王文靜　朱曉東　王經榮　蔡清強　蔡文聘　房太勇

【摘要】 目的：探討FOXP3及LAP蛋白在結直腸癌中的表達與臨床意義，為臨床治療結直腸癌提供實驗理論基礎。方法：收集2016年9月-2017年6月在福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院診治的健康體檢者結直腸組織、患者結直腸腺瘤及結直腸癌組織，并對各組織進行H&E染色及病理診斷。運用Western-blot檢測各組織中FOXP3及LAP蛋白的表達。分析各組FOXP3、LAP蛋白的表達水平，以及兩種蛋白的表達與臨床病理參數的關系。結果：（1）FOXP3及LAP蛋白在結直腸癌組的表達均高于結直腸腺瘤組及健康人組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。（2）FOXP3及LAP蛋白的表達水平與腺瘤上皮內瘤變級別呈正相關，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。（3）FOXP3及LAP蛋白表達水平與淋巴結轉移、癌細胞分化程度、腫瘤組織浸潤深度、TNM分期呈正相關，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論：FOXP3、LAP蛋白可能參與了腺瘤向癌的進展過程及腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。

【關鍵詞】 結直腸癌; 結直腸腺瘤; LAP; FOXP3

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.17.080 文獻標識碼 B 文章編號 1674-6805（2019）17-0-04

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是臨床上較常見的惡性腫瘤之一，根據國家癌癥中心發(fā)布的《2017年最新中國腫瘤現(xiàn)狀和趨勢》顯示：CRC的發(fā)病率及死亡率均高居第五位。表明CRC對我國人民的健康產生了重大威脅。對結直腸癌發(fā)病機制研究的深入能夠幫助大家更早、更多地篩查出結直腸癌，進而達到早診早治、提高生存率的目標。目前關于FOXP3及LAP蛋白在CRC及CRA組織中的表達情況的研究較少，兩種蛋白在CRC組織中的表達情況如何并未明確。因而本研究旨在檢測CRC及結直腸腺瘤（colorectal adenomas，CRA）組織中FOXP3及LAP蛋白的表達情況，并分別觀察兩種蛋白與臨床病理參數的關系，觀察這兩種蛋白對結直腸癌的發(fā)病進程的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究經醫(yī)院倫理委員會審批后同意執(zhí)行。選取2016年9月-2017年6月在福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院診治的研究對象的組織標本，每例樣本均詳細記錄對應患者一般資料（包括姓名、性別、年齡、聯(lián)系方式、家庭住址）、臨床信息（包括現(xiàn)病史、既往史、個人史、臨床診斷、診斷時間、手術時間、相關實驗室檢查結果及影像學檢查結果等）、病理資料（包括病理號、詳細病理學描述、病理診斷等）、腫塊大小、浸潤深度、有無淋巴結轉移等。其中健康人組：共收集25例，其中男12例，女13例，平均年齡（44±10）歲。結直腸腺瘤組：共收集25例，其中男16例，女9例，平均年齡（56±10）歲。腺瘤部位：直腸腺瘤5例，結腸腺瘤20例;腫瘤大小：>1 cm 16例，≤1 cm 9例;上皮內瘤變：高級別11例，低級別14例。結直腸癌組：共收集33例，其中男19例，女14例，平均年齡（61±12）歲。直腸癌14例，結腸癌19例;腫瘤大小：>5 cm 11例，≤5 cm 22例;有淋巴結轉移19例，無淋巴結轉移14例;浸潤深度：T1～T4分別為5、5、10、13例;分化程度：高分化5例，中分化20例，低分化8例;TNM分期：Ⅰ～Ⅳ期分別為：2、16、14、1例。

1.2 組織標本

組織離體后分成兩部分，一部分組織迅速置入-196 ℃液氮速凍，后轉送入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?另一部分組織放入10%福爾馬林固定，行常規(guī)H&E染色，由專業(yè)病理科醫(yī)師進行病理診斷，對于癌組織參照AJCC/UICC的結直腸癌TNM分期系統(tǒng)、中國結直腸腫瘤篩查、早診早治和綜合預防共識意見，并結合術中所見對結直腸癌組織進行診斷、分級和分期。

