著至關(guān)重要的作用[15]。信號肽位于分泌蛋白的N端，能有效地引導(dǎo)新生肽穿越原核生物的質(zhì)膜或真核生物的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，對于分泌蛋白的分泌起主導(dǎo)作用。但是，胞外蛋白提取面臨著蛋白含量低、蛋白沉淀中雜質(zhì)多、樣品易被修飾等分析難題[16]。對于胞內(nèi)蛋白，因為需要破碎細(xì)菌細(xì)胞壁才能提取胞內(nèi)蛋白，而L.brevis49菌體小壁厚，所以存在著破碎困難、蛋白提取不完全等分析難題。

為了更大程度地獲取L.brevis49的蛋白質(zhì)信息，需要優(yōu)化蛋白質(zhì)的提取條件與酶解條件。本實驗中，將同時對胞內(nèi)蛋白提取方法與酶解方法進(jìn)行優(yōu)化，采用正交實驗法考察破碎方法、蛋白酶種類、加酶量和酶解時間等4個影響因素，以質(zhì)譜中檢測到的蛋白質(zhì)數(shù)目為參考指標(biāo)，確定最佳的實驗條件。通過優(yōu)化培養(yǎng)基中氮源的使用，減少培養(yǎng)基中多種氮源對胞外蛋白檢測的影響。最后，通過比較超濾法、冷丙酮法、平衡酚-丙酮法以及TCA(三氯乙酸)法等，確定最佳的胞外蛋白提取方法。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

1.1.1主要儀器與裝置 Q ExactiveTM組合型四極桿Orbitrap質(zhì)譜儀：美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品；Ultimate 3000 RSLC nano System：美國戴安公司產(chǎn)品；C18固相微萃取柱：美國Waters公司產(chǎn)品；C18 PepMap 100反相預(yù)柱、Acclaim PepMapTMRSLC反相分析柱：美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品；Millipore超純水處理系統(tǒng)：美國Millipore公司產(chǎn)品。

1.1.2主要材料與試劑 菌種：短乳桿菌49(Lactobacillusbrevis49)，由大連工業(yè)大學(xué)微生物資源與生物催化實驗室保存。

Trypsin(來源于牛胰腺，不小于10 000 BAEE單位/毫克蛋白)、Chymotrypsin(來源于牛胰腺，不小于40 單位/毫克蛋白)：美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；超濾管：美國Millipore公司產(chǎn)品；BCA蛋白濃度測定試劑盒：中國碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；低背景銀染試劑盒：中國生工生物工程有限公司產(chǎn)品。

乙腈、甲醇、超純水：均為色譜純，美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品；甲酸：質(zhì)譜純，美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；尿素、三羥甲基氨基甲烷(Tris)：中國生工生物工程有限公司產(chǎn)品；二硫蘇糖醇(DTT)、碘代乙酰胺：美國Sigma公司產(chǎn)品；其他未特殊提到的試劑皆為分析純。

1.2 培養(yǎng)基

采用MRS培養(yǎng)基提取胞內(nèi)蛋白，包含0.4%酵母浸膏、0.5%D-麥芽糖、1%蛋白胨、0.8%牛肉膏、2%無水葡萄糖、0.5%無水乙酸鈉、0.1%吐溫-80、0.2%磷酸氫二鉀、0.2%檸檬酸三銨、0.02%硫酸鎂、0.005%硫酸錳和水。

1.3 胞內(nèi)蛋白的提取

將培養(yǎng)到對數(shù)生長中期的菌株在6 000 r/min條件下離心10 min，取沉淀的菌體，用milli-Q水洗2遍，再使用相同體積的緩沖溶液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)洗2遍，凍干得到菌體干粉，-80 ℃冷凍保存。

1.4 胞外蛋白的提取

將培養(yǎng)到對數(shù)生長中期的菌株在6 000 r/min條件下離心10 min，取上清發(fā)酵液過0.22 μm膜，相同體積分裝4份。

1.4.1TCA-丙酮沉淀法提取蛋白 向發(fā)酵液中加入1/10樣品體積的100%TCA，置于冰上30 min，然后在4 ℃下以10 000 r/min離心 10 min，去除上清液；再加入1/10樣品體積的丙酮，混勻后在4 ℃下以10 000 r/min離心5 min，洗滌2次后從沉淀中去除丙酮，風(fēng)干沉淀60 min；最后加入適量的緩沖溶液(8 mol/L尿素，50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)溶解沉淀，于-80 ℃保存。

