朱正凱 林少華 李亮明

【摘要】 目的：探討雌激素受體拮抗劑對泌乳素腺瘤細胞增殖的影響。方法：在同樣去激素培養(yǎng)的條件下添加不同濃度雌激素和雌激素受體拮抗劑，應用MTT法檢測其對GH3細胞增殖的影響。結果：不同濃度的OHTam對GH3細胞有明顯的抑制作用，并且與劑量呈正相關，10-11 mol/L即有抑制作用，10-6 mol/L抑制作用達到最大。E2可顯著的刺激GH3細胞增殖，10-12 mol/L即有促進增殖作用，10-9 mol/L作用達到最大，而后隨著濃度的升高增殖作用反而逐漸減弱。結論：雌激素受體拮抗劑能顯著抑制泌乳素腺瘤細胞的生長，理論上可以用于泌乳素腺瘤的藥物治療。

【關鍵詞】 泌乳素腺瘤; 雌激素; 雌激素受體拮抗劑; GH3細胞

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of estrogen receptor antagonists on the in vitro growth of human prolactinomas.Method：Estradiol and estrogen receptor antagonists were added respectively at different concentrations into the culture medium MTT assays were used to detect the effects on the growth and proliferation of GH3 cells.Result：OHTam could inhibit GH3 cell proliferation as dose-dependent manner，when the concentration was 10-11 mol/L，the GH3 cell proliferation was inhibit.If the concentration rises to 10-6 mol/L，it would produce the greatest effect.E2 had significant stimulatory effect on growth of GH3 cells，and the effect worked even at low concentration of 10-12 mol/L.The greatest effect would produce when the concentration was 10-9 mol/L，if the concentration still increases，the proliferation effect would gradually weaken.Conclusion：Estrogen receptor antagonists can inhibit GH3 cell proliferation.In theory，it can be used for the drug treatment of prolactinomas.

【Key words】 Prolactinomas; Estradiol; Estrogen receptor antagonists; GH3 cells

First-authors address：Zhongshan Peoples Hospital，Zhongshan 528400，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.10.007

泌乳素（Prolactin，PRL）腺瘤是垂體腺瘤中最常見的類型，占所有垂體腺瘤中的40%～60%，其臨床表現主要有泌乳、閉經、不孕、頭痛、視力障礙、垂體功能低下等。在多巴胺受體激動劑出現之前，臨床上治療方法主要為手術治療及放射治療。隨著以溴隱亭為代表的多巴胺受體激動劑的發(fā)現，多巴胺受體激動劑現已成為泌乳素腺瘤的首選治療方案。但目前臨床上仍有5%～18%泌乳素腺瘤患者對多巴胺受體激動劑耐藥，主要發(fā)生在大腺瘤當中。臨床上將這類腫瘤稱為耐多巴胺受體激動劑性泌乳素腺瘤（Dopamine agonist-resistant prolactinomas，DARPs）。目前對于泌乳素腺瘤耐藥性的具體機制研究較多，但仍不是十分明確。臨床上發(fā)現服用大劑量的雌激素可以增加泌乳素腺瘤的發(fā)病率，在雌激素治療過程中泌乳素微腺瘤可發(fā)展為大腺瘤。因而雌激素在泌乳素腺瘤發(fā)展過程中可能起到了重要作用。也有學者認為給予雌激素受體拮抗劑可以增加DARPs對多巴胺受體激動劑的敏感性，從而提高藥物治療的有效性。目前研究已發(fā)現，PRL腺瘤細胞表面存在雌激素受體（estrogen receptor，ER），其與腫瘤細胞的增殖和生物學特性有著密切的關系。本實驗將通過在同樣培養(yǎng)條件下，了解不同濃度雌激素、雌激素受體拮抗劑對大鼠GH3 垂體腺瘤細胞增殖的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1 材料

1.1 實驗藥物和瘤細胞系 本實驗采用的雌激素為雌二醇（estradiol，E2），雌激素受體拮抗劑為4-羥基他莫昔芬（4-hydroxytamoxifen，OHTam），藥物的濃度梯度為10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12 mol/L，藥物使用無水乙醇溶解，乙醇終濃度小于0.1%。實驗采用的PRL腺瘤細胞為GH3大鼠垂體腺瘤細胞株。

