朱靜，楊慶嶺，孫瑩璞

哺乳動物卵巢是由黃體及處于不同發(fā)育階段的各級卵泡組成的異質(zhì)性器官。胎兒期卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞逐漸停止有絲分裂，進(jìn)入第一次減數(shù)分裂并靜止在雙線期，雙線期的卵母細(xì)胞被單層扁平前顆粒細(xì)胞（primordial follicle granulosa cells，pfGCs）包圍形成原始卵泡[1]，構(gòu)成女性基本生殖單位，原始卵泡庫的大小一定程度上決定了個體的生育年限[2]。妊娠20周時胎兒原始卵泡的數(shù)目峰值可達(dá)六百萬至七百萬，此后逐漸下降，出生后卵巢中原始卵泡不到一百萬[3]。性成熟后，在下丘腦－垂體－卵巢軸的影響下，體內(nèi)性激素水平發(fā)生改變，部分處在靜止期的原始卵泡被募集，伴隨著pfGCs的增殖分化卵母細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)育，最終形成卵丘細(xì)胞－卵母細(xì)胞復(fù)合體并完成排卵。成年女性每個月經(jīng)周期約有1 000個卵泡被募集，但只有極少數(shù)卵泡能夠完成排卵，絕大多數(shù)在發(fā)育過程中閉鎖[4]。

1 哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）的生物學(xué)功能

mTOR是由mTOR基因編碼的非特異性絲/蘇氨酸激酶。在哺乳動物細(xì)胞中，mTOR分子與其他亞基結(jié)合形成mTOR復(fù)合體（mTORC）發(fā)揮其功能。mTOR所結(jié)合的亞基有mTORC1和mTORC2兩種形式。mTORC1由核心亞基mTOR、Raptor、mLST8及非核心亞基PRAS40、DEPTOR、Tel2共6個亞單位組成。mTORC1的活性主要受受體酪氨酸激酶（receptor tyrosinekinase，RTKs）信號通路調(diào)節(jié)。胰島素樣生長因子（insulin-like growth factors，IGF）作用于細(xì)胞膜表面RTKs，激活其下游蛋白激酶B（protein kinases B，PKB/AKT）， 使 結(jié) 節(jié) 硬 化 復(fù) 合 物 2（tuberous sclerosiscomplex 2，TSC2） 磷酸化并與TSC1分離，解除異二聚體復(fù)合物TSC1/TSC2對mTORC1的抑制，激活mTORC1。此外，IGF1也可通過絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路解除TSC1/TSC2復(fù)合物對mTORC1的抑制。磷酸化的mTORC1作用于其下游分子40S核糖體S6蛋白激酶1（S6K1）及真核啟動因子4E結(jié)合蛋白1（eukaryotic initiation factor 4Ebinding protein 1，4E-BP1），激活細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，促進(jìn)細(xì)胞生長發(fā)育[5]。mTORC2除含有mTOR、mLST8、DEPTOR和Tel2 4個亞基外，還含有mSin1和RicTOR 2個亞單位。一般認(rèn)為mTORC2是雷帕霉素非敏感性受體，雷帕霉素的瞬時暴露不會引起mTORC2的激活及AKT磷酸化水平的增加，但長時間暴露于雷帕霉素可引起腫瘤組織及一些正常組織中mTORC2活性增加。mTORC2主要通過調(diào)節(jié)纖維性肌動蛋白（F-actin）的組裝與極化影響細(xì)胞骨架的形成，從而發(fā)揮其生物學(xué)效能[6]。mTORC2也受IGFⅠ受體（IGF-ⅠR）、胰島素受體（insulin receptor，InsR）、AKT以及血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)蛋白激酶1（serum-and glucocorticoid-induced protein kinase-1，SGK-1）的調(diào)節(jié)，影響細(xì)胞增殖及新陳代謝[7]。

目前對哺乳動物卵巢mTOR分子的研究主要集中在mTORC1及其下游分子與原始卵泡激活之間的關(guān)系，以及其對女性生育力保護(hù)的臨床意義。

2 mTOR分子與原始卵泡激活

包圍卵泡的pfGCs轉(zhuǎn)化為單層柱狀顆粒細(xì)胞是原始卵泡激活的形態(tài)學(xué)標(biāo)志，原始卵泡的激活是一個漸進(jìn)過程，大多數(shù)卵母細(xì)胞保持靜息狀態(tài)，僅少數(shù)卵泡被激活，繼續(xù)發(fā)育完成排卵[4]。在遺傳或環(huán)境因素影響下，原始卵泡可過度激活，引起原始卵泡庫過早耗竭，導(dǎo)致卵巢儲備能力下降，女性生育年限縮短[8]。人類卵巢組織的全基因組關(guān)聯(lián)性研究表明，卵巢功能不全與多種基因突變有相關(guān)性[9]。因此尋找靜止期卵泡激活的分子機(jī)制并改善其過度激活是保護(hù)女性生育力的重要途徑。同時有研究證明，對于卵巢儲備能力較低（如卵巢功能不全）的患者，體外應(yīng)用激活劑誘導(dǎo)靜止期卵母細(xì)胞及前顆粒細(xì)胞激活后將卵巢組織自體移植，可以增加患者獲卵數(shù)，改善輔助生殖治療結(jié)局[10-11]。