1.3 實驗方法

1.3.1 H&E染色 取組織標本、沖洗、去除表面殘留糞便及血液，放入10%福爾馬林中固定大于12 h;脫水→透明→包埋→切片→貼片→脫蠟→染色→脫水Ⅰ和復染→脫水Ⅱ和透明→封藏。

1.3.2 Western-blot 提取組織蛋白，并采用BCA試劑盒檢測提取的蛋白濃度;測定后將剩余蛋白提取液進行SDS-PAGE電泳（90 V 30 min，下層分離膠120 V 60 min）;采用PVDF膜進行轉膜（100 V 60～90 min）;使用5%脫脂奶粉封閉后依次與一抗（鼠抗人FOXP3單克隆抗體1∶500稀釋;鼠抗人LAP單克隆抗體1∶2 000稀釋）、二抗（羊抗鼠單克隆IgG抗體1∶5 000稀釋）反應，在避光條件進行曝光、采圖，以GAPDH作為內參進行標準對照，分析FOXP3和LAP蛋白表達水平。

1.4 統(tǒng)計學處理

所有數據采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行處理，計量資料數據以（x±s）表示，三組間的比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩組間的比較采用t檢驗，等級指標采用Spearman相關系數分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 健康體檢者結直腸組織、結直腸腺瘤及結直腸癌組織H&E染色結果

各組織常規(guī)H&E染色病理圖，見圖1、圖2，A正常黏膜組織：腺體排列規(guī)則，腺體未見擁擠融合，核未見異型。B結腸腺瘤：腺體呈管狀，排列規(guī)則，未見背靠背現(xiàn)象，腺體未見融合，未見成角，未見間質浸潤。細胞輕度異型，位于基底層，未見病理性核分裂。C結腸腺癌：腺體不規(guī)則，呈背靠背融合，可見成角及壞死，間質纖維化，浸潤明顯。細胞重度異型，可見病理性核分裂。

2.2 健康體檢者結直腸組織、結直腸腺瘤及結直腸癌組織中FOXP3及LAP蛋白表達情況

運用Western Blot檢測各組織中FOXP3及LAP蛋白的表達情況，見圖3，采用單因素方差分析對三組間的FOXP3及LAP蛋白表達量進行分析，見表1。

2.3 結直腸腺瘤組織中FOXP3及LAP蛋白的表達與臨床病理參數的關系分析

（1）采用獨立t檢驗對FOXP3及LAP蛋白的表達與臨床病理參數之間的關系進行分析，見表2。FOXP3及LAP蛋白的表達水平與腺瘤年齡、性別、腺瘤部位、大小相關性尚不確切，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。（2）采用Spearman相關系數對FOXP3及LAP蛋白的表達與臨床病理參數（等級指標）之間的關系進行分析，見表3，F(xiàn)OXP3蛋白的表達水平與腺瘤上皮內瘤變級別呈正相關（rs=0.838），高級別上皮內瘤變組高于低級別上皮內瘤變組（0.854±0.331，0.495±0.203），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。LAP蛋白的表達水平與腺瘤上皮內瘤變級別呈正相關（rs=0.849），高級別上皮內瘤變表達水平高于低級別上皮內瘤變（1.136±0.161，0.949±0.687），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。