1.4.2冷丙酮沉淀法提取蛋白 向發(fā)酵液中加入冷丙酮(發(fā)酵液∶冷丙酮=1∶4,V/V)，混勻，于-20 ℃過夜，次日在4 ℃下以10 000 r/min離心10 min后棄去上清液，沉淀自然風(fēng)干，加入適量的緩沖溶液(8 mol/L尿素，50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)溶解，于-80 ℃保存。

1.4.3超濾沉淀法提取蛋白 將發(fā)酵液加入截留分子質(zhì)量10 kDa的超濾管中，在4 ℃下以10 000 r/min離心至超濾管中液面不再下降，再加入適量的緩沖溶液(8 mol/L尿素，50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)繼續(xù)離心直至液面不再下降，取出內(nèi)管中的溶液，于-80 ℃保存。

1.4.4平衡酚-丙酮沉淀法提取蛋白 將發(fā)酵液加入相同體積的Tris-平衡酚，置于冰上30 min，并每隔10 min取出振蕩搖勻，然后在4 ℃下以10 000 r/min離心10 min，取出上層酚相及中間層后，加入3倍體積的乙酸銨-甲醇(100 mmol/L)，于-20 ℃過夜。次日，以10 000 r/min離心10 min后棄去上清液，將沉淀用含0.1% DTT的冷丙酮離心，然后用冷丙酮清洗，得到的蛋白樣品自然風(fēng)干，加入適量緩沖溶液(8 mol/L尿素，50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)溶解，于-80 ℃保存[17]。

1.5 總蛋白濃度的測定

采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定總蛋白濃度，具體實驗步驟按說明書進(jìn)行操作。

1.6 SDS-PAGE電泳

配制12%分離膠和5%濃縮膠，上樣量10 μL，設(shè)置電壓170 V，電流20 mA。直至溴酚藍(lán)移動到膠條的最底端，用低背景銀染試劑盒進(jìn)行染色。

1.7 質(zhì)譜樣品的制備

將50 g蛋白質(zhì)溶液復(fù)溶在8 mol/L尿素+50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)中，然后用10 mmol/L二硫蘇糖醇在37 ℃下還原1 h，并在室溫避光環(huán)境下用20 mmol/L碘代乙酰胺烷基化40 min。然后將溶液中尿素濃度稀釋到1 mol/L，加入一定比例的蛋白酶，37 ℃孵育得到肽段。酶解反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)C18固相微萃取柱除鹽，真空濃縮儀旋轉(zhuǎn)蒸干后，將蒸干的肽段溶解在0.1%甲酸中。

1.8 實驗條件

1.8.1色譜條件 復(fù)溶后的肽段樣品經(jīng)Ultimate 3000 RSLC nano System上樣加載到C18 PepMap100反相預(yù)柱上，使用Acclaim PepMapTMRSLC反相分析柱進(jìn)行肽分離，流動相組成分別為0.1%甲酸溶液(A相)和80%乙腈-20%H2O-0.1%甲酸溶液(B相)，流速0.2 μL/min。線性洗脫程序：0～10 min(4%B)，10～13 min(4%～10%B)，13～35 min(10%～35%B)，35～41 min(35%～55%B)，41～42 min(55%～95%B)，42～52 min(95%B)，52～53 min(95%～4%B)，53～70 min(4%B)。