1.2 去激素小牛血清的制備 在新生小牛血清中加入人葡聚糖（0.25 g/L），完全溶解后加入活性炭（2.5 g/L），于55 ℃水浴中作用45 min，離心10 min，取其上清液。上述步驟連續(xù)處理2次以徹底去除血清中的雌激素。處理好的血清使用金屬濾器（0.45、0.22 μm兩層濾膜）過濾除菌，然后置入-20 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 采用GH3大鼠垂體腺瘤細胞株，Hams培養(yǎng)基（2 mmol/L谷氨酰胺，100 U/mL青霉素，100 μg/ml鏈霉素，160 U/L胰島素），熱滅活的10%馬血清，2.5%胎牛血清。細胞常規(guī)在37 ℃、5%CO2、100%濕度的孵箱中培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下取處于對數生長期、形體良好的細胞進行實驗。用多聚賴氨酸包被細胞培養(yǎng)瓶，待GH3細胞貼壁生長，融合度達85%～90%時，去除原培養(yǎng)基，加入適量的PBS（對于100 mm平皿，加入2 mL PBS）漂洗細胞兩次。加入1 mL 0.05%胰蛋白酶消化液，37 ℃消化數分鐘直至鏡下觀察細胞變圓且透亮，直接加入2 mL完全培養(yǎng)基終止消化并將細胞從平皿底部輕輕吹下，全部轉移至干凈的50 mL離心管中，800 r/min離心5 min。棄去上清，加入1 mL完全培養(yǎng)基輕輕吹打直至細胞完全分散。根據實驗需要，將適量細胞加入已經加入完全培養(yǎng)基細胞培養(yǎng)皿中。

1.2.2 MTT法檢測OHTam和E2對GH3細胞增殖的影響 GH3細胞培養(yǎng)貼壁24 h后，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，充分打勻，以5×104 cells/well的濃度接種于6孔板中，細胞貼壁后換液一次，以后分為三組，分別為：（1）對照組為無血清培養(yǎng)液;（2）E2組分別加入濃度為10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12 mol/L的E2;（3）OHTam組分別加入濃度為10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11 mol/L的OHTam。將打勻好的細胞以1×105 cells/well的濃度接種于96孔板中，細胞貼壁后更換新培養(yǎng)液，加入各組實驗用藥，培養(yǎng)箱孵育48 h后，各孔加入5 mg/mL MTT 20μL，繼續(xù)孵育4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL溶解甲躦（MTT還原產物），再置于酶聯免疫檢測儀中，以570 nm波長測定吸光度，校正波長為630 nm，計算其生長抑制率和增殖指數。計算公式為：生長抑制率=（對照組吸光度一用藥組吸光度）/對照組吸光度;增殖指數=用藥組吸光度/對照組吸光度。

1.2.3 ELISA法檢測OHTam和E2對GH3細胞PRL分泌的影響 GH3細胞培養(yǎng)貼壁24 h后，換無血清的Hams培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后分為三組，分別為：（1）對照組為無血清培養(yǎng)液;（2）E2組分別加入濃度為10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12 mol/L的E2;（3）OHTam組，分別加入濃度為10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11 mol/L的OHTam。加藥后在37 ℃、5% CO2繼續(xù)孵育72 h后收集上清，-20 ℃保存。用大鼠PRL ELISA試劑盒檢測收集的上清中的PRL。先加入50 μL標準品、血清標本于相應反應板孔中。每孔加入100 μL酶聯物，輕輕混勻30 s，室溫60 min。洗板后，每孔加入100 μL顯色液，輕輕混勻10 s，室溫20 min。每孔加入50 μL終止液。輕輕混勻30 s，30 min內在450 nm處讀吸光度值（A450值）。以A450值為縱坐標，以標準品濃度為橫坐標，繪制標準曲線。根據血清樣品的OD值可在標準曲線上查出其濃度。以對照組PRL基礎分泌量為100%，各組測得的激素相對值=實驗組A值/對照組A值×100%。