2.4 結直腸癌組織中FOXP3及LAP蛋白的表達與臨床病理參數的關系分析

（1）采用獨立t檢驗分析FOXP3及LAP蛋白的表達與臨床病理參數的關系，見表4。（2）采用Spearman相關系數分析FOXP3及LAP蛋白的表達水平與等級指標的關系，見表5。FOXP3蛋白與癌細胞分化程度呈正相關（rs=0.464），分化程度越低，表達水平越高（依次為0.497±0.332、0.990±0.629、1.441±0.679），差異有統(tǒng)計學意義（P=0.007）;與腫瘤組織浸潤深度呈正相關（rs=0.588），浸潤深度越深，表達水平越高（依次為0.574±0.582、0.687±0.268、0.815±0.347、1.488±0.732），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）;與TNM分期呈正相關（rs=0.464），分期越晚，表達水平越高（依次為0.314±0.041、0.768±0.581、1.420±0.599、1.504），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。LAP蛋白的表達水平與癌細胞分化程度呈正相關（rs=0.680），分化越低表達水平越高（依次為0.736±0.201、0.995±0.460、1.825±0.453），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）;與腫瘤組織浸潤深度呈正相關（rs=0.543），浸潤深度越深表達水平越高（依次為0.712±0.314、0.758±0.156、1.218±0.475、1.434±0.662），差異有統(tǒng)計學意義（P=0.001）;與TNM分期呈正相關（rs=0.567），分期越晚表達水平越高（依次為0.637±0.197、0.937±0.403、1.480±0.641、1.198），差異有統(tǒng)計學意義（P=0.001）。

3 討論

目前認為結直腸癌是由飲食結構、生活環(huán)境、生活方式及遺傳等多方面因素相互協(xié)同作用的結果。而在發(fā)病機制研究方面，已有一些研究從不同角度探索，如突變細胞周期和失巢凋亡途徑、血管生成、信號轉導等均在CRC的發(fā)生和進展過程中起了重要作用[1-4]。本研究檢測健康人、結直腸腺瘤、結直腸癌組織中FOXP3及LAP蛋白的表達，探討兩者可能參與了腺瘤向癌的進展過程及腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。

3.1 FOXP3及LAP蛋白與結直腸腺瘤

結直腸腺瘤是最常見的CRC癌前病變。70%～80%的結直腸癌是由結直腸腺瘤演變而來，這個過程需要10～15年的時間[5]。目前認為腺瘤癌變的高危因素可能與患者年齡、飲食習慣、腺瘤的病理類型、大小、有無蒂、不典型增生程度等因素有關。但從其分子機制水平來看，似乎尚未發(fā)現(xiàn)能夠準確預估腺瘤癌變風險的生物學指標。Hua等[6]通過檢測結直腸腺瘤腫瘤微環(huán)境中的FOXP3+Tregs表達情況，他們發(fā)現(xiàn)腺瘤腫瘤微環(huán)境中FOXP3+Tregs表達增高。本研究中觀察到腺瘤組織中的FOXP3蛋白高于健康人，這與Hua等所提出的FOXP3+Tregs在腺瘤腫瘤微環(huán)境中的表達相類似。筆者推測FOXP3蛋白對于腺瘤的發(fā)生可能有促進作用。另一方面，筆者觀察到LAP蛋白在腺瘤組織中的表達與FOXP3蛋白相似，這提示LAP蛋白可能與FOXP3蛋白一樣對于腺瘤的發(fā)生有促進作用。

2000年《WHO腫瘤病理學及遺傳學分類：消化系統(tǒng)腫瘤》將結直腸腺瘤定義為有上皮內瘤變（intraepithelial neoplasia，IN）存在的病變，并將IN分為低級別上皮內瘤變（LGIN）和高級別上皮內瘤變（HGIN），其中有研究表明，80%的HGIN可在1年內進展為浸潤癌。筆者研究發(fā)現(xiàn)FOXP3蛋白及LAP蛋白表達水平與上皮內瘤變級別呈正相關，且差異有統(tǒng)計學意義，這提示FOXP3與LAP蛋白可能參與了結直腸腺瘤的癌變過程，但兩種蛋白之間的關系如何，是否為協(xié)同作用，仍需待后續(xù)研究證實。