1.8.2質(zhì)譜條件 樣品通過nanoESI源離子化，在Q Exactive中進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析(MS/MS)。Orbitrap檢測完整肽段的分辨率設(shè)為70 000；使用27%標(biāo)準(zhǔn)化碰撞能量對選定的肽段進(jìn)行MS/MS分析；Orbitrap檢測離子碎片的分辨率設(shè)為17 500。選取高于閾值離子計數(shù)3×106的前15個母離子在一級MS全掃描之后進(jìn)行MS/MS分析，動態(tài)排除設(shè)為 30.0 s，施加的噴霧電壓為2.5 kV，MS/MS的自動增益控制(AGC)設(shè)為1×105，一級質(zhì)譜掃描范圍為m/z350～1 800。使用Proteome Discoverer 2.2.0.388處理得到的MS/MS數(shù)據(jù)，肽段的假陽性鑒定率設(shè)為小于1%。根據(jù)實際使用的酶設(shè)定切割位點，允許2個漏切位點。前體離子的質(zhì)量誤差設(shè)定為1×10-5，碎片離子的質(zhì)量誤差設(shè)定為0.02 Da。動態(tài)修飾設(shè)為甲硫氨酸上+15.995 Da的Oxidation修飾，靜態(tài)修飾設(shè)為半胱氨酸上+57.021 Da的Carbamidomethyl修飾。

2 結(jié)果與討論

對培養(yǎng)基氮源和胞外蛋白提取工藝進(jìn)行優(yōu)化；采用正交實驗法考察破壁方法、蛋白酶、酶解時間及酶用量4個因素對胞內(nèi)蛋白的提取條件，具體的實驗流程及結(jié)果示于圖1。

2.1 L. brevis 49胞內(nèi)蛋白提取及含量測定

通過超聲破碎、液氮研磨和溶菌酶3種破壁方法獲得的短乳桿菌胞內(nèi)蛋白，經(jīng)BCA蛋白定量法測定的結(jié)果列于表1。結(jié)果表明，處理相同質(zhì)量的菌體干粉，超聲破碎法提取胞內(nèi)蛋白的效率較高。因桿菌體積小，液氮研磨和溶菌酶法破碎過程較為困難，所以提取效果較差。

單向電泳結(jié)果表明：樣品溶液通過SDS-PAGE電泳顯示較明顯，3種破壁方法所得蛋白條帶均較清晰，其中超聲破碎法提取的蛋白條帶顏色較深，L.brevis49胞內(nèi)蛋白的分子質(zhì)量分布較廣，主要集中在20.1～66.4 kDa之間，低于20.1 kDa的蛋白較少，示于圖2。

2.2 正交實驗結(jié)果

由于破壁方法、蛋白酶、酶解時間、酶用量是影響蛋白提取和水解的主要因素，因此以4因素3水平安排正交表L9(34)。破壁方法：a1=超聲破碎，a2=液氮研磨，a3=溶菌酶法；蛋白酶：b1=胰蛋白酶，b2=糜蛋白酶，b3=胰蛋白酶+糜蛋白酶；酶用量(酶與蛋白質(zhì)量比)：c1=1∶40，c2=1∶50，c3=1∶60；酶解時間：d1=12 h，d2=16 h，d3=20 h。每組實驗中處理相同量的蛋白，結(jié)果和極差分析列于表2。

表2中的極差分析結(jié)果顯示，在影響胞內(nèi)蛋白酶解的4個主要因素中，蛋白酶的影響最為顯著，破壁方法、酶解時間和酶用量次之。

圖1 實驗流程圖Fig.1 Experimental flow chart

表1 不同破壁方法處理得到的蛋白濃度Table 1 Protein concentration obtained by different disruption methods

注：M.低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)標(biāo)記物；1.溶菌酶法；2.液氮研磨法；3.超聲破碎法 圖2 胞內(nèi)蛋白SDS-PAGE電泳分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of intracellular protein

表2 正交實驗分析結(jié)果Table 2 Analysis results of orthogonal test

注：K1，K2，K3為每個因素各水平下的指標(biāo)總和；Rj為每個因素的極差值

當(dāng)使用兩種酶組合作用時，在酶解時間較短的情況下即可達(dá)到較好的酶解效果。選取3種蛋白，分別經(jīng)過不同條件的酶解后得到的肽段有很大差異，兩種酶共同作用可以得到更大的覆蓋率，如SZ_GM000147蛋白覆蓋率提高了2.4倍，SZ_GM000224蛋白提高了2.7倍，而SZ_GM002491蛋白提高了近10倍。這可能是由于單一酶作用的切割位點單一，造成個別肽段過長、質(zhì)荷比偏大，超過檢測范圍，利用胰蛋白酶和糜蛋白酶互補的性質(zhì)對蛋白共同切割，能夠使更多的肽段落在檢測范圍內(nèi)，結(jié)果列于表3。結(jié)合表1中的結(jié)果，超聲破碎法提取的胞內(nèi)蛋白濃度最高。這4個因素的最優(yōu)組合為：破壁方法為超聲破碎法，蛋白酶為胰蛋白酶和糜蛋白酶組合使用，酶用量為1∶50，酶解時間為12 h。

