趙鶴庭，嚴(yán)紅亞，何輝，羅文華，字吉祥，常志順*，信愛國*

(1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院 養(yǎng)禽與禽病研究所,云南 昆明 650224；2.洱源縣動物疫病預(yù)防控制中心,云南 洱源 671200； 3.蒙自市文瀾鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，云南 蒙自 661100； 4.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650201)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus, SA)是一種常見的需氧或兼性厭氧革蘭氏陽性條件性病原菌，廣泛存在于環(huán)境中、健康動物及家禽的皮膚和羽毛上。雞感染金黃色葡萄球菌臨床大多表現(xiàn)出化膿性關(guān)節(jié)炎、皮炎、骨膜炎等特征，有些雞群感染后臨床特征不明顯。近年來，禽葡萄球菌病的發(fā)生有上升的趨勢[1、2]。 流行病學(xué)調(diào)查顯示，金黃色葡萄球菌能夠感染從雞胚到成年雞各個階段的雞群，造成雞關(guān)節(jié)炎、癱瘓甚至死亡[3]。 在雨季和潮濕季節(jié)發(fā)病較多，尤以8—11月為高發(fā)期，發(fā)病率與死亡率因雞群的飼養(yǎng)管理狀況、環(huán)境條件及治療措施是否得當(dāng)而有較大差異[4、5]。本文對2019 年2月送檢的臨床疑似葡萄球菌感染的蛋雞通過臨床癥狀和病理剖檢，采集組織樣品進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，確診為致病性金黃色葡萄球菌感染。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2019年2月，云南某養(yǎng)雞場送檢蛋雞，發(fā)病雞群主要表現(xiàn)為產(chǎn)蛋率下降，食欲減退至廢絕，跛行。通過解剖、采集樣品進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。

1.2 主要試劑

細(xì)菌總DNA提取試劑盒、DNA marker DL2000購自天根生物科技(北京)有限公司； 2×EasyPfu PCR SuperMix試劑購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。普通營養(yǎng)瓊脂和血瓊脂培養(yǎng)基等按常規(guī)法制備；抗生素藥敏紙片、革蘭氏染液、細(xì)菌微量生化反應(yīng)管購自(杭州)天和微生物試劑有限公司。

1.3 細(xì)菌分離鑒定

病死雞解剖后，接種環(huán)無菌采集肝臟、骨髓等病變器官涂布于血瓊脂和普通營養(yǎng)瓊脂平板，37℃恒溫培養(yǎng)16～24h后，挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢，觀察細(xì)菌形態(tài)。對分離菌株進(jìn)行單菌落劃線培養(yǎng)純化后，對分離菌株進(jìn)行生理生化鑒定[6]。

1.4 分離菌的PCR鑒定

按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書，提取分離菌基因組DNA。根據(jù)細(xì)菌16S rDNA 鑒定菌株的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，將細(xì)菌16S rDNA分成3段首尾重疊片段進(jìn)行擴(kuò)增，片段1(引物對16S-27F /16S-519R)預(yù)計擴(kuò)增片段500bp，片段2(引物對16S-357F /16S-1115R)預(yù)計擴(kuò)增片段750bp，片段3(引物對16S-926F /16S-1492R)預(yù)計擴(kuò)增片段560 bp。根據(jù)金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因nuc合成引物 nucF/nucR[7]，預(yù)計擴(kuò)增 478bp 片段。引物序列見表 1，由昆明碩擎生物有限公司合成。 PCR反應(yīng)體系為25μL，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，55℃時退火30s，72℃延伸45s，35個循環(huán)；最后72℃延伸7min；4℃保存。取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像分析儀觀察結(jié)果。16S rDNA的3個擴(kuò)增片段送測序，采用Vecter NTI 軟件拼接，得到大約1500bp的細(xì)菌16S rDNA序列。將序列提交GenBank進(jìn)行Blast比對，確定細(xì)菌的種屬分類。

表1 PCR 擴(kuò)增引物序列信息表

2 結(jié)果

2.1 剖檢變化

胸、腿部皮下出血；關(guān)節(jié)腫脹，按壓有波動感，關(guān)節(jié)囊內(nèi)有漿液性滲出物(圖1)；部分病禽股骨頭壞死(圖2)。

圖1 關(guān)節(jié)炎性滲出

圖2 股骨頭壞死

2.2 分離菌形態(tài)特征及生化試驗(yàn)結(jié)果

通過細(xì)菌分離及單菌落純化，得到的細(xì)菌在普通瓊脂平板上形成表面光滑、濕潤、隆起的卵圓形菌落，初期呈灰白色，繼而菌落逐漸變?yōu)榻瘘S色(圖3)。菌株在血瓊脂平板上形成較大菌落，在菌落周圍產(chǎn)生明顯的β溶血(圖4)。革蘭氏染色呈現(xiàn)藍(lán)紫色，無芽孢、葡萄狀菌落(圖5)。分離菌發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、丙酮酸，產(chǎn)酸；凝固酶、耐熱核酸酶、透明質(zhì)酸酶陽性；分離菌符合葡萄球菌屬的生化培養(yǎng)特征，初步判斷為金黃色葡萄球菌。