人卵巢組織差異基因表達(dá)分析顯示，在原始卵泡向初級卵泡轉(zhuǎn)化過程中卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞mTOR信號通路表達(dá)均上調(diào)，提示原始卵泡激活與mTOR信號網(wǎng)絡(luò)存在相關(guān)性[12-13]。對嚙齒類動物的研究顯示，mTOR分子在原始卵泡靜止期卵母細(xì)胞的發(fā)育及前顆粒細(xì)胞的增生中起重要作用[14-16]。研究表明，無論是年齡增長引起的卵巢儲備功能下降或是化療藥物導(dǎo)致的卵巢功能不全，應(yīng)用mTOR抑制劑雷帕霉素均能抑制原始卵泡的激活，延長小鼠生育年限[17-19]。并且，體內(nèi)應(yīng)用雷帕霉素能夠改善小鼠卵子質(zhì)量及卵巢微環(huán)境[20]。相反，mTOR激活劑的使用，在體內(nèi)外均能夠顯著增加小鼠原始卵泡向初級卵泡轉(zhuǎn)化[21]。2013年Kawamura等[10]將原發(fā)性卵巢功能不全（primary ovarian insufficiency，POI）患者的卵巢組織在體外添加AKT激活劑培養(yǎng)后，自體移植入患者體內(nèi)，經(jīng)過促排卵獲得了成熟卵子。研究發(fā)現(xiàn)，激活前顆粒細(xì)胞中mTOR通路能夠啟動原始卵泡激活，在卵巢組織體外激活過程中，輔助添加mTOR激活劑可能對增加POI患者的獲卵數(shù)、改善輔助生殖助孕結(jié)局具有積極意義[16]。此外，聯(lián)合應(yīng)用磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）和mTOR激活劑對卵巢早衰患者卵泡的激活具有協(xié)同效應(yīng)[22]。

卵母細(xì)胞或pfGCs中mTOR的異常表達(dá)均可破壞卵泡的周期性募集，導(dǎo)致原始卵泡池過早耗竭，對女性的生育力造成不可逆的損傷。因此，探索靜止期卵泡激活的分子機(jī)制對于女性生育力的保護(hù)以及不孕患者的臨床治療均具有重要意義。

3 mTOR與卵母細(xì)胞發(fā)育

具有絲/蘇氨酸蛋白激酶活性的PI3K及下游分子AKT是靜止期卵母細(xì)胞激活的經(jīng)典信號分子，通過影響其龐雜的下游信號網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)靜止期卵母細(xì)胞活化。第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（phosphataseand tensin homologue deleted on chromosome 10，PTEN）編碼的蛋白具有磷酸酶和磷脂酰肌醇磷酸酶特異性雙重催化作用。PTEN可使磷脂酰肌醇3磷酸[PtdIns（3，4，5）P3]去磷酸化轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇2磷酸[PtdI ns（4，5）P2]，對PI3K/AKT信號通路產(chǎn)生負(fù)調(diào)節(jié)作用[23]。

為進(jìn)一步明確靜止期卵母細(xì)胞激活的分子機(jī)制，Reddy等[24]利用Cre/loxP重組酶系統(tǒng)，將PTENloxP/loxP小鼠與表達(dá)生長分化因子9（growth differentiation factor 9，Gdf-9）啟動子介導(dǎo)的重組酶Cre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，篩選獲得卵母細(xì)胞中特異性敲除PTEN基因的小鼠（PTENloxP/loxP;GCre+）。觀察發(fā)現(xiàn)出生后5 d（PD5）及35 d（PD35）PTENloxP/loxP;GCre+小鼠卵巢體積及卵巢內(nèi)初級卵泡數(shù)量較PTENloxP/loxP小鼠明顯增加，提示原始卵泡庫中大量卵泡被激活。由于原始卵泡庫過早耗竭，12周齡時，PTENloxP/loxP;GCre+小鼠喪失生育能力，血清中卵泡刺激素（FSH）及黃體生成激素（LH）水平較PTENloxP/loxP小鼠顯著升高，出現(xiàn)卵巢早衰表型；至16周齡時，與PTENloxP/loxP小鼠相比，PTENloxP/loxP;GCre+小鼠提前出現(xiàn)卵巢萎縮、退化，正常組織形態(tài)消失。分別分析PD5及PD12～14 PTENloxP/loxP;GCre+小鼠卵巢組織蛋白表達(dá)情況顯示，在原始卵泡被廣泛激活的時期，卵巢中mTOR及其下游分子S6K1、rPS6磷酸化水平明顯上調(diào)，提示mTOR在原始卵泡庫的維持及激活過程中發(fā)揮一定作用。