2 結果

2.1 MTT法檢測OHTam和E2對GH3細胞增殖的影響 （1）不同濃度的OHTam對GH3細胞有明顯的抑制作用，10-11 mol/L即有抑制作用，10-6 mol/L抑制作用達到最大，具體結果為：10-6 mol/L OHTam對應的生長抑制率為37%，10-7 mol/L OHTam對應的生長抑制率為28%，10-8 mol/L OHTam對應的生長抑制率為25%，10-9 mol/L OHTam對應的生長抑制率為16%，10-10 mol/L OHTam對應的生長抑制率為11%，10-11 mol/L OHTam對應的生長抑制率為9%。從圖1中可以看出OHTam對GH3細胞有明顯的抑制作用，并且與劑量呈正相關。（2）E2可顯著的刺激GH3細胞增殖，10-12 mol/L即有促進增殖作用，10-9 mol/L作用達到最大，而后隨濃度的升高增殖作用反而逐漸減弱，具體結果為：10-7 mol/L?E2對應的增殖指數為2.1，10-8 mol/L E2對應的增殖指數為2.9，10-9 mol/L E2對應的增殖指數為4.8，10-10 mol/L E2對應的增殖指數為3.9，10-11 mol/L E2對應的增殖指數為3.1，10-12 mol/L E2對應的增殖指數為2.6。

2.2 ELISA法檢測OHTam和E2對GH3細胞PRL分泌的影響 （1）不同濃度OHTam對GH3細胞PRL分泌有明顯抑制作用，10-11 mol/L即可抑制GH3細胞PRL的分泌，10-6 mol/L抑制作用達到最大，具體結果為：10-6 mol/L OHTam對應的PRL激素相對值為42%，10-7 mol/L OHTam對應的PRL激素相對值為48%，10-8 mol/L OHTam對應的PRL激素相對值為53%，10-9 mol/L OHTam對應的PRL激素相對值為61%，10-10 mol/L OHTam對應的PRL激素相對值為68%，10-11 mol/L OHTam對應的PRL激素相對值為75%;（2）E2可刺激GH3細胞PRL的分泌，10-12 mol/L即可刺激GH3細胞PRL的分泌，10-7 mol/L刺激作用達到最大，具體結果為：10-7 mol/L OHTam對應的PRL激素相對值為254%，10-8 mol/L OHTam對應的PRL激素相對值為218%，10-9 mol/L OHTam對應的PRL激素相對值為185%，10-10 mol/L OHTam對應的PRL激素相對值為165%，10-11 mol/L OHTam對應的PRL激素相對值為148%，10-12 mol/L OHTam對應的PRL激素相對值為137%。

3 討論

GH3細胞系是由Tashjian AH等在1965年從一只7月齡的雌性Wistar-Furth大鼠的垂體腫瘤中分離建立的。GH3細胞系不是直接來源于GH1細胞系的克隆，而是從原代培養(yǎng)的GH1細胞在大鼠身上傳代兩次形成的腫瘤中建立的。上皮樣的GH3細胞可分泌生長激素和泌乳素，目前廣泛應用于對PRL腺瘤的研究。

Spady等[1]通過研究發(fā)現，雌激素能夠在轉錄和翻譯水平調控PRL基因的表達，最終刺激PRL分泌。雌激素能夠增加患泌乳素腺瘤的風險，有病例報道男性接受變性手術后大劑量服用雌激素可導致泌乳素腺瘤[2]。李丹等[3]在體外細胞水平研究發(fā)現雌激素可促進GH3細胞增殖和泌乳素的分泌，而雌激素受體拮抗劑則能抑制雌激素的作用。Heaney等[4]研究發(fā)現雌激素受體在所有泌乳素腺瘤中均有表達，但表達水平存在差異，侵襲性泌乳素腺瘤的表達水平明顯低于平均水平。而國內有學者研究則認為ER在男性及侵襲性泌乳素腺瘤中的表達水平高于女性及非侵襲性泌乳素腺瘤[5]。

雌激素主要通過與ER結合形成復合物而發(fā)揮作用。ER主要有兩種亞型，即ERα和ERβ。在PRL腺瘤細胞中，ERα和ERβ均有表達。Manoranjan等[6]研究發(fā)現PRL腺瘤的耐藥病例中ERαmRNA表達高于敏感病例，而ERβmRNA則明顯低于敏感病例。Maus等[7]研究認為雌激素是通過影響多巴胺D2受體（dopamine D2 receptor，D2R）與多巴胺的耦合來降低對腺苷酸環(huán)化酶的抑制作用，從而促進PRL腺瘤細胞的生長和PRL分泌。D2受體包括兩種亞型：D2-LR和D2-SR，其中D2-LR的表達率最高，D2-SR雖然表達率不高，但其耦連腺苷酸環(huán)化酶的效率遠高于D2-LR。Lamberts等[4]、Heaney等[8]通過研究則認為雌激素可影響D2-SR/D2-LR，增加D2-LR的表達，而D2-LR的親和力遠遠低于D2-SR，從而降低PRL腺瘤對多巴胺的應答。Passos等[9]研究發(fā)現，ERβ的表達與NGFR的表達呈負線性關系。NFGB和NGFR則可通過激活NFkβ，調節(jié)D2R基因，促進PRL腺瘤細胞D2R的表達，從而使DARPS對多巴胺應答[9-10]。這也一定程度上印證了Lamberts和Heaney的觀點。