2.3 培養(yǎng)基氮源成分優(yōu)化

在質(zhì)譜分析時，培養(yǎng)基中的氮源會影響胞外蛋白的檢測，因此本實驗對培養(yǎng)基氮源進(jìn)行了優(yōu)化。在MRS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，固定其他成分不變，采用不同的氮源分別作為MRS中唯一的氮源配制培養(yǎng)基接種培養(yǎng)，根據(jù)菌體生長情況對其最優(yōu)氮源進(jìn)行篩選。本實驗以MRS中酵母浸粉、牛肉膏和蛋白胨3種氮源分別按1%和0.8%加入培養(yǎng)基中，接入相同量的種子液，在30 ℃搖床中培養(yǎng)，測得的生長曲線示于圖3a。由圖3a可知，酵母浸粉作為培養(yǎng)基唯一的有機(jī)氮源時，L.brevis49可以更好地生長，并在12 h進(jìn)入對數(shù)期，在36 h時OD600可以達(dá)到2.0以上；牛肉膏和蛋白胨作為氮源時，L.brevis49生長趨勢較差，且無法呈對數(shù)生長。因為胞外蛋白提取面臨諸多困難，在保證菌株較好生長的前提下，才能提取足夠多的胞外蛋白，所以選用酵母浸粉作為培養(yǎng)基中的唯一氮源。將酵母浸粉按1%、0.8%、0.6%、0.4%和0.2%加入無氮源MRS中培養(yǎng)48 h，對比不同酵母浸粉添加比例的培養(yǎng)基中L.brevis49的生長情況，結(jié)果示于圖3b。含0.6%及以上的酵母浸粉培養(yǎng)基中L.brevis49的OD600均可以達(dá)到 1.7以上。為了降低培養(yǎng)基中氮源對胞外蛋白檢測的干擾，選用0.6%酵母浸粉作為培養(yǎng)基中的單一氮源。

表3 不同酶切方法得到的蛋白肽段信息Table 3 Information of digested peptides of three proteins by different enzyme digestion methods

注：a.3種不同氮源培養(yǎng)基(蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏)；b.不同的酵母浸粉添加量圖3 利用不同氮源培養(yǎng)的L. brevis 49生長曲線Fig.3 L. brevis 49 growth curves cultured with different nitrogen sources

2.4 培養(yǎng)過程中胞外蛋白濃度與生長曲線的關(guān)系

將活化的L.brevis49接入含0.6%酵母浸粉的改良MRS培養(yǎng)基中，每隔12 h用分光光度計測菌濃，同時測培養(yǎng)基中的蛋白濃度，結(jié)果示于圖4。經(jīng)過活化培養(yǎng)后的L.brevis49接種到改良后的MRS培養(yǎng)基中，在36 h菌株處于對數(shù)中期，代謝旺盛，胞外蛋白一直處于分泌狀態(tài)且含量較高。而穩(wěn)定后期至衰亡期，菌體細(xì)胞逐漸老化并出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，會將胞內(nèi)蛋白釋放到培養(yǎng)液中，干擾胞外蛋白的提取。因此，為了提取更多種類的乳桿菌胞外蛋白，選取36 h作為L.brevis49菌胞外蛋白提取時間。

圖4 生長曲線與胞外蛋白濃度的關(guān)系圖Fig.4 Relationship between growth curve and extracellular protein concentration

