吳曉霞 劉洋 謝建生

(深圳市婦幼保健院 產(chǎn)前診斷中心，廣東 深圳 518000)

近幾年來(lái)染色體微陣列技術(shù)(chromosome microarray analysis，CMA)已廣泛應(yīng)用于存在超聲結(jié)構(gòu)異常的孕婦的產(chǎn)前遺傳學(xué)診斷中，與傳統(tǒng)染色體核型相比，CMA技術(shù)可提高約6%的異常檢出率[1]。目前，CMA技術(shù)已是一種廣泛應(yīng)用于臨床的用于檢測(cè)染色體拷貝數(shù)變異(copy number variants，CNV)的工具。對(duì)于需要進(jìn)行有創(chuàng)產(chǎn)前診斷但不存在超聲結(jié)構(gòu)異常的孕婦，CMA技術(shù)是否可以作為一種常規(guī)檢測(cè)技術(shù)目前尚無(wú)統(tǒng)一意見(jiàn)[2]。2016年美國(guó)婦產(chǎn)科學(xué)會(huì)和胎兒醫(yī)學(xué)會(huì)發(fā)表指南認(rèn)為對(duì)于選擇進(jìn)行侵入性產(chǎn)前診斷且不存在超聲結(jié)構(gòu)異常的孕婦，染色體核型分析或CMA技術(shù)可二選其一[3]。目前大樣本研究發(fā)現(xiàn)，在因高齡、血清學(xué)篩查異常或焦慮而選擇有創(chuàng)產(chǎn)前診斷的孕婦中，當(dāng)染色體核型分析無(wú)異常發(fā)現(xiàn)時(shí)，通過(guò)CMA技術(shù)可額外檢出1%～1.7%的有臨床意義的CNV[4, 5]。目前國(guó)內(nèi)尚缺乏關(guān)于在超聲結(jié)構(gòu)正常的胎兒中具有臨床意義的CNV的檢出率的相關(guān)數(shù)據(jù)發(fā)表。

本次研究將單純因高齡因素選擇有創(chuàng)產(chǎn)前診斷的孕婦作為研究對(duì)象，在排除了常見(jiàn)染色體非整倍體異常后使用CMA技術(shù)對(duì)孕婦羊水標(biāo)本進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)CNV的檢出率并分析主要異常類型，為產(chǎn)前遺傳咨詢提供客觀數(shù)據(jù)做參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2017年1月至2018年6月于深圳市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心就診的因高齡因素而選擇有創(chuàng)產(chǎn)前診斷的孕婦213例作為研究對(duì)象。

1.2 研究方法 在簽署知情同意書(shū)后，對(duì)213例孕婦進(jìn)行羊膜腔穿刺術(shù)收集羊水標(biāo)本30ml。對(duì)羊水標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行染色體核型分析和染色體微陣列分析。

1.2.1 染色體核型分析 使用每例孕婦的20ml羊水標(biāo)本進(jìn)行羊水細(xì)胞培養(yǎng)、中期染色體核型制備及G顯帶染色體核型分析。

1.2.2 染色體微陣列分析 使用10ml未經(jīng)培養(yǎng)的羊水標(biāo)本進(jìn)行DNA提取。全基因組DNA提取采用QIAamp? DNA Blood Mini Kit(Qiagen Valencia, CA)。提取的DNA通過(guò)質(zhì)檢后，使用AffymetrixCytoScan 750K芯片平臺(tái)對(duì)213例羊水DNA進(jìn)行全基因組拷貝數(shù)變異分析。

2 結(jié)果

2.1 染色體核型分析 213例羊水標(biāo)本中經(jīng)染色體核型分析共發(fā)現(xiàn)5例異常，見(jiàn)表1。

表1 5例染色體核型異常結(jié)果

2.2 染色體微陣列分析 染色體核型分析發(fā)現(xiàn)的5例異常經(jīng)CMA分析同樣均發(fā)現(xiàn)異常。在208例染色體核型分析結(jié)果正常的羊水標(biāo)本中經(jīng)CMA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)4例有臨床意義的CNV，包括致病性CNV和可能致病性CNV，占比約1.9%；發(fā)現(xiàn)4例臨床意義未明CNV(variants of uncertain significance，VUS)，占比約1.9%。本實(shí)驗(yàn)室CMA數(shù)據(jù)分析主要參考數(shù)據(jù)庫(kù)為：Decipher、DGV、ClinVar和clingen。

共發(fā)現(xiàn)4例致病或可能致病性CNV。分別為1例Xp22.31缺失1.492Mb，1例16p11.2重復(fù)599kb，2例1q21.1重復(fù)(379kb、371kb)(表2)。Xp22.31缺失區(qū)域包含STS基因，該區(qū)域缺失可導(dǎo)致X連鎖魚(yú)鱗病(OMIM：#308100)，呈X連鎖隱性遺傳。主要表現(xiàn)為四肢、面、頸、軀干、臀部大面積鱗屑，部分患者并發(fā)角膜混濁、性器官發(fā)育異常[6]。16p11.2區(qū)域微重復(fù)可導(dǎo)致16p11.2重復(fù)綜合征(OMIM：#614671)，該綜合征常見(jiàn)臨床表現(xiàn)有特殊面容、智力障礙、語(yǔ)音發(fā)育落后、認(rèn)知功能障礙、孤獨(dú)癥譜系障礙等[7]。1q21.1區(qū)域重復(fù)常見(jiàn)的臨床表觀有發(fā)育遲緩、智力障礙、特殊面容、腦部異常等[8]。上述16p11.2及1q21.1區(qū)域重復(fù)導(dǎo)致的疾病均存在外顯不全現(xiàn)象及表現(xiàn)度差異，因此在產(chǎn)前階段無(wú)法預(yù)測(cè)胎兒出生后是否會(huì)出現(xiàn)相關(guān)臨床表現(xiàn)。