異二聚體復(fù)合物TSC1/TSC2是mTORC1信號通路的上游抑制因子。研究發(fā)現(xiàn)，條件性敲除小鼠卵母細(xì)胞中的TSC1或TSC2基因，解除TSC1/TSC2對mTORC1的上游抑制作用后，小鼠在12～13周齡時即喪失生育能力，16周齡時卵巢已發(fā)生萎縮、退化，而對照組小鼠出生后27周仍保有生育能力[14-15]。不同發(fā)育階段人卵泡液差異基因表達(dá)分析也證實，在原始卵泡激活過程中卵母細(xì)胞內(nèi)mTOR基因表達(dá)上調(diào)[12]。近期有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，原始卵泡中的卵母細(xì)胞并非處于完全“休眠”狀態(tài)，其mTOR信號網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)表達(dá)活躍，由于卵巢中卵母細(xì)胞的發(fā)育階段不同，僅將原始卵泡中靜止期卵母細(xì)胞mTOR基因特異性敲除后可導(dǎo)致卵子質(zhì)量異常甚至不孕；而生長期卵母細(xì)胞mTOR基因缺失僅導(dǎo)致生殖細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程異常，卵子受精及早期胚胎發(fā)育潛能降低，表明靜止期卵母細(xì)胞中mTOR信號通路在女性不孕的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[25]。

4 mTOR與顆粒細(xì)胞激活

原始卵泡激活早期，pfGCs增殖分化并完成形態(tài)和數(shù)量變化。pfGCs與卵母細(xì)胞的胞間信息交流對原始卵泡激活十分重要[26]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在小鼠初級卵泡顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中添加mTOR抑制劑后，顆粒細(xì)胞的增殖率呈劑量依賴性下降；且雷帕霉素處理后停滯在有絲分裂G1期的顆粒細(xì)胞比例也呈劑量依賴性增加，僅小部分顆粒細(xì)胞進(jìn)入分裂期，且細(xì)胞分裂異常，抑制顆粒細(xì)胞活化[27-28]。而將小鼠卵巢顆粒細(xì)胞中TSC1基因特異性敲除后，顆粒細(xì)胞內(nèi)mTOR及其下游分子rPS6磷酸化水平增加，初級卵泡及排卵數(shù)增加，提示顆粒細(xì)胞內(nèi)mTOR信號通路的過度激活與原始卵泡的激活密切相關(guān)[29]。利用Cre/loxP重組酶系統(tǒng)特異性切除編碼小鼠原始卵泡pfGCs中mTORC1的Raptor亞基基因后，mTORC1信號通路被抑制，卵泡激活水平顯著降低。而特異性敲除前顆粒細(xì)胞TSC1基因后，mTORC1信號通路迅速激活，并伴有大量初級卵泡形成，表明mTOR分子在原始卵泡庫維持中起重要作用[16]。有學(xué)者對人卵巢原始卵泡及初級卵泡的顆粒細(xì)胞進(jìn)行基因差異表達(dá)分析后發(fā)現(xiàn)，在原始卵泡向初級卵泡轉(zhuǎn)化過程中，包括mTOR基因在內(nèi)的294種基因片段表達(dá)上調(diào)[13]。

5 結(jié)語

綜上所述，mTOR信號網(wǎng)絡(luò)與卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞激活密切相關(guān)，可從多方面調(diào)節(jié)原始卵泡庫激活，與女性生育力密切相關(guān)。一方面，體內(nèi)抑制其過度激活，能夠抑制原始卵泡的發(fā)育，減緩患者卵巢儲備能力下降的速度，延緩女性卵巢衰老；另一方面，對于卵巢功能較差的患者，體外激活卵巢組織過程中聯(lián)合應(yīng)用mTOR激活劑對改善輔助生殖妊娠結(jié)局有積極意義。目前，有關(guān)mTOR與卵泡發(fā)育的相關(guān)研究多局限于實驗動物模型，mTOR分子在人卵巢原始卵泡激活過程中的調(diào)控機(jī)制尚未明確。隨著研究的不斷深入，mTOR信號網(wǎng)絡(luò)調(diào)控原始卵泡激活及女性生殖分子機(jī)制進(jìn)一步明確，mTOR信號網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)將有望成為女性生育力保護(hù)甚至卵巢組織體外激活的新靶點，為女性不孕的診療提供新思路。