高戈，張?jiān)粕?/p>

體外受精-胚胎移植（in-vitro fertilizationembryotransfer，IVF-ET）技術(shù)開(kāi)展40年至今，已成為臨床治療不孕癥最為有效的手段，但其胚胎著床率僅為20%～30%[1]。自1978年首例試管嬰兒出生以來(lái)，低種植率始終是生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域尚未解決的問(wèn)題之一，也是限制人類輔助生殖技術(shù)發(fā)展的瓶頸，而且反復(fù)植入失敗更會(huì)對(duì)患者及家庭造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神壓力，同時(shí)增加臨床醫(yī)生的工作負(fù)荷。目前，世界范圍內(nèi)，為減少多胎妊娠，選擇性單胚胎移植正逐漸取代多胚胎移植成為一種趨勢(shì)，因此提高種植率的意義顯得尤為重要。現(xiàn)結(jié)合近年來(lái)國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究成果對(duì)影響胚胎種植率的關(guān)鍵因素進(jìn)行綜述。

1 胚胎質(zhì)量

胚胎本身的質(zhì)量無(wú)疑是影響胚胎種植率的關(guān)鍵因素之一，如何從眾多胚胎中挑選出最具發(fā)育潛能的胚胎用于移植是IVF實(shí)驗(yàn)室的胚胎學(xué)家們一直以來(lái)最為關(guān)心的問(wèn)題。目前世界上絕大多數(shù)IVF實(shí)驗(yàn)室采用的仍然是“試管嬰兒之父”Robert Edwards教授于1970年提出的傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)評(píng)估的方法，從細(xì)胞數(shù)量、碎片率以及均一性等方面來(lái)評(píng)價(jià)胚胎[2]。隨著研究的深入和技術(shù)的發(fā)展，胚胎學(xué)家們認(rèn)識(shí)到傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)評(píng)估由于只是在固定的幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)胚胎進(jìn)行觀察，因此并不能完全反映胚胎發(fā)育潛能的真實(shí)情況，一些用于挑選優(yōu)質(zhì)胚胎的新技術(shù)和新方法可能更為有效。

1.1 縮時(shí)攝影（Time-lapse）技術(shù) Time-lapse技術(shù)即每隔一段固定時(shí)間（如5 min或者10 min）對(duì)胚胎進(jìn)行一次拍照，然后將拍攝的照片按時(shí)間順序制作成影片，以此來(lái)反映胚胎的動(dòng)態(tài)發(fā)育過(guò)程。1997年，Payne等[3]首次運(yùn)用該技術(shù)對(duì)胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）授精后的胚胎發(fā)育進(jìn)行觀測(cè)，結(jié)果表明不同卵母細(xì)胞極體出現(xiàn)、原核形成及消失的時(shí)間明顯不同，在優(yōu)劣胚胎中有顯著差異。

Time-lapse技術(shù)較傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)評(píng)估的優(yōu)勢(shì)是不需要將胚胎拿出培養(yǎng)箱，一定程度上避免了溫度、pH值、CO2濃度等突然發(fā)生變化對(duì)胚胎發(fā)育的影響，同時(shí)可以結(jié)合不同指標(biāo)（如雙極體出現(xiàn)的時(shí)間，原核出現(xiàn)及消失時(shí)間，胚胎發(fā)育到2細(xì)胞、3細(xì)胞、4細(xì)胞、5細(xì)胞階段分別的用時(shí)，囊胚腔出現(xiàn)時(shí)間，囊胚開(kāi)始擴(kuò)張及孵出時(shí)間等）對(duì)胚胎發(fā)育進(jìn)行動(dòng)態(tài)形態(tài)學(xué)評(píng)估[4]。同時(shí)這項(xiàng)技術(shù)也屬于非侵入性操作，不需對(duì)胚胎進(jìn)行活檢。

目前Time-lapse技術(shù)同樣存在一些問(wèn)題，首先由于拍照而造成的光暴露對(duì)胚胎發(fā)育是否存在負(fù)面影響仍無(wú)定論；其次，其造價(jià)高昂且在分析時(shí)相比傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)評(píng)估更加耗時(shí)；再次，其動(dòng)態(tài)評(píng)估參數(shù)并沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，且對(duì)其實(shí)際效果是否優(yōu)于傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)評(píng)估仍存爭(zhēng)議[5-8]。

1.2 植入前遺傳學(xué)篩查（preimplantation genetic screening，PGS） 高齡、反復(fù)流產(chǎn)、反復(fù)植入失敗、嚴(yán)重男性因素不孕患者因?yàn)槿旧w非整倍體發(fā)生率增高，學(xué)術(shù)界提倡對(duì)這部分人群進(jìn)行PGS，目的是篩查23對(duì)染色體非整倍體，將更具發(fā)育潛能的整倍體胚胎用于移植，降低流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)，提高活產(chǎn)率[9-11]。其原理是在胚胎發(fā)育到第3天時(shí)對(duì)胚胎進(jìn)行激光打孔，然后在第5天或者第6天時(shí)取從激光打孔處孵出的少量外滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行活檢，活檢方法從過(guò)去的熒光原位雜交（fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH）到后來(lái)的微陣列比較基因組雜交（array comparative genomic hybridization，aCGH），再到目前主流的高通量測(cè)序（next generation sequencing，NGS）[12-13]。