4例VUS在本院數(shù)據(jù)庫(kù)和在線數(shù)據(jù)庫(kù)中均無(wú)明確致病定義(表3)。

表2 4例致病性CNV結(jié)果

表3 4例VUS結(jié)果

3 討論

基因組拷貝數(shù)變異(CNV)是指基因組DNA中1kb以上的結(jié)構(gòu)變異，包括缺失、重復(fù)等，而通過(guò)常規(guī)的染色體核型分析技術(shù)無(wú)法分辨的亞顯微結(jié)構(gòu)的改變[9]。目前已知在產(chǎn)前存在超聲結(jié)構(gòu)異常的胎兒中，CNV的發(fā)生率約為6%，因此超聲結(jié)構(gòu)異常已成為致病性CNV的一項(xiàng)高危因素[1]。由于胎兒CNV的發(fā)生與孕婦年齡無(wú)相關(guān)性，因此評(píng)估高齡孕婦人群中CNV的發(fā)生率及類型也可用來(lái)反映普通低危孕婦人群中胎兒CNV的發(fā)生率及類型[10-12]。本次研究共收集了213例高齡孕婦羊水標(biāo)本，經(jīng)羊水染色體核型分析共發(fā)現(xiàn)5例異常，上述5例異常均被CMA檢出。在余下208例染色體核型分析正常的羊水標(biāo)本中，經(jīng)CMA檢測(cè)共發(fā)現(xiàn)8例異常，其中4例為具有臨床意義的CNV，包括2例致病性CNV，2例可能致病性CNV，占比約1.9%；4例為臨床意義未明結(jié)果，占比約1.9%。Wapner RJ 等人[1]研究發(fā)現(xiàn)，在因高齡、焦慮、血清學(xué)篩查異常而進(jìn)行有創(chuàng)產(chǎn)前診斷的孕婦中，與傳統(tǒng)染色體核型分析相比CMA技術(shù)可提高1.7%的陽(yáng)性檢出率。2017年Srebniak MI等人[10]收集了10項(xiàng)大樣本研究共10614例胎兒樣本進(jìn)行meta分析，結(jié)果提示在高齡和焦慮孕婦中，CMA可檢出約0.84%的具有臨床意義的CNV。在本次研究中，CMA技術(shù)在染色體核型分析正常標(biāo)本中共檢出1.9%的具有臨床意義的CNV。異常檢出率與Wapner RJ 等人的研究結(jié)果相近。

本次研究提示在國(guó)內(nèi)高齡孕婦人群中，有臨床意義的CNV的發(fā)生率約為1.9%，發(fā)生率要高于非高齡孕婦人群中21-三體綜合征的發(fā)生率。由于CNV的發(fā)生于孕婦年齡無(wú)相關(guān)性，因此本次研究的數(shù)據(jù)也可用以反映普通低危孕婦人群中CNV的發(fā)生率。對(duì)于21-三體目前已經(jīng)有行之有效的篩查方法，而對(duì)于致病性CNV雖然在普通低危孕婦人群中發(fā)生率要高于唐氏綜合征，但目前除了NIPT之外尚沒(méi)有有效的篩查方法，且尚沒(méi)有任何機(jī)構(gòu)推薦將NIPT作為常規(guī)的篩查染色體微缺失微重復(fù)的方法[13-16]。由于有臨床意義的CNV的發(fā)生率并不低且沒(méi)有有效的篩查方法，因此我們認(rèn)為臨床醫(yī)師應(yīng)告知孕婦致病性CNV的群體發(fā)病率，并告知孕婦CMA技術(shù)可有效檢出上述異常，但會(huì)附帶檢出一定比例的臨床意義未明CNV。對(duì)于臨床意義未明CNV，目前仍然給臨床醫(yī)師和孕婦帶來(lái)了極大的困擾，因此在產(chǎn)前診斷過(guò)程中我們希望盡量減少該類結(jié)果的報(bào)告[17-18]。為了達(dá)到這一目的，需要大量臨床數(shù)據(jù)的積累過(guò)程。2012年，Wapner RJ 等人報(bào)道臨床意義未明CNV的發(fā)生率約為2.5%，而2015年，同樣是Wapner RJ團(tuán)隊(duì)發(fā)表文章表示，他們已將產(chǎn)前臨床意義未明CNV的報(bào)告率降至0.9%[1, 4]。本次研究中，臨床意義未明CNV的報(bào)告率為1.9%，高于0.9%，提示我們還需更多臨床數(shù)據(jù)的積累和對(duì)CNV結(jié)果解讀的經(jīng)驗(yàn)積累。

通過(guò)本次研究發(fā)現(xiàn)，在高齡孕婦人群中，具有臨床意義的CNV發(fā)生率為1.9%，比例高于普通人群中21-三體的發(fā)生率。由于CNV的發(fā)生率與孕婦年齡無(wú)相關(guān)性，因此高齡孕婦中CNV的發(fā)生率和類型可以反映出普通低危妊娠人群CNV的發(fā)生率和類型?；谝陨涎芯拷Y(jié)果我們認(rèn)為，在對(duì)所有選擇有創(chuàng)產(chǎn)前診斷的孕婦中，即使胎兒不存在超聲結(jié)構(gòu)畸形，臨床醫(yī)師也應(yīng)告知孕婦低危人群中有臨床意義CNV的發(fā)生率，并提供CMA技術(shù)供孕婦選擇。