覃信梅　盧永彬　江祈貴　黃章平　黃夕洋

摘要：肌醇半乳糖苷合成酶基因與植物光合產(chǎn)物運(yùn)輸、種子耐脫水性、抵御生物與非生物脅迫和自我保護(hù)等生理生化過(guò)程密切相關(guān)?；诖听X報(bào)春苣苔（Primulina spinulosa）轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，獲得（鑒定）1個(gè)肌醇半乳糖苷合成酶基因。序列分析結(jié)果表明，該基因全長(zhǎng)1 347 bp（GenBank登錄號(hào)為MG521418），開(kāi)放閱讀框（ORF）為1 008 bp，共編碼335個(gè)氨基酸。進(jìn)一步基于氨基酸序列的分析表明，該基因編碼的蛋白質(zhì)分子量為38.05 ku，理論等電點(diǎn)為5.09，為親水性蛋白，含有1個(gè)與糖基轉(zhuǎn)移酶家族蛋白相同的保守結(jié)構(gòu)域;刺齒報(bào)春苣苔的肌醇半乳糖苷合成酶基因與同科的旋蒴苣苔（Boea hygrometrica，F(xiàn)J222452）的相似性高達(dá)90%，兩者在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上聚為1支。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究刺齒報(bào)春苣苔的肌醇半乳糖苷合成酶基因的分子結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：刺齒報(bào)春苣苔;肌醇半乳糖苷合成酶基因;基因序列分析;信號(hào)肽

中圖分類號(hào)： S184文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）08-0056-04

肌醇半乳糖苷合成酶（galactinol synthase，簡(jiǎn)稱GolS）是糖基轉(zhuǎn)移酶家族的一個(gè)亞家族，能催化半乳糖和肌醇反應(yīng)合成肌醇半乳糖苷，為棉子糖系列寡糖的合成提供半乳糖基。棉子糖系列寡糖（raffinose family oligosaccharides，簡(jiǎn)稱RFOs）主要包括棉子糖、水蘇糖、毛蕊草糖等，是高等植物中重要的可溶性小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[1]。當(dāng)植物受到環(huán)境脅迫時(shí)，可以快速合成并積累不同種類的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)維持植物細(xì)胞內(nèi)正常的生理機(jī)能，調(diào)節(jié)植物以適應(yīng)環(huán)境脅迫，使植物免受脅迫傷害。一些體內(nèi)不含棉子糖系列寡糖或其含量極低的植物，在受到干旱、高鹽和低溫等逆境脅迫后，棉子糖系列寡糖會(huì)迅速積累，植株的抗逆性也隨之增強(qiáng)。

肌醇半乳糖苷合成酶是植物體內(nèi)棉子糖系列寡糖合成起始的關(guān)鍵酶，調(diào)控著植物體內(nèi)棉子糖系列寡糖的積累[2]。目前已有研究表明，GolS基因在一些植物受到逆境脅迫后表達(dá)量上升，從而參與響應(yīng)逆境脅迫，如水稻（Oryza sativa）2個(gè)GolS基因在干旱、鹽處理下的表達(dá)量大幅度上調(diào)，其中1個(gè)還可以積極響應(yīng)冷脅迫[3]。目前研究者已經(jīng)從擬南芥（Arabidopsis thaliana）中分離出7個(gè)GolS基因，其中AtGolS1、AtGolS2由干旱、鹽脅迫誘導(dǎo)，AtGolS2基因在擬南芥中的超表達(dá)提高了肌醇半乳糖苷、棉子糖的含量，并增強(qiáng)了植物的抗旱能力，而AtGolS3受到低溫脅迫誘導(dǎo)[4-5]?？Х龋–offea arabica）中有3個(gè)GolS類基因，CaGolS2的表達(dá)量在干旱、鹽脅迫下上調(diào)，CaGolS3的表達(dá)量在干旱脅迫下上調(diào)，而CaGolS1能夠參與調(diào)控植物響應(yīng)干旱、低溫及鹽脅迫[6]。在楊樹(shù)（Populus）的9個(gè)GolS基因中，PtrGolS2、PtrGolS8受到低溫脅迫的誘導(dǎo)，PtrGolS3、PtrGolS4和PtrGolS6受到鹽脅迫的誘導(dǎo)，而所有PtrGolS基因都參與到楊樹(shù)植株對(duì)干旱脅迫的應(yīng)答中[7-8]。木薯（Manihot esculenta）中有7個(gè)GolS類基因，其中MeGolS1、MeGolS5受到干旱誘導(dǎo)，表達(dá)量明顯上調(diào)，能更迅速地積極響應(yīng)干旱脅迫[9]。在甘藍(lán)型油菜[10-11]、小鹽芥[12]和日本黃連[13]等植物中也存在類似的生理現(xiàn)象?？梢?jiàn)GolS基因在植物抵抗干旱、寒冷等逆境脅迫中起到重要作用。