2015年，一些IVF中心報(bào)道不經(jīng)選擇對(duì)所有IVF患者進(jìn)行PGS顯著提高了妊娠率[14]。有研究顯示，經(jīng)PGS篩查后的高齡（≥38歲）女性胚胎種植率、活產(chǎn)率與不經(jīng)PGS篩查的對(duì)照組相比顯著提高，流產(chǎn)率明顯降低[15]。PGS結(jié)合囊胚移植可顯著提高妊娠率、持續(xù)妊娠率、活產(chǎn)率，降低流產(chǎn)率和多胎風(fēng)險(xiǎn)，在高齡和反復(fù)流產(chǎn)的患者中具有較好的臨床效果[16-18]。隨著NGS技術(shù)的發(fā)展，特別是其成本的大幅度下降，其在PGS中的大范圍應(yīng)用取得了令人滿意的效果[19-21]。近年來(lái)，一些學(xué)者更是致力于無(wú)創(chuàng)PGS的研究，如通過(guò)對(duì)胚胎培養(yǎng)液中游離DNA進(jìn)行檢測(cè)取代胚胎活檢，盡管取得了一些成果[22-23]，但其敏感度和特異度仍有待提高，且距臨床大范圍推廣仍存較大差距。

PGS技術(shù)目前仍存在一些頗具爭(zhēng)議的問(wèn)題，首先，目前世界上絕大部分IVF實(shí)驗(yàn)室采用的活檢方法仍屬于有創(chuàng)操作，可能帶來(lái)胚胎損傷、植入潛能下降、表觀遺傳變化及成年后可能的遠(yuǎn)期影響，目前尚缺乏充分的研究數(shù)據(jù)證明其遠(yuǎn)期的安全性；其次，PGS仍然無(wú)法預(yù)知嵌合體胚胎的結(jié)局，隨著NGS在PGS中的應(yīng)用，嵌合體胚胎的診斷率提高，但對(duì)于嵌合體胚胎是否可以移植的問(wèn)題尚無(wú)定論；再次，PGS并不能改善可用胚胎質(zhì)量，也不能增加可移植胚胎數(shù)量，同時(shí)增加了患者的經(jīng)濟(jì)成本，因此是否應(yīng)該擴(kuò)大其適用范圍，不加選擇地對(duì)所有IVF患者進(jìn)行PGS目前仍存在較大爭(zhēng)議[24]。

2 子宮內(nèi)膜容受性（endometrial receptivity）

近年研究表明，子宮內(nèi)膜容受性是除胚胎質(zhì)量外的另一影響胚胎種植率的決定性因素。2006年有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，60%的胚胎種植失敗應(yīng)歸咎于不合適的子宮內(nèi)膜容受性[1]。2015年Galliano等[25]的研究再次證實(shí)，至少有25%的患者的子宮內(nèi)膜種植窗口期（window of implantation，WOI）會(huì)提前、延后或比通常的窗口期更短。因此根據(jù)個(gè)體化的WOI進(jìn)行移植，特別是對(duì)那些反復(fù)植入失敗的患者來(lái)說(shuō)顯得十分必要。基于此，科學(xué)家們一直致力于尋求一種簡(jiǎn)便且能夠精準(zhǔn)預(yù)測(cè)WOI的方法。

1950年，Noyes等[26]描述了排卵后子宮內(nèi)膜的時(shí)相變化，關(guān)于子宮內(nèi)膜活檢組織學(xué)分期的這一研究在當(dāng)時(shí)被認(rèn)為是評(píng)估子宮內(nèi)膜分化和成熟程度的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但隨后的研究發(fā)現(xiàn)，此項(xiàng)技術(shù)在評(píng)估子宮內(nèi)膜容受性方面具有一定的局限性，并不準(zhǔn)確；“胞飲突”也曾被認(rèn)為是在窗口期子宮內(nèi)膜發(fā)生形態(tài)學(xué)改變的最佳標(biāo)志物，但隨著研究的深入，越來(lái)越多的學(xué)者對(duì)“胞飲突”提出質(zhì)疑，認(rèn)為“胞飲突”在黃體期持續(xù)時(shí)間超過(guò)5 d，不能準(zhǔn)確描繪WOI[27]。