2.5 信號肽分析

本實驗分別采用超濾法、冷丙酮法、平衡酚-丙酮法以及TCA法等蛋白質(zhì)提取方法處理相同體積的發(fā)酵液，其中TCA法的提取效率較高，蛋白組數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他提取方法。對提取到的蛋白經(jīng)SignalIP 4.1分析，TCA法提取的蛋白中44個有信號肽剪切位點，屬于分泌蛋白；冷丙酮法提取的蛋白中25個有信號肽剪切位點；超濾法和飽和平衡酚法提取的蛋白中分別僅有9個和4個信號肽剪切位點，結(jié)果列于表4。在實驗過程中，冷丙酮法和超濾法得到的蛋白顏色較深且粘稠，可能是由于培養(yǎng)液中含有的多肽、有機(jī)提取物以及色素等復(fù)雜組分大量沉淀下來，影響蛋白濃度的測定。TCA法和平衡酚法得到的蛋白受到的影響較小。

表4 不同提取方法得到的蛋白質(zhì)信號肽分析Table 4 Signal peptide analysis of proteins obtained by different extraction methods

在含信號肽的蛋白中，有4個蛋白均可由4種提取方法提取并鑒定，分別是SZ_GM001307、SZ_GM000172、SZ_GM000166、SZ_GM000887。對于同一蛋白而言，利用TCA法得到的肽段數(shù)目最多，結(jié)果列于表5。在TCA法得到的蛋白樣品中，含有更多該蛋白的肽段，推測TCA法在得到更多種類蛋白的同時，對同一種蛋白可以得到的蛋白含量也會更多，從而能夠檢測到更多的肽段。

AGGLTTDTPAATATDNNSVTIK為蛋白質(zhì)SZ_GM001307的肽段，使用TCA法和平衡酚-丙酮法處理得到該肽段的二級質(zhì)譜圖示于圖5。N端二級碎片離子b+與C端二級碎片離子y+的數(shù)量和含量均關(guān)系到譜圖質(zhì)量的好壞以及后續(xù)肽段的鑒定。圖5a中b+和y+的數(shù)量均明顯多于圖5b。因此，TCA法處理得到的蛋白質(zhì)肽段數(shù)量更多，從而提高了蛋白質(zhì)的覆蓋率，對于低豐度的蛋白質(zhì)，將有更大的概率被檢測到。

3 結(jié)果

本研究以水解后經(jīng)LC-MS/MS分析得到的蛋白組數(shù)為依據(jù)來確定最佳的酶解條件。實驗結(jié)果表明：提取L.brevis49胞內(nèi)蛋白最佳的破壁方法為超聲破碎法，胞內(nèi)蛋白的最佳水解酶為糜蛋白酶和胰蛋白酶共同作用，最佳添加比例為1∶50，最佳酶解時間為12 h。

提取L.brevis49胞外蛋白對培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，在改良后的MRS培養(yǎng)基中加入0.6%酵母浸粉作為單一氮源可以保證菌株正常生長，并盡可能地降低培養(yǎng)基中氮源對胞外蛋白檢測的干擾。TCA法提取所得蛋白較純，且較低豐度的蛋白也可以被保留，與 LC-MS/MS結(jié)合檢測蛋白和信號肽，效率較高，適于乳桿菌胞外蛋白提取。希望該方法可為啤酒的安全檢測和鑒定提供參考。

在后續(xù)的工作中，將選擇敏感株作為對照組，用優(yōu)化的方法提取敏感株和酒花抗性株菌的胞內(nèi)蛋白及胞外蛋白，比較蛋白質(zhì)組成差異。由于胞內(nèi)蛋白和胞外蛋白有協(xié)同作用，預(yù)計抗性株細(xì)胞的酒花抗性與胞內(nèi)蛋白和胞外蛋白均有關(guān)，所以提取胞外蛋白和胞內(nèi)蛋白的效率至關(guān)重要。

表5 不同提取方法得到的含信號肽蛋白的鑒定肽段數(shù)目Table 5 Number of identified peptides of signal peptide-containing protein obtained by different extraction methods

注：a.TCA法；b.平衡酚-丙酮法圖5 肽段AGGLTTDTPAATATDNNSVTIK的二級質(zhì)譜圖Fig.5 MS/MS spectra of AGGLTTDTPAATATDNNSVTIK