刺齒報(bào)春苣苔（Primulina spinulosa）是苦苣苔科（Gesneriaceae）報(bào)春苣苔屬多年生草本植物，其葉肉質(zhì)多汁，為我國(guó)廣西西南部所特有。目前，關(guān)于刺齒報(bào)春苣苔的報(bào)道甚少，主要研究集中在其離體快速繁殖方面[14]，而對(duì)其功能基因的研究未見(jiàn)報(bào)道。報(bào)春苣苔屬植物一般生長(zhǎng)于陰濕的石灰?guī)r巖壁上或洞穴中，而刺齒報(bào)春苣苔則生長(zhǎng)在陽(yáng)光直射、光禿裸露的石灰?guī)r縫隙中，屬于極端的耐旱種類。為了探討刺齒報(bào)春苣苔的耐旱機(jī)制，筆者對(duì)刺齒報(bào)春苣苔進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過(guò)同源序列搜索（BLAST）篩選獲得了刺齒報(bào)春苣苔的GolS基因序列，并對(duì)該基因序列及其編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行了分析，旨在為刺齒報(bào)春苣苔耐旱分子機(jī)制的研究提供參考。

1材料與方法

1.1材料

刺齒報(bào)春苣苔試驗(yàn)材料采自廣西扶綏縣渠黎鎮(zhèn)。采集同一居群的3～5個(gè)個(gè)體的頂端嫩葉（長(zhǎng)度<1 cm），采后迅速將其放入液氮中速凍保存。

1.2方法

1.2.1RNA的提取、建庫(kù)和測(cè)序用改良的TRIzol法對(duì)總RNA進(jìn)行提取[15]，由北京諾禾致源生物信息科技有限公司對(duì)檢測(cè)合格的RNA進(jìn)行建庫(kù)和測(cè)序。用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，隨后加入fragmentation buffer（片斷化緩沖液）將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物（randomhexamers）合成一鏈cDNA，然后加入緩沖液、dNTPs和DNA polymerase Ⅰ（DNA聚合酶Ⅰ）、RNase H（核糖核酸酶H）合成二鏈cDNA，再用AMPure XP beads純化雙鏈cDNA。將純化的雙鏈cDNA先進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測(cè)序接頭，再用AMPure XP beads進(jìn)行片段大小的選擇，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并用AMPure XP beads純化PCR產(chǎn)物，得到最終的文庫(kù)。文庫(kù)構(gòu)建完成后，先用Qubit 2.0進(jìn)行初步定量，稀釋文庫(kù)至1.5 ng/μL，隨后使用Agilent 2100對(duì)文庫(kù)的insert size（插入片段大?。┻M(jìn)行檢測(cè)，insert size符合預(yù)期后，使用Q-PCR（定量PCR）方法對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量（文庫(kù)的有效濃度應(yīng)>2 nmol/L），以保證文庫(kù)質(zhì)量。最后用IlluminaHiSeqTM 2500對(duì)制備好的文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2序列分析和系統(tǒng)樹(shù)構(gòu)建在GenBank公共數(shù)據(jù)庫(kù)中下載苦苣苔科旋蒴苣苔（Boea hygrometrica）的GolS基因（登錄號(hào)：FJ222452），使用Bioedit中的local BLAST功能，以測(cè)序獲得的刺齒報(bào)春苣苔轉(zhuǎn)錄組為搜索庫(kù)，找出刺齒報(bào)春苣苔的GolS類基因。用DNAman、Finder、TMPRED、SWISS-MODEL、NetPhos 2.0、SignaIP 4.1等軟件進(jìn)行序列的開(kāi)放閱讀框（ORF）、編碼氨基酸、編碼蛋白的理化性質(zhì)分析。將篩選到的刺齒報(bào)春苣苔GolS基因序列在GenBank中進(jìn)行BLAST搜索，找到與之高度相似的同源序列，并下載11種植物的同源序列，基于該基因翻譯的氨基酸序列，用DNAman軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建，構(gòu)建方法參考文獻(xiàn)[16]。

2結(jié)果與分析

2.1基因的生物信息學(xué)分析

在本研究測(cè)序獲得的P. spinulosa轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中（測(cè)序深度約為6G），筆者只篩選到1個(gè)GolS基因，該基因序列全長(zhǎng)1 347 bp（GenBank登錄號(hào)為MG521418），使用美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站上的NCBI ORF Finder和生物信息學(xué)軟件DNAman對(duì)該基因序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明，該序列包含1個(gè)1 008 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼335個(gè)氨基酸。

2.2編碼蛋白質(zhì)的分析和疏水性預(yù)測(cè)

通過(guò)DNAman軟件分析得出，本研究中GolS基因編碼的蛋白質(zhì)分子量為38.05 ku， 等電點(diǎn)（pI）為5.09。從蛋白質(zhì)序列的疏水性分析結(jié)果可以看出，GolS基因編碼的肽鏈中疏水值最大約為3.66，最小值約為-2.86，平均值是-0.18，屬于親水性蛋白。