近期研究顯示，有多個(gè)基因在子宮內(nèi)膜各個(gè)時(shí)期的表達(dá)譜有明顯差異[28]，例如編碼外周血雌孕激素、白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）、黏蛋白1（mucoprotein-1，MUC-1）、細(xì)胞黏附分子（cell adhesion molecule，CAMs）、肝素結(jié)合性表皮生長(zhǎng)因子（heparin-binding epidermal growth factor，HB-EGF）的基因，這些基因被認(rèn)為是檢測(cè)子宮內(nèi)膜容受性潛在的生物學(xué)標(biāo)記物；不僅如此，一些研究離子通道的科學(xué)家還發(fā)現(xiàn)，WOI的出現(xiàn)與囊性纖維化跨膜通道調(diào)節(jié)因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）、 上 皮 細(xì) 胞 鈉 通 道（epithelial sodium channel，ENaC)、電壓依賴性鈣通道（voltage dependent calciumchannel，VDCC）以及瞬時(shí)受體電位通道（transient receptor potential channel，TRP）等多種離子通道有關(guān)[29]。

來(lái)自西班牙瓦倫西亞大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)研究院的研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)比較子宮內(nèi)膜自然狀態(tài)與超排卵的基因表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，超促排卵技術(shù)對(duì)WOI有影響，造成移植成功率降低[30]。他們通過(guò)對(duì)比自然狀態(tài)子宮內(nèi)膜不同時(shí)期基因表達(dá)譜，將238個(gè)可能與子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)的基因制作成基因芯片，通過(guò)相關(guān)臨床試驗(yàn)證實(shí)子宮內(nèi)膜容受性芯片（endometrial receptivity array，ERA）的準(zhǔn)確性要優(yōu)于傳統(tǒng)組織學(xué)活檢[31-34]。有學(xué)者通過(guò)一種間接的免疫熒光法來(lái)測(cè)定核仁管系統(tǒng)（nucleolar channel system，NCS）預(yù)測(cè)WOI，其結(jié)果與ERA的準(zhǔn)確性相當(dāng)[35]。上海交通大學(xué)附屬仁濟(jì)醫(yī)院的研究團(tuán)隊(duì)采用二代測(cè)序技術(shù)，對(duì)自然周期女性黃體生成激素（LH）峰值后第2天（LH+2）和第7天（LH+7）的子宮內(nèi)膜組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 的 比 較 ， 證 實(shí) GLI2、CDC25A、TLR9、MT1G 和SLC5A1等基因與子宮內(nèi)膜容受性有關(guān)[36]。

盡管各項(xiàng)對(duì)子宮內(nèi)膜容受性和種植窗口期的研究取得了一定成果，但目前仍存在一些問(wèn)題。首先，目前絕大多數(shù)針對(duì)子宮內(nèi)膜容受性的研究集中于內(nèi)膜組織本身，因此，如想在ET前對(duì)WOI進(jìn)行預(yù)測(cè)就需要提取內(nèi)膜組織，這種有創(chuàng)操作可能會(huì)對(duì)后續(xù)胚胎著床造成負(fù)面影響。其次，目前針對(duì)子宮內(nèi)膜容受性的研究方法集中于轉(zhuǎn)錄組學(xué)，特別是基因芯片技術(shù)，盡管高通量、自動(dòng)化基因芯片技術(shù)已經(jīng)比較成熟，使生物學(xué)標(biāo)記物的篩選及鑒定有了重大突破，但基因的表達(dá)水平與活性蛋白質(zhì)的量之間并不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，從基因轉(zhuǎn)錄到翻譯再到蛋白質(zhì)最終執(zhí)行功能受到多級(jí)水平的調(diào)控。因此，未來(lái)對(duì)于WOI生物學(xué)標(biāo)記物的研究如果從子宮內(nèi)膜組織轉(zhuǎn)向血清、從轉(zhuǎn)錄組轉(zhuǎn)向蛋白質(zhì)組可能會(huì)取得更重要的突破。

3 結(jié)語(yǔ)

IVF-ET經(jīng)過(guò)40年的發(fā)展，衍生出如ICSI、PGS、Time-lapse、ERA等新的技術(shù)手段，隨著這些新技術(shù)在胚胎挑選以及個(gè)體化ET中的應(yīng)用，胚胎種植率以及IVF-ET的成功率將不斷提高。同時(shí)，伴隨干細(xì)胞治療在子宮內(nèi)膜修復(fù)和治療卵巢功能早衰中的成功應(yīng)用[37-38]，以及為治療線粒體遺傳疾病而誕生的“三親”試管嬰兒技術(shù)，IVF-ET的治療范圍將進(jìn)一步擴(kuò)大。盡管基因編輯技術(shù)在人類生殖細(xì)胞中的應(yīng)用引發(fā)了巨大爭(zhēng)議，但不可否認(rèn)，隨著CRISPR-Cas9[39]等基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)，未來(lái)人們對(duì)IVF-ET的期望也將逐漸從“能生”轉(zhuǎn)變?yōu)椤皟?yōu)生”，盡管在技術(shù)層面以及醫(yī)學(xué)倫理問(wèn)題上還將有相當(dāng)長(zhǎng)的一段路要走，但隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，IVF-ET必將迎來(lái)更大發(fā)展。