圖3 分離菌在普通瓊脂平板上的形態(tài)

圖 4 分離菌在血瓊脂平板上形成β溶血

圖5 分離細(xì)菌革蘭氏染色結(jié)果

2.3 分離菌株P(guān)CR檢測及16S rDNA擴(kuò)增結(jié)果

提取分離菌株基因組DNA，用引物對nucF/nucR檢測金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因，結(jié)果獲得預(yù)期478bp片段，對照沙門菌和大腸桿菌未見擴(kuò)增產(chǎn)物(圖6)。分離菌16S rDNA分3段擴(kuò)增，分別獲得預(yù)期的500bp、750bp和560bp 擴(kuò)增產(chǎn)物(圖7)，PCR產(chǎn)物凝膠純化后，進(jìn)行雙向測序。

M：分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1：金黃色葡萄球菌nuc基因檢測結(jié)果；2：禽沙門菌對照；3：大腸桿菌對照

圖6金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因檢測結(jié)果

M：分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1-3：分離菌16S rDNA片段1、2和片段3擴(kuò)增產(chǎn)物

圖7分離菌16Sr DNA 3個片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.4 分離菌16S rDNA序列比對鑒定與分類結(jié)果

利用Vector NTI 軟件將上述3個片段核酸序列拼接，獲得分離菌株16S rDNA核酸序列1495bp。將分離菌16S rDNA核酸序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對分析，結(jié)果顯示分離菌株屬于金黃色葡萄球菌。

2.5 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

對17種藥物的敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌株對頭孢氨芐、恩諾沙星、妥布霉素、頭孢他啶、慶大霉素、左氟沙星和卡那霉素敏感，對環(huán)丙沙星、新霉素和阿米卡星等3種藥物中度敏感，對阿莫西林、四環(huán)素、青霉素G、氯霉素、復(fù)方新諾明和氨芐西林具有耐藥性(見表2)。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

注：S：敏感；R：耐藥；I：中度敏感

3 討論

金黃色葡萄球菌感染是導(dǎo)致人及多種動物皮膚與軟組織感染、壞死性肺炎、敗血性關(guān)節(jié)炎、血管內(nèi)感染、心內(nèi)膜炎的病原之一[8]，是一種重要的人畜共患性病原菌。主要導(dǎo)致感染家禽“跛足病”、臍炎等臨床癥狀，對養(yǎng)禽業(yè)危害嚴(yán)重。本研究從云南蛋雞中分離出金黃色葡萄球菌，提示該菌在產(chǎn)蛋雞群中存在，科學(xué)防治金黃色葡萄球菌感染對保障動物源性食品安全具有重要的獸醫(yī)公共衛(wèi)生意義。

對雞葡萄球菌病的診斷，根據(jù)臨床病理剖檢和鏡檢到葡萄串狀的球菌不足以確診，需要通過細(xì)菌分離、生化試驗(yàn)及PCR等進(jìn)行確診。本研究測定了分離菌的16S rDNA核酸序列，進(jìn)行比對確定分離菌的種屬分類。16S rDNA序列具有細(xì)菌屬、種的特征，作為新的分子分類技術(shù)方法，已成為細(xì)菌分類和鑒定的新方法。此外，由于葡萄球菌容易產(chǎn)生耐藥性，臨床上金黃色葡萄球菌多重耐藥菌株大量出現(xiàn)。 本次分離菌株對阿莫西林、四環(huán)素、青霉素、氯霉素、復(fù)方新諾明和氨芐西林具有明顯耐藥性，分離結(jié)果對該病防治具有重要的臨床指導(dǎo)意義。

金黃色葡萄球菌大量存在于自然環(huán)境中，特別是禽舍糞便中的金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生氣溶膠，通過禽舍間的通風(fēng)裝置互相傳播，對周圍空氣造成污染[9]。因此，養(yǎng)殖場應(yīng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，嚴(yán)格執(zhí)行生物安全防控措施，做好養(yǎng)殖場的清潔衛(wèi)生和消毒工作，盡量減少各種應(yīng)激因素；一旦發(fā)現(xiàn)雞群有外傷時，要及時進(jìn)行處理，減少疾病傳播；嚴(yán)格淘汰感染動物等綜合技術(shù)手段。國內(nèi)有報道在20～25日齡接種禽葡萄球菌油乳劑苗和氫氧化鋁菌苗進(jìn)行免疫預(yù)防[8]，對云南蛋雞場防控禽葡萄球菌感染具有借鑒意義。