但目前關于雌激素和雌激素受體拮抗劑對泌乳素腺瘤細胞的作用仍存在爭議，未達成一致結論。本實驗中筆者發(fā)現雌激素能顯著促進GH3細胞的增殖，但增殖作用與E2的濃度密切相關，在10-9 mol/L作用達到最大，而后隨著濃度的升高增殖作用反而逐漸減弱，原因可能與雌激素的負反饋有關，太高濃度的雌激素可能負反饋抑制腫瘤細胞表面ER的表達，從而減弱了雌激素的作用。而雌激素受體拮抗劑OHTam對GH3細胞有明顯抑制作用，10-11 mol/L即有抑制作用，10-6 mol/L抑制作用達到最大，并且在一定濃度范圍內抑制作用與OHTam濃度呈正相關。不同濃度OHTam對GH3細胞PRL分泌有明顯抑制作用，10-11 mol/L即可抑制GH3細胞PRL的分泌，10-6 mol/L抑制作用達到最大，而E2則可刺激GH3細胞PRL的分泌，10-12 mol/L即可刺激GH3細胞PRL的分泌，10-7 mol/L刺激作用達到最大。目前在一些其他類型的腫瘤，如乳腺癌、子宮內膜癌等一些雌激素依賴性疾病當中，雌激素受體拮抗劑可以通過競爭性的與ER耦合，阻礙原癌基因的表達，抑制雌激素誘導的生長因子分泌的增加，從而抑制腫瘤的生長，通過應用雌激素受體拮抗劑取得了顯著成效[11-14]。在PRL腺瘤當中，雌激素受體拮抗劑相關作用機制可能有：（1）雌激素通過與ER耦合，在轉錄水平增加PRL基因的表達，通過一些直接和間接的機制刺激PRL的分泌。雌激素受體拮抗劑則通過競爭性的與ER耦合，拮抗雌激素的作用，從而減少腫瘤細胞PRL的分泌[15]。（2）雌激素受體拮抗劑通過與ER結合，影響細胞表面D2R的表達及多巴胺與D2R的耦合，增加對腺苷酸環(huán)化酶的抑制作用，從而減少PRL腺瘤細胞的生長和PRL分泌[7]。無論是哪一種可能的機制，目前對其具體的作用過程都不是十分明確，有待進一步的研究。但雌激素和雌激素受體拮抗劑在PRL腺瘤的作用結果目前十分明確，即雌激素能夠刺激PRL腺瘤細胞的增殖和PRL的分泌，而雌激素受體拮抗劑能抑制PRL腺瘤細胞的增殖和PRL的分泌[16-17]。

大量的研究都表明PRL腺瘤的發(fā)生、增殖都與ER有著密切的關系，雌激素受體拮抗劑可以有效地抑制PRL腺瘤細胞生長、減少PRL的分泌。對多巴胺受體激動劑敏感的泌乳素腺瘤細胞表面D2R的密度明顯大于耐藥的[18]。臨床上發(fā)現對多巴胺受體激動劑耐藥的泌乳素腺瘤患者在給予雌激素受體拮抗劑后可以變的敏感。雌激素受體拮抗劑改變PRL腺瘤細胞對多巴胺受體激動劑敏感性的途徑可能是通過促進PRL腺瘤細胞表面D2R受體的表達，特別是D2-SR的表達，D2-SR/D2-LR比值上升，從而提高PRL腺瘤對多巴胺受體激動劑的敏感性[19- 20]。

Heaney等通過動物實驗發(fā)現，皮下注射雌激素受體拮抗劑可降低88%泌乳素水平和減少41%腫瘤的生長[4]。雌激素受體mRNA表達與D2-SR mRNA表達存在在負相關性，而與D2-LR mRNA表達呈正相關性，這似乎也進一步驗證了D2-LR/D2-SR比例的改變參與了耐藥的發(fā)生。理論上通過給予雌激素受體拮抗劑降低腫瘤細胞表面雌激素受體的表達，可以增加DARPs對多巴胺受體激動劑的敏感性[21]。

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（收稿日期：2018-09-28） （本文編輯：周亞杰）