用在線分析軟件（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）進(jìn)行分析可知，該蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的氨基酸[天冬氨酸（Asp）+谷氨酸（Glu）]總數(shù)為41個(gè)，帶正電荷的氨基酸[精氨酸（Arg）+賴氨酸（Lys）]總數(shù)為29個(gè)，分子式為C1 733H2 618N434O498S17，不穩(wěn)定系數(shù)為 36.65，屬于穩(wěn)定性蛋白質(zhì)。

2.3功能結(jié)構(gòu)域的分析

將編碼的氨基酸序列用NCBI的Conserved Domain Architecture Retrieval Tool進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)具有1個(gè)與糖基轉(zhuǎn)移酶家族（glycosyltransferases superfamily）蛋白相同的保守活性位點(diǎn)[JP3]（conserved active sites，簡(jiǎn)稱CAS）結(jié)構(gòu)域。

2.4跨膜預(yù)測(cè)

用跨膜蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)TMbase（http：//ch.embnet.org/software/TMPRED_form. html）預(yù)測(cè)GolS蛋白的跨膜區(qū)域。從可以看出，該蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)蛋白，為膜內(nèi)蛋白。

2.5蛋白質(zhì)的磷酸化預(yù)測(cè)

通過(guò)在線蛋白磷酸化位點(diǎn)分析軟件NetPhos 2.0 Server對(duì)GolS基因編碼的蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，該多肽鏈中預(yù)測(cè)分值在0.5以上的可能的磷酸化位點(diǎn)共有13個(gè)。其中，絲氨酸（Ser）可能的磷酸化位點(diǎn)共有3個(gè)，分別位于肽鏈的18、22、203位;蘇氨酸（Thr）可能的磷酸化位點(diǎn)共有3個(gè)，分別位于肽鏈的218、276、335位;酪氨酸（Tyr）可能的磷酸化位點(diǎn)共有7個(gè)，分別位于肽鏈的42、105、125、190、205、234、298位。

2.6糖基化位點(diǎn)和信號(hào)肽的分析

采用NetNGlyc 1.0對(duì)GolS基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有2個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，但是糖基化一般發(fā)生在信號(hào)受體蛋白分子上，而用SignaIP 4.1軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示其沒(méi)有信號(hào)肽，說(shuō)明在體內(nèi)這些預(yù)測(cè)的潛在的N-糖基化位點(diǎn)可能不能真正地被糖基化。

2.7蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

用SOPMA軟件對(duì)GolS蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，如圖6所示，α-螺旋約占37.91%，延伸直鏈約占23.58%，β-轉(zhuǎn)角約占10.15%，無(wú)規(guī)則卷曲約占28.36%，其中α-螺旋為主要結(jié)構(gòu)。

利用SWISS-Model對(duì)刺齒報(bào)春苣苔GolS蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，GolS蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)含有8個(gè)α-螺旋，6個(gè)β-折疊，其間由無(wú)規(guī)則卷曲連接。

2.8系統(tǒng)發(fā)育分析

刺齒報(bào)春苣苔GolS基因編碼的氨基酸與旋蒴苣苔（Boea hygrometrica，登錄號(hào)：FJ222452）GolS基因編碼的氨基酸序列的相似性為90%，在系統(tǒng)樹(shù)上聚為1支。

3討論

已有報(bào)道顯示，旋蒴苣苔中的GolS基因響應(yīng)干旱脅迫，旋蒴苣苔肌醇半乳糖苷合成酶基因BhGolS1的啟動(dòng)子上含有4個(gè)與WRKY轉(zhuǎn)錄因子特異結(jié)合的順式作用元件W-box，已證實(shí)該元件是旋蒴苣苔響應(yīng)干旱脅迫的關(guān)鍵因子[17]。在對(duì)旋蒴苣苔的研究中發(fā)現(xiàn)，WRKY轉(zhuǎn)錄因子是通過(guò)ABA（脫落酸）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來(lái)調(diào)控BhGolS1的表達(dá)以響應(yīng)干旱脅迫的，而[CM（25]且擬南芥中的AtGolS1、AtGolS2[4]和毛果楊中的PtrGolS2、PtrGolS5-7[8]均被證明是受ABA誘導(dǎo)的。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的刺齒報(bào)春苣苔GolS基因和已知的與抗旱相關(guān)的旋蒴苣苔GolS基因的相似性很高，推測(cè)其可能在刺齒報(bào)春苣苔耐旱過(guò)程中起重要作用，但是其作用機(jī)制是否與旋蒴苣苔相似，也受到轉(zhuǎn)錄因子WRKY的調(diào)控，因此可見(jiàn)參與ABA依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑需要深入研究。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中的GolS基因受到了2類轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，熱激因子（HSFs）可以激活A(yù)tGolS1的表達(dá)[18]，DREB1A/CBF3可以激活A(yù)tGolS3的表達(dá)和增強(qiáng)抗旱耐凍性[4]。至于刺齒報(bào)春苣苔的GolS基因否也受到不同轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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