3.2 FOXP3及LAP蛋白與結直腸癌

3.2.1 FOXP3蛋白與結直腸癌 2001年，Hinz等[7]首次在胰腺導管腺癌細胞和腫瘤中檢測FOXP3蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)FOXP3陽性的胰腺癌細胞能夠遏制活化T細胞的增殖、抑制TGF-β與IL-10的表達和分泌，進而介導了免疫抑制和腫瘤免疫逃逸。這些都揭示了FOXP3蛋白在腫瘤免疫微環(huán)境中可能發(fā)揮著抑制免疫活性的作用，從而參與免疫抑制及腫瘤的免疫逃逸。Karanikas等[8]運用免疫組化與流式細胞術檢測FOXP3蛋白在25種不同組織來源的腫瘤細胞系的表達情況，證實了這25種腫瘤細胞系均有表達FOXP3蛋白。而在結直腸癌方面，Grimmig等[9-10]研究小組均發(fā)現(xiàn)，結腸癌細胞中FOXP3蛋白表達與患者的不良預后相關，即腫瘤惡性度越高，則FOXP3蛋白表達水平隨之升高，患者預后越差。本實驗中所觀察到的結果與之一致：筆者發(fā)現(xiàn)結直腸癌中FOXP3蛋白表達高于健康人黏膜組織，推測FOXP3蛋白表達的上調可能在正常結直腸上皮發(fā)展為CRC的過程中起著一定的作用。

惡性腫瘤的預后與有無淋巴結轉移、癌細胞分化程度、腫瘤組織浸潤深度及TNM分期等因素密切相關。在本研究中FOXP3蛋白與上述臨床病理參數間的關系：有淋巴結轉移者FOXP3蛋白表達較無淋巴結轉移者高，且差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。在FOXP3蛋白與癌細胞分化程度、腫瘤組織浸潤深度及TNM分期的關系分析中，筆者發(fā)現(xiàn)癌細胞分化程度越差、腫瘤組織浸潤深度越深、TNM分期越晚，F(xiàn)OXP3蛋白表達水平越高，這些均提示FOXP3蛋白可能參與腫瘤的發(fā)展、侵襲及轉移。

3.2.2 LAP蛋白與結直腸癌 LAP在CRC中的研究主要圍繞LAP+CD4+T細胞：Zhong等[11]發(fā)現(xiàn)CRC腫瘤微環(huán)境中LAP+CD4+T細胞的表達量增多，可能是抑制機體產生有效的抗腫瘤免疫應答，最終導致腫瘤的免疫逃逸，使腫瘤進行性生長的因素之一。而LAP蛋白在腫瘤組織中是否表達及其作用機制研究較少，是否與同樣作為Tregs表面標志物的FOXP3作用相同，目前仍未明確。在本實驗中筆者通過Western blot檢測到LAP蛋白在CRC組織中有表達，并觀察到LAP蛋白在CRC組織中的表達高于健康人結腸組織，這與Kim等[12]所研究的FOXP3蛋白在腫瘤組織中富集相似，提示LAP蛋白可能與FOXP3蛋白一樣發(fā)揮著促進腫瘤發(fā)生的作用。在進一步分析其表達與有無淋巴結轉移、癌細胞分化程度、腫瘤組織浸潤深度及TNM分期等因素之間的關系時，發(fā)現(xiàn)LAP蛋白的表達與FOXP3蛋白在腫瘤組織中的表達相類似：在有淋巴結轉移者組織中表達高，且癌細胞分化程度越差、腫瘤組織浸潤深度越深、TNM分期越晚，LAP蛋白表達水平越高，說明LAP蛋白可能參與腫瘤的發(fā)展、侵襲及轉移。

綜上所述，結果提示LAP蛋白與FOXP3蛋白在結直腸癌的發(fā)生發(fā)展中可能有共同作用，但這兩種蛋白表達的意義、調控機制及其與結直腸癌發(fā)生、發(fā)展及患者預后的關系還有待進一步探索。

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（收稿日期：2019-01-09） （本文編輯：何